方舒 胡一勇 呂萍 于寧

1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(南充637000)

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科耳鼻咽喉研究所（北京100853）

耳蝸基底膜免疫熒光染色鋪片是一種利用熒光顯微鏡對基底膜組織或細(xì)胞上與熒光素特異性結(jié)合的目標(biāo)抗原進(jìn)行直觀、準(zhǔn)確的顯像定位的形態(tài)學(xué)研究方法，在耳科學(xué)生理及病理研究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[1-3]。常規(guī)豚鼠耳蝸基底膜免疫熒光染色鋪片方法步驟繁多，耗時(shí)較長，本實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明每一個(gè)耳蝸標(biāo)本的平均處理時(shí)間在30小時(shí)以上[4-6]。為提高實(shí)驗(yàn)效率本文擬在常用耳蝸基底膜鋪片染色方法的基礎(chǔ)上探索可以簡略或改進(jìn)的步聚，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察對比改進(jìn)前后的染色效果，旨在建立一種新的快速、有效、可靠的基底膜鋪片染色方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1）Dunkin Hartley豚鼠15只，體重250-280g，雌雄不限，購自北京市科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心。實(shí)驗(yàn)豚鼠右耳為對照組（A組），作常規(guī)耳蝸基底膜免疫熒光染色鋪片；左耳為實(shí)驗(yàn)組（B組），作快速耳蝸基底膜免疫熒光染色鋪片。

2)實(shí)驗(yàn)試劑：1%戊巴比妥鈉溶液、4%多聚甲醛（PFA）溶 液 、0.01M PBS、Triton X-100(sigma,9002-93-1)，BSA（sigma,9048-46-8）、封閉用山羊血清(碧云天,C0265)、Rabbit Anti-Myosin Ⅶa primary antibody（abcam,ab3481）、Rabbit anti-neurofilament primary antibody（abcam,ab8135）、Alexa-568 phalloidin（invitrogen,A12308）、Goat anti rabbit alexa-488 antibody(invitreogen,A-11034)、DAPI染色液（碧云天,C1006）、mounting solution（invitrogen,P36930）等。

3)實(shí)驗(yàn)器械：2.5ml無菌注射器、組織剪、眼科剪、培養(yǎng)皿、3ml塑料滴管、顯微鑷（Dumont 0295-po、0508-po）、吸水紙、EP管、體視顯微鏡、Leica TCS SP8等。

1.2 方法

1.2.1 耳蝸取材固定

腹腔注射過量1%戊巴比妥鈉處死豚鼠，迅速斷頭取出雙側(cè)聽泡；自骨性外耳道入口開放聽泡，去除耳蝸周圍骨質(zhì)，充分暴露耳蝸后將其置于盛有4%多聚甲醛的培養(yǎng)皿中；在體視顯微鏡下用顯微鑷于蝸頂鉆孔，開放圓窗，再輕輕將鐙骨推入卵圓窗。吸取4%多聚甲醛自蝸尖灌入，可見淋巴液自卵圓窗及圓窗流出，重復(fù)灌流3-4次；實(shí)驗(yàn)組耳蝸立即在盛有4%多聚甲醛的培養(yǎng)皿行基底膜剝離，對照組耳蝸浸泡于4%多聚甲醛的EP管內(nèi)4℃過夜（16h）保存，再轉(zhuǎn)移至盛放PBS的玻璃皿中行基底膜剝離。

1.2.2 耳蝸基底膜剝離

修剪耳蝸周圍骨質(zhì)，充分暴露耳蝸，用顯微鑷自蝸尖至蝸底去除耳蝸中耳腔面的骨質(zhì)，顯露螺旋韌帶；第二回的巖部骨質(zhì)較厚，將眼科剪小心插入鼓階，一點(diǎn)一點(diǎn)剪去除巖部骨質(zhì)；骨質(zhì)剝除干凈后，自頂回起用顯微鑷分離耳蝸螺旋韌帶與基底膜，完全暴露寶塔狀蝸軸及附著于其上的基底膜；小心撕去前庭膜及蓋膜，按蝸尖向蝸底的順序?qū)⒒啄ぷ晕佪S上分離。

