張芷毓，歐德瓊，鄔明麗，樊英智，高源，李世鵬，賴振雨，雷初朝，黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌712100)

TRAF6(TNF receptor associated factor 6)基因，是腫瘤壞死因子超家族(TNF)、Toll樣受體家族(TRLs)和白細胞介素1受體超家族(TIR)信號通路調(diào)控途徑中關鍵接頭分子，是天然免疫信號通路的重要接頭分子[1]。與此基因相關的功能包括功能性破骨細胞的形成與分化，和骨肉瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲，一些研究已經(jīng)強調(diào)該基因?qū)π∈蟮某錾昂统錾蟠婊盥实闹匾绊?，在TRAF6基因中誘導突變時，突變純合的小鼠在出生時表型正常，但卻過早地死于骨硬化，少數(shù)存活動物的體重也比健康動物減少20%～30%，體長也較短。這一證據(jù)表明，TRAF6基因可以參與牛早期發(fā)育階段的調(diào)節(jié)，因此可以對牛的性狀產(chǎn)生影響。位于該區(qū)域的數(shù)量性狀位點與荷斯坦牛的產(chǎn)犢和Balman牛的日增重(ADG)相關[3]。

已知TRAF6基因可以在多種動物的多種類型細胞中表達，TRAF6的表達產(chǎn)物，腫瘤壞死因子受體相關因子6，是天然免疫信號通路中重要的接頭分子。研究表明，人和模式生物小鼠等動物的TRAF6可調(diào)節(jié)多種細胞信號通路[4-5]。在免疫應答，炎癥反應，應激反應和細胞分化與凋亡等生物學過程中起著重要作用[6-8]。目前對TRAF6的功能研究多見于人，小鼠，家禽及水生動物，這些研究表明TRAF6除具有抗病毒功能之外，可能還參與針對多種類型疾病的免疫應答，其中某些突變型還與類風濕性關節(jié)炎的誘發(fā)有關[9]。牛TRAF6基因位于15號染色體上，含有七個外顯子，編碼902個氨基酸，目前關于牛TRAF6基因多態(tài)性及抗病毒活性的研究主要集中在國外具有代表性的牛品種上。目前，對于TRAF6基因在各種動物中發(fā)揮的各種不同功能的研究尚在不斷進行中，例如是否對豬的偽狂犬病病毒存在抑制效應等[2]。本試驗旨在通過分析陜西地區(qū)秦川牛TRAF6基因的多態(tài)性，為下一步調(diào)查其多態(tài)性與牛體尺的關聯(lián)性奠定基礎，也為將來TRAF6基因在肉?？共∮N中的應用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣的采集 從陜西省秦川牛場、陜西省秦川牛良種繁育中心隨機選取年齡、胎次及產(chǎn)犢時間相近；放牧、飼養(yǎng)和管理條件相同的健康秦川牛254頭，從牛頸靜脈采血20～40 mL/頭，加ACD抗凝劑2 mL(V(ACD):V(血液)=1:6)，置于冰壺中帶回，-80℃保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 蛋白酶K購自德國默克公司；含染料Reaction MIX、DNA Marker、去離子水；Tris飽和酚、EDTA、Tris、甲醛、硼酸、丙烯酰胺、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨、Temed、二甲基亞砜(DMSO)、N,N,N,N-四甲基乙二胺；十二烷基磺酸鈉(SDS)、去離子甲酰胺、瓊脂粉；HincⅡ酶。

紫外分光光度計、冷凍高速離心機(CENTURION，英國)、PCR儀、電泳槽、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、脫色搖床、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 秦川牛體尺及肉質(zhì)性狀的測量

實地測量所采血樣秦川牛生長性狀數(shù)據(jù)(體高、胸圍、胸寬、胸深、腰高、體重、十字部高、體斜長、臂長、腰角寬、腹圍)。

1.3 秦川牛基因組DNA的提取

采用傳統(tǒng)的酚氯仿抽取法提取秦川牛的基因組DNA，提取后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，用紫外分光光度計測定DNA樣品的濃度，檢測完畢后，取一定量的DNA樣品稀釋至50 ng/μL，保存于﹣20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 秦川牛TRAF6基因的PCR-RFLP分析

1.4.1 引物的設計與合成 參照GenBank提供的牛TRAF6基因序列(NC_007313)，利用primer 5.0軟件設計引物，引物由上海生工Sangon Biotech公司提供，引物信息見表1。

表1 牛TRAF6基因的引物信息

1.4.2 TRAF6基因的PCR擴增 PCR反應體系12.5 μL：6.25 μL康維Mix(包括PCR穩(wěn)定劑和增強劑、Mg2+、dNTPs、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer)，4.75 μL ddH2O，0.5 μL上游引物F，0.5 μL下游引物R，0.5 μL DNA(50 ng·μL-1)。

PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，36個循環(huán)；最后在72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳30 min檢測。

1.4.3 PCR產(chǎn)物測序 隨機選取30個秦川牛DNA樣本，每個樣本取樣2 μL，用移液器輕輕吸打混合均勻，構(gòu)建DNA混池進行PCR擴增，PCR反應體系25 μL：12.5 μL康維Mix(包括PCR穩(wěn)定劑和增強劑、Mg2+、dNTPs、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer)，9.5 μL ddH2O，1μL上游引物F，1 μL下游引物R，1 μL DNA(50 ng·μL-1)。擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結(jié)果使用SeqMan進行對比尋找突變位點。

