劉嬌嬌

（常熟理工學(xué)院 物理與電子工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

1 引言

生物膜的形變與許多生理過程密切相關(guān)，包括跨膜物質(zhì)的運輸、信號傳導(dǎo)、細胞膜的分裂/融合.生物膜的形變不僅依賴于脂質(zhì)、膜蛋白，還與膜的外部支撐物密切相關(guān)，如細胞骨架、細胞外基質(zhì)或來自細胞外部的物質(zhì)包括人工組織和納米醫(yī)藥［1-2］.因此，探索研究脂質(zhì)與固體支撐物之間的相互作用，特別是膜對支撐物基質(zhì)的響應(yīng)，對于理解復(fù)雜的細胞活性十分重要［3-6］.

近年來，脂質(zhì)膜和固體基底之間的界面相互作用，包括通過局部物理環(huán)境調(diào)節(jié)細胞行為，被認為是決定膜組分的納米級組織和相應(yīng)功能的關(guān)鍵因素［7-11］.這使得我們可以設(shè)計新的具有磷脂納米結(jié)構(gòu)的材料，這些材料甚至可以模擬一些生物膜行為［12-14］.這些研究為我們提供了關(guān)于對細胞生物系統(tǒng)新的理解和應(yīng)用.在此基礎(chǔ)上，石墨烯、氧化石墨烯（GO）、還原氧化石墨烯（rGO）由于其優(yōu)異的機械性能、電學(xué)性能和熱學(xué)性能引起了廣泛關(guān)注［15-17］.由于石墨烯材料有良好的生物相容性和獨特的共軛結(jié)構(gòu)使其可用于各種生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（例如組織工程）［18-21］.想要把石墨烯材料用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，我們需要了解石墨烯材料的細胞毒性和抗微生物能力，石墨烯有這些能力主要是因為石墨烯薄的二維片層結(jié)構(gòu)和表面的疏水性［22-24］.目前關(guān)于石墨烯的研究大多集中于石墨烯在生物醫(yī)藥、電學(xué)性能等方面的應(yīng)用.而很少關(guān)注到石墨烯材料調(diào)節(jié)膜形變的能力［25］.

在之前的工作中，我們研究了微凝膠顆粒體積相轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的磷脂可逆形變，囊泡釋放和融合過程，這清楚地表明支撐物對脂質(zhì)體自組裝行為有強烈影響［26-27］.基于上面這些工作，我們制備了一種新型的復(fù)合材料，GO塊狀聚集體表面修飾一層磷脂膜.在激光照射下，GO還原成了rGO并在此過程中會導(dǎo)致磷脂膜發(fā)生形變，磷脂膜表面會形成囊泡和微管.這項工作幫助我們進一步理解膜在固體基底上的轉(zhuǎn)化機制，并為我們設(shè)計和合成新型基于GO復(fù)合生物納米材料提供了思路.

2 實驗部分

2.1 材料

二油酰磷脂酰膽堿（DOPC）、NBD熒光標記的二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺（NBD-DPPE），購于Avanti Lipids.GO粉末來自于NanoInnova Technologies.石墨粉、抗壞血酸均購自Sigma公司.乙醇（99%）、氯仿（99.7%）購自上海化學(xué)試劑有限公司.

2.2 制備GO，磷脂@GO，磷脂@石墨，磷脂@rGO復(fù)合微粒

氧化石墨烯粉末溶解于乙醇中（0.2 mg·mL-1），混合物超聲40 min，3 000 rpm離心7 min.然后將下層沉淀物重新分散于乙醇中（0.2 mg·mL-1）為GO聚集體的母液備用.DOPC粉末溶于氯仿（2 mg·mL-1）中，NBD-DPPE粉末也溶于氯仿（0.2 mg·mL-1）中.取100 μL DOPC溶液（加入5 mol%NBD-PE）于小玻璃瓶底部，氮氣吹干置于真空干燥箱中過夜，得到有熒光修飾的干磷脂膜.在干磷脂膜中加入40 μL GO母液，60 μL水，幾分鐘后迅速加入1 mL水，將混合溶液超聲30 min（40 W），3 000 rpm，7 min離心3次，洗去多余的磷脂和碎小的GO復(fù)合微粒.最后將GO@lipid復(fù)合微粒重新分散到400 μL水中，置于實驗室自制的共聚焦顯微鏡觀察艙觀察.

為了解釋在激光照射下復(fù)合微粒表面磷脂的形變機理，我們制備了石墨粉、還原氧化石墨烯@磷脂復(fù)合顆粒.磷脂@石墨微粒的制備方法同上述的磷脂@GO.磷脂@rGO的制備：DOPC粉末溶于氯仿（2 mg·mL-1）中，NBD-DPPE粉末也溶于氯仿（0.2 mg·mL-1）中，取1 mL DOPC溶液（加入5 mol%NBD-PE）于小玻璃瓶底部，氮氣吹干置于真空干燥箱中過夜，得到熒光修飾的干磷脂膜.在磷脂膜中加入400 μL GO（0.2 mg·mL-1），然后加入600 μL的水，緊接著加入1 mL水，每次加入溶液后需將該體系輕輕晃動，以保證磷脂膜完全溶解，溶液混合均勻.而后在該體系中加入1.2 mL，10 mg·mL-1的抗壞血酸水溶液，在37 ℃水浴中輕輕攪拌24 h，此時GO完全還原成rGO［28］.最后將溶液離心清洗兩次以洗去多余的磷脂和抗壞血酸，并將所得到的沉淀物磷脂@rGO復(fù)合顆粒重新分散于4 mL水中.