1.2.3 常規(guī)豚鼠耳蝸基底膜染色

剝離的基底膜用PBS快速漂洗三遍；置于含有通透液（0.25%Triton X-100）的EP管內(nèi)30分鐘；吸去通透液，加入封閉液（由10%山羊血清、1%BSA及PBS配制而成），室溫下放置30分鐘；加入用封閉液稀釋的一抗（兔抗NF 1:800或兔抗MyosinⅦa 1:500），4℃過夜（16h）孵育；吸出管內(nèi)一抗，PBS漂洗四遍，每次15min；吸出管內(nèi)PBS，加入用封閉液稀釋的二抗（ALEXA 488 1:600、phalloidin 1:1000），37℃避光孵育45分鐘；按洗滌一抗的方式洗滌二抗；加入DAPI染色液避光靜置15min，PBS漂洗三遍，每次5分鐘。

1.2.4 快速豚鼠耳蝸基底膜染色

剝離的基底膜用PBS快速漂洗三遍；置于含通透-封閉液（由0.25%Triton X-100、10%山羊血清、1%BSA及PBS配制而成）的EP管內(nèi)30分鐘；加入用封閉液稀釋的一抗（一抗種類及濃度同常規(guī)方法），室溫下孵育2小時(shí)；吸出管內(nèi)一抗，PBS快速漂洗3遍，管內(nèi)加入PBS置搖床上漂洗10分鐘，再用PBS快速漂洗3遍；吸出管內(nèi)PBS，加入用封閉液稀釋的二抗（二抗種類及濃度同常規(guī)方法），室溫避光孵育1小時(shí)；按洗滌一抗方式洗滌二抗；加入DAPI染色液避光靜置15min，PBS漂洗三遍，每次5分鐘。

表1 兩種方法用時(shí)比較Table 1 Time-consuming comparison of the two methods

1.2.5 基底膜鋪片

將染色完畢的基底膜鋪片用滴管轉(zhuǎn)移至盛放PBS的玻璃皿內(nèi)，以圓窗龕上緣最高點(diǎn)向蝸頂作假想直線，將基底膜分為鉤端、1-4回共5段；用滴管將基底膜轉(zhuǎn)移至清潔載玻片上，吸凈組織周圍液體，并在其上加一滴mounting solution，體視顯微鏡下觀察調(diào)整標(biāo)本，使其正面朝上，鋪放平整后封片。

1.2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察及圖像采集

每張基底膜免疫熒光染色鋪片均在Leica SP8激光共聚焦熒光顯微鏡在20X、40X、63X下觀察Corti器上熒光蛋白標(biāo)記的神經(jīng)絲蛋白或內(nèi)外毛細(xì)胞肌球蛋白的表達(dá)情況并采集圖像。

2 結(jié)果

對照組耗時(shí)37.5小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組耗時(shí)5.25h（表1），對照組清晰顯示由ALEX-488標(biāo)記的神經(jīng)絲蛋白或內(nèi)外毛細(xì)胞肌球蛋白、DAPI標(biāo)記的細(xì)胞胞核、phalloidin標(biāo)記的微絲蛋白（Figure1 A1-A4），實(shí)驗(yàn)組亦可清晰顯示熒光素標(biāo)記的內(nèi)外毛細(xì)胞肌球蛋白或神經(jīng)絲蛋白、細(xì)胞核、微絲蛋白（Figure1 B1-B4），兩者在共聚焦顯微掃描圖像成像質(zhì)量上無明顯差異。