1.4.4 PCR產(chǎn)物酶切及PCR-RFLP檢測 酶切體系10.1 μL:TRAF6基因的PCR擴增產(chǎn)物5 μL、10×Buffer 1 μL、ddH2O 4 μL、限制性核酸內(nèi)切酶HincⅡ0.1 μL。該酶切反應體系在37℃恒溫箱中酶切4 h。取酶切產(chǎn)物2.5 μL，12%聚丙烯酰胺凝膠在 120 V電泳1.5 h。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

ym=μ+Markerm+em

式中，ym為個體表型值，μ為群體均值，Markerm是標記基因型效應，em為隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域的PCR擴增結(jié)果

利用合成引物擴增樣本牛TRAF6基因突變區(qū)域，所得PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳30min檢測。如圖1顯示，擴增片段與目的片段一致，且條帶清晰、特異性好，可直接用于后期的DNA測序。

圖1 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域的PCR擴增結(jié)果

2.2 秦川牛TRAF6基因的測序及測序結(jié)果分析

使用SeqMan軟件，分析秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一個多態(tài)位點，見圖2。對比分析結(jié)果表明：第六內(nèi)含子17628 bp處發(fā)生由T到C的突變，將其命名為T17628C(B)。分析表明，B位點存在2種基因型TT和TC。由于該處突變發(fā)生在TRAF6基因的第六內(nèi)含子區(qū)域，故未引起相應氨基酸的突變。

TC型

2.3 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域PCR-RFLP分析

PCR-RFLP分析結(jié)果表明，秦川牛TRAF6基因第六內(nèi)含子區(qū)域存在TT、TC兩種基因型，如圖3顯示，序列經(jīng)酶切后應存在三條條帶，但因為其中一條帶較短只有38 bp，故電泳圖譜上僅能體現(xiàn)其中較長的兩條。HincⅡ酶切位點如圖4顯示。

圖3 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域PCR-RFLP電泳圖

圖4 HincⅡ酶切位點

2.4 秦川牛TRAF6基因突變區(qū)域遺傳多樣性分析

如表2顯示，從群體遺傳學角度分析秦川牛TRAF6基因各突變位點的基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量等遺傳指標。χ2結(jié)果表明，B位點 TT是優(yōu)勢基因型，T為優(yōu)勢等位基因，位點處于低度多態(tài)狀態(tài)。檢驗表明，P﹥0.05，B位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 秦川牛TRAF6基因B位點突變的遺傳多樣性

注：括號中的數(shù)據(jù)表示檢測個體數(shù)。

2.5 秦川牛TRAF6基因突變位點不同基因型與體尺的關聯(lián)性分析

如表3顯示，運用SPSS(22.0)軟件分析169頭秦川牛不同基因型與體高、胸圍、胸寬、胸深、腰高、體重、十字部高、體斜長、臂長、腰角寬、腹圍的相關性。

由表3可知，TRAF6基因B位點不同基因型在體高、胸圍、胸寬、腰高、體重、十字部高、體斜長、臂長、腰角寬、腹圍方面無顯著性差異，TT基因型的個體均值均高于TC基因型的個體均值，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。T檢驗結(jié)果顯示B位點不同基因型在腰高、十字部高、體斜長的P值分別為0.066、0.077、0.063，均大于0.05，在一般公認的統(tǒng)計意義上不顯著，但非常接近顯著。

表3 秦川牛TRAF6基因各突變位點不同基因型與體尺性狀的關聯(lián)性分析

注：表中數(shù)值為平均值±標準誤；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

3.討論

TRAF6基因不僅存在于脊椎動物中，比如豬牛等禽畜，也存在于許多非脊椎動物如青蛤[12]中，以及半滑舌鰨等魚類[2.11]。說明TRAF6基因分布廣泛，對機體生存具有重要作用。目前對于TRAF6基因的研究主要集中在其表達情況對于人類疾病的影響，關于其對禽畜健康及生長性能的影響的研究報道較少，且集中在對其編碼區(qū)的克隆及序列分析工作，及其對密碼子使用的偏好分析等工作上。已知牛TRAF6基因分別含有7個外顯子與6個內(nèi)含子，而人TRAF6基因有 2 個轉(zhuǎn)錄突變體(NM_145803.2)(NM_004620.3)與基因組DNA(NC_000011.10)發(fā)現(xiàn)所對應的 DNA分別含有 8個外顯子和 7個內(nèi)含子，可見牛和人TRAF6基因的基因結(jié)構(gòu)存在較大差異，不可一概而論[4.8]。

針對TRAF6基因外顯子設計引物，擴增產(chǎn)物通過PCR-RFLP檢測分析，均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，而擴增TRAF6基因內(nèi)含子的TRAF6-4擴增片段在第6內(nèi)含子17628bp處檢測到T→C突變，可分為TT、TC兩種基因型。該TRAF6基因多態(tài)性位點處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，說明該群體在環(huán)境選擇、人工選育等因素的影響下，其遺傳結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變，處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)。

本研究運用PCR-RELP方法，首次對秦川牛5’調(diào)控區(qū)，CDS區(qū)及部分突變頻率高的內(nèi)含子區(qū)域進行SNP篩查，利用PCR-RFLP技術在突變位點附近發(fā)現(xiàn)HincⅡ-RFLP酶切位點，使用HincⅡ酶對擴增條帶進行切割，當此位點的T突變?yōu)镃時可被HincⅡ酶切開，利用電泳技術可進行分型。突變位點多態(tài)性較豐富，關聯(lián)分析顯示該位點的雜合突變對牛體尺及體重等生長性狀存在影響，因此可以作為遺傳標記輔助選擇的參考。

4 結(jié)論

陜西地區(qū)秦川牛的TRAF6基因存在較豐富的遺傳多態(tài)性，在第六內(nèi)含子17628 bp處檢測到了SNP位點，形成兩種基因型，可能作為一種遺傳標記作為輔助選擇的參考，對指導肉牛的育種工作具有實踐意義。