王亞芳，成海建，張清峰，姜富貴，譚秀文，劉倚帆，宋恩亮*

(1.山東師范大學(xué)生物學(xué)院，山東濟(jì)南 250000；2.山東省家畜繁育與疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；3.山東省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心,山東濟(jì)南 250100；4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100)

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等中醫(yī)功效[2-3]。黃芪中包括皂苷類、黃酮類和多糖類等多種化學(xué)成分，而黃芪甲苷是現(xiàn)在研究較多的活性成分之一。黃芪甲苷屬于四環(huán)三萜類皂苷，分子式為C41H68O14，相對(duì)分子質(zhì)量為784.97，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 1[4]。黃芪甲苷具有抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等多種生物功能[5-6]。近年來(lái)，黃芪甲苷對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用成為研究熱點(diǎn)，包括對(duì)上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等凋亡的抑制作用及機(jī)制。

上皮細(xì)胞是位于皮膚或腔道表層的細(xì)胞，在人或者動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，其中被覆上皮分布在表皮、內(nèi)皮、間皮及呼吸、消化與泌尿生殖道粘膜上皮；腺上皮分布于外分泌和內(nèi)分泌腺細(xì)胞；感覺(jué)上皮分布于聽(tīng)、視、平衡、嗅與味覺(jué)上皮；特化上皮分布于肌上皮細(xì)胞及胸腺上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞等。皮膚外層的上皮細(xì)胞通常發(fā)生角質(zhì)化，發(fā)揮吸收和保護(hù)的作用。腔道中的上皮細(xì)胞可分化成多種形式，具有分泌、吸收和排泄等功能[7]?？傊?，上皮細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境中具有十分重要的意義。因此，本文主要就黃芪甲苷對(duì)上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用進(jìn)行綜述。

圖1 黃芪甲苷結(jié)構(gòu)圖

1 細(xì)胞凋亡途徑與調(diào)控

細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，是細(xì)胞程序性死亡中特有的一種細(xì)胞死亡方式，是細(xì)胞在一系列內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的自然或生理性死亡過(guò)程，能去除不需要的或異常的細(xì)胞[8]。1972年Kerr等就提出了凋亡和死亡的概念。凋亡發(fā)生在單個(gè)細(xì)胞之間，特征是細(xì)胞萎縮、染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞聚集成團(tuán)、形成凋亡小體等特征，凋亡小體可被巨噬細(xì)胞吞噬，不會(huì)引發(fā)周圍細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；壞死一般發(fā)生在多個(gè)細(xì)胞之間，一般表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞腫脹破裂，細(xì)胞核被溶解等，同時(shí)引發(fā)炎癥反應(yīng)，因此壞死和凋亡之間具有本質(zhì)性區(qū)別[9-10]。

凋亡發(fā)生的途徑主要有三種：(一)線粒體途徑，又稱為內(nèi)源性途徑，該途徑分為兩類，一類需要先激活Caspase 通路促進(jìn)凋亡，誘導(dǎo)線粒體中的細(xì)胞色素C(CytC)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶活化因子1 (Apoptosis protease activating factor 1，APAF-1) 結(jié)合形成多聚體，構(gòu)成的多聚體再結(jié)合凋亡起始分子Caspase-9 形成凋亡小體，Caspase-9凋亡小體激活，從而使凋亡執(zhí)行分子Caspase-3，Caspase-6 和Caspase-7 等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)；另一類是經(jīng)由線粒體凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis induce factor，AIF)直接誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生；(二)死亡受體途徑，又稱為外源性途徑，死亡受體與FADD結(jié)合后激活了Caspase-8 、caspase-10，進(jìn)一步激活凋亡執(zhí)行者Caspase-3，Caspase-6 和Caspase-7，促進(jìn)凋亡的發(fā)生；(三)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡或鈣離子過(guò)多，一方面激活caspase-12，從而caspase-9被激活而促進(jìn)凋亡，另一方面誘導(dǎo)B 細(xì)胞淋巴瘤蛋白 (Bcl-2)家族中促凋亡蛋白 Bax 和Bak的激活誘導(dǎo)凋亡[11-12]。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生受多種基因的共同調(diào)控，其中抑制凋亡基因有Bcl-2、ced-9、Bcl-xL、Mcl-1等；促進(jìn)凋亡基因有Bax、Nbk、Bak、Bad等；雙向調(diào)控基因有：c-myc。當(dāng)Bcl-2與其他基因如 C-myc、p53等相互作用可抑制細(xì)胞的增殖及程序性死亡，抑癌基因p53 參與啟動(dòng)DNA受到損害的細(xì)胞的凋亡，而C-myc表達(dá)的下調(diào)可促進(jìn)凋亡，但在某些情況下，當(dāng)關(guān)鍵性生長(zhǎng)因子缺乏時(shí)，C-myc的高表達(dá)也可促使細(xì)胞凋亡[13]。