圖1 對照組（A1-A4）及實(shí)驗(yàn)組(B1-B4)代表性共聚焦圖片。A1,A2,B1,B2中綠色為兔抗myosin聯(lián)合羊抗兔Ⅶa Alexa 488聯(lián)合標(biāo)記的毛細(xì)胞，A3,A4,B3,B4中綠色為兔抗neurofilament聯(lián)合羊抗兔Ⅶa Alexa 488標(biāo)記的神經(jīng)纖維,紅色為phalloidin聯(lián)合Alexa 568標(biāo)記的毛細(xì)胞纖毛及表皮板，藍(lán)色為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。兩組成像效果未見明顯差異。Fig.1 Representative confocal photomicrographs of control(A1-A4)and experimental(B1-B4)group.Hair cells in A1,A2,B1,and B2 are labeled with a rabbit anti-myosinⅦa primary antibody combined with a goat anti-rabbit Alexa 488-conjugated secondary antibody（green）.Nerve fibers in A3,A4,B3,and B4 are labeled with a rabbit anti-neurofilament primary antibody combined with a goat anti-rabbit Alexa 488-conjugated secondary antibody（green）.The stereocilia and cuticular plate of the hair cells are labeled with 568-conjugated phalloidin(red),DAPI(blue)labels all nuclei.There was no significant difference in image quality between the control and experimental group.

3 討論

耳蝸基底膜鋪片免疫熒光染色法是耳蝸基底膜鋪片技術(shù)及免疫熒光染色技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，主要步驟包括取材、固定、剝離、免疫熒光染色及鋪片[7]。本實(shí)驗(yàn)通過減少組織固定、免疫熒光染色一抗孵育及抗體洗滌時(shí)間對常規(guī)方法進(jìn)行改進(jìn)，提高了豚鼠耳蝸基底膜Corti器免疫熒光染色鋪片的實(shí)驗(yàn)效率。

目前國內(nèi)外報(bào)道多采用將離體耳蝸浸泡在4%多聚甲醛中4℃過夜進(jìn)行組織固定，有研究發(fā)現(xiàn)長時(shí)間使用多聚甲醛固定組織會(huì)損失組織細(xì)胞某些成分的抗原性[8,9]。Scott等認(rèn)為使用不含甲醇的4%多聚甲醛在室溫下對耳蝸組織固定3-4小時(shí)既能達(dá)到良好的固定效果，又不會(huì)干擾目前聽覺研究領(lǐng)域使用的絕大多數(shù)一抗[10]。本實(shí)驗(yàn)直接將離體耳蝸在盛有4%多聚甲醛的培養(yǎng)皿中進(jìn)行灌流及基底膜剝離，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并減少多聚甲醛對一抗的干擾，結(jié)果顯示相較于對照組4%多聚甲醛4℃過夜組織固定，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本固定效果良好，未見明顯熒光干擾。

除外為抗原-抗體反應(yīng)提供適宜環(huán)境條件外，研究人員還通常采用使用通透劑破膜及延長一抗孵育時(shí)間達(dá)到使抗體與抗原充分結(jié)合的目的，常規(guī)的組織通透多與封閉同時(shí)進(jìn)行。耳科學(xué)研究領(lǐng)域中常規(guī)的一抗孵育時(shí)間從1-48小時(shí)不等[11-14]，本實(shí)驗(yàn)采用常溫2小時(shí)孵育NF、myosin，熒光染色結(jié)果未見明顯差異，相較于對照組4℃過夜孵育這樣的改進(jìn)能夠大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

洗滌是免疫熒光染色重要環(huán)節(jié)，良好的洗滌能減少非特異性染色，目前常規(guī)的漂洗方法為PBS洗滌3-4遍，每次5-15分鐘不等，本實(shí)驗(yàn)采用PBS快洗3遍、再將組織浸泡在PBS液中置搖床上10分鐘后，PBS洗3遍的漂洗方法，通過增加漂洗次數(shù)達(dá)到縮短總洗滌時(shí)間的目的，結(jié)果顯示與對照組PBS洗滌4×15分鐘相比，兩組均未見明顯背景熒光。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示豚鼠耳蝸基底膜鋪片快速熒光染色法可以在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上有效的提高實(shí)驗(yàn)效率。因此，該法值得在耳科研究領(lǐng)域尤其是形態(tài)學(xué)研究方面推廣。