2 黃芪甲苷對(duì)上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

細(xì)胞的凋亡和壞死在生物體中起著重要的作用[14]，許多疾病的發(fā)生都和細(xì)胞凋亡的紊亂有著直接或是間接的關(guān)系，如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病毒感染等[15]。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)得出結(jié)論，黃芪甲苷可抑制上皮細(xì)胞的凋亡從而對(duì)機(jī)體發(fā)揮保護(hù)作用。

2.1 黃芪甲苷對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

目前，無(wú)論是在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率逐漸上升[16]。慢性腎臟病人在不同的發(fā)病階段的具體病癥各不相同，發(fā)病初期僅有腰酸無(wú)力等輕微癥狀。而在后期，會(huì)出現(xiàn)高血壓、消化道紊亂等癥狀，嚴(yán)重時(shí)危及生命。因此治療過(guò)程中會(huì)消耗大量的人力、財(cái)力及衛(wèi)生資源，給我國(guó)醫(yī)療行業(yè)帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。腎纖維化大多是慢性腎臟病中細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積累所導(dǎo)致的，而腎纖維化發(fā)生的主要原因之一就是腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[17]。

田磊等[18]探討黃芪甲苷(AS-IV) 抑制TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和治療組，連續(xù)7天灌胃給藥，術(shù)后第14天采集腎臟組織，經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)得出結(jié)論：AS-IV可改善單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎組織內(nèi)TGF-β1 表達(dá) (P<0. 01)，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的 HK-2 細(xì)胞活性下降，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，且200 μg/ml AS-IV 作用最明顯(P<0. 01) 。

腎臟病的病因有很多，一方面是由免疫傷害所引起，另一方面是由糖尿病、高血壓等疾病所引起。而腎小球細(xì)胞凋亡與該病之間具有一定的相關(guān)性[19]。Wang[20]等針對(duì)AS-IV對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用進(jìn)行了研究, 通過(guò)體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞,分為低糖組和高糖組并分別在高糖培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的AS-IV，在處理后 0、1、12、24、48、96 h觀察，檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。經(jīng)過(guò)研究得出結(jié)論：高糖環(huán)境能誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡，黃芪甲苷可有效地抑制其凋亡，其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性與時(shí)間依賴性。

急性腎損傷是由多種病因所引起的腎功能下降而引發(fā)的一種常見(jiàn)疾病，腎小管上皮細(xì)胞的損傷以及缺血等都能造成這種疾病，特點(diǎn)是細(xì)胞的凋亡[21]，可通過(guò)干細(xì)胞移植治療，但是干細(xì)胞的移植存活又是一大難題，王葳[22]等通過(guò)觀察黃芪甲苷孵育后的脂肪源性干細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用，將實(shí)驗(yàn)分為四組，分別為順鉑損傷組、脂肪源性干細(xì)胞+損傷腎小管上皮細(xì)胞組、黃芪甲苷孵育脂肪源性干細(xì)胞+損傷腎小管上皮細(xì)胞組、正常對(duì)照組。結(jié)果顯示，與正常組相比，順鉑損傷組的細(xì)胞凋亡的最多，加入脂肪源干細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡減少，而加入黃芪甲苷培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。因此實(shí)驗(yàn)對(duì)比得出結(jié)果，黃芪甲苷孵育的人脂肪源性干細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡具有抑制作用，從而有利于腎小管損傷的早期恢復(fù)。

2.2 黃芪甲苷對(duì)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

目前已知糖尿病能引發(fā)多種并發(fā)癥，不但能導(dǎo)致腎病，還能致使視網(wǎng)膜病變。糖尿病視網(wǎng)膜病變主要和體內(nèi)自由基所介導(dǎo)的氧化損傷相關(guān)聯(lián)，并致使細(xì)胞凋亡。甲基乙二醛的積累可導(dǎo)致多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，因此認(rèn)為是引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵物質(zhì)[23]。周云豐等人[24]研究黃芪甲苷( AS-IV) 對(duì)甲基乙二醛( MGO) 誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)損傷的作用。首先培養(yǎng)ARPE-19 細(xì)胞，然后再找出MGO和AS-IV的最佳作用濃度，通過(guò)多種檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ARPE-19 細(xì)胞的活力與MGO的劑量成反比，AS-IV能逆轉(zhuǎn)MGO引起的細(xì)胞活力下降，從而抑制細(xì)胞凋亡。

2.3 黃芪甲苷對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種常見(jiàn)的一具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和肺氣腫，吸煙引起的肺氣腫是一種自身免疫性疾病[30]，一些研究發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)細(xì)胞的凋亡是引發(fā)該病的關(guān)鍵[25]。楚琪等[26]人通過(guò)觀察黃芪甲苷對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和黃芪甲苷低、中、高劑量組，連續(xù)14天采用腹腔注射法對(duì)大鼠注藥。結(jié)果顯示，黃芪甲苷可改善肺組織細(xì)胞凋亡，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 黃芪甲苷對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

胃內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，但大多數(shù)情況下仍能處于正常的生理狀態(tài)，主要是因?yàn)槲竷?nèi)存在胃黏膜屏障。胃粘膜屏障是由胃黏膜上皮細(xì)胞頂部的細(xì)胞壁和連接鄰近細(xì)胞的緊密連接構(gòu)成的一個(gè)脂蛋白層。胃黏膜屏障除具有多種作用，如機(jī)械保護(hù)作用、阻止胃蛋白酶通過(guò)、保護(hù)粘膜免受損傷以及其他因素侵蝕損傷的作用。因此，胃粘膜上皮細(xì)胞的完整性和分泌功能的正常，對(duì)機(jī)體內(nèi)胃粘膜的保護(hù)至關(guān)重要。孫雪蓮[27]等就探討了黃芪皂苷及黃芪甲苷對(duì)胃損傷大鼠的胃粘膜上皮細(xì)胞的影響，將大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，AST高、低劑量預(yù)防組，AS-IV高、低劑量預(yù)防組，模型自然恢復(fù)組，AST高、低劑量治療組，AS-IV高、低劑量治療組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：慢性胃粘膜損傷大鼠的胃粘膜屏障受到破壞，AST及AS-IV均具有保護(hù)胃粘膜屏障的作用。AST的作用明顯優(yōu)于AS-IV，且隨劑量的增加，AST的優(yōu)越性更加明顯，大劑量的作用接近正常組的水平。AST在較低劑量的情況下可以達(dá)到甚至超過(guò)AS-IV大劑量的作用效應(yīng)。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，黃芪甲苷可通過(guò)降低caspase-3的表達(dá)、阻斷p38 MAPK信號(hào)通路、抑制JNK磷酸化等途徑，對(duì)多種上皮細(xì)胞的凋亡均具有一定的抑制作用。目前犢牛早期上皮的完整性對(duì)犢牛的消化吸收和免疫屏障的建立對(duì)犢牛的成活率和生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)至關(guān)重要。外來(lái)病原微生物或異物在腸道內(nèi)產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)可以對(duì)小腸上皮造成損傷引起上皮的壞死或凋亡后壞死。黃芪甲苷對(duì)腸上皮細(xì)胞的凋亡是否也具有抑制作用，有待于進(jìn)一步的研究。