2.3 光學(xué)顯微鏡觀察囊泡/微管的產(chǎn)生

我們使用的光學(xué)顯微鏡是一個倒置的激光掃描共聚焦顯微鏡（Zeiss，LSM 710）上的63倍油鏡.NBDPE修飾的磷脂使用488 nm的氬離子激光器來激發(fā)，發(fā)出的光用綠色通道收集.激光照射復(fù)合顆粒表面使用的是1.5 mW，5%強度的原位氬離子激光器，照射面積是512×512像素（每個像素1.58 usec）.除了激光強度所有實驗保持一致外，另外3個實驗條件激光照射區(qū)域大小、掃描頻率和整體的曝光時間是隨著激光照射模式（激光連續(xù)照射continuous irradiation和激光間斷掃描interval scan）來改變的.因此在樣品上可以得到不同的功率密度.

2.4 其他的表征方法

XRD測量時，一定體積的磷脂@GO（磷脂@rGO）溶液離心后，將沉淀物滴在干凈的硅片表面.為了解激光照射后GO的還原情況，我們將硅片上的磷脂@GO樣品放在共聚焦顯微鏡下，加入少量水，488 nm 5%的氬離子激光器照射2 h，然后將該溶液晾干，XRD測量表征.

為了測量實驗中的溫度變化，我們將離心沉淀后的溶液滴到用于溫度測量的探頭上，并將探頭固定在自制的共聚焦顯微鏡觀察玻璃艙中，等探頭上的溶液干掉后加入水，然后用共聚焦顯微鏡的氬離子激光器照射樣品，在激光照射的同時統(tǒng)計溫度的變化.激光連續(xù)照射樣品或間隔照射樣品GO會釋放熱量，最終兩種模式下溶液達到相同溫度.

3 結(jié)果及討論

3.1 GO聚集體和磷脂@GO復(fù)合顆粒的結(jié)構(gòu)表征

圖1顯示了不同尺寸及形態(tài)的GO聚集體.聚集體的尺寸大概為5～10 μm，見圖1（e），這個尺寸適合直接顯微鏡觀察.GO聚集體不同的形態(tài)及結(jié)構(gòu)同時存在.有些聚集體是由片層石墨烯組成，表面是光滑的，如 圖 1（a）、圖 1（b）所示，其他的復(fù)合顆粒則是由很小的GO碎片組成，如 圖 1（c）、圖 1（d）所示，這種復(fù)合體邊緣有棱角，不平滑.

GO聚集體表面修飾磷脂前后的TEM如圖2所示.與SEM圖相比，TEM下可以清楚地看到聚集體的邊緣結(jié)構(gòu)，特別是可以看到邊緣區(qū)域有薄的聚集體.與GO聚集體相比，GO@磷脂上有平行的條紋，條紋間的間隔是3.43 nm.這個間隔遠遠超過GO片的厚度1 nm［16］，但是很接近空氣中磷脂雙層膜之間的間距（周期）4.27 nm，并且在多層膜的周期范圍內(nèi)［13］.這樣，我們可以推斷這個條形的間隔是由磷脂分子在GO表面的自組裝形成的，間隔可能是由于層狀膜中脂質(zhì)分子的兩親性結(jié)構(gòu)，見圖2（g）.這會在接下來的共聚焦顯微鏡表征中進一步討論.

圖1 各種不同形態(tài)的GO聚集體：（a）（b）表面光滑的復(fù)合顆粒；（c）（d）復(fù)合顆粒表面有很多GO碎片，（d）中的插圖是局部放大；（e）統(tǒng)計了在SEM下106個GO聚集體的尺寸分布

3.2 激光照射下磷脂@GO表面形成囊泡

磷脂@GO復(fù)合顆粒在共聚焦顯微鏡下為綠色（磷脂用NBD-DPPE染色），圖3（a）～圖3（d）顯示了復(fù)合顆粒在綠色熒光通道，透射通道及混合通道下的顯微鏡圖.我們可以從圖3（e）中看到磷脂分子是均勻分布在整塊GO上，這是因為磷脂的自組裝在GO表面形成了連續(xù)的多層膜.這個磷脂修飾的GO形成多層膜的復(fù)合材料在常溫下可以存儲1 d，在4 ℃下可以存儲3 d.

圖3（a）～圖3（d）lipid@GO復(fù)合顆粒形成了不同結(jié)構(gòu)后的共聚焦顯微鏡圖（包括綠色熒光通道，透射通道和混合通道）；（a）～（c）是lipid@GO復(fù)合顆粒在激光照射之前的圖；（b）～（d）是相同的顆粒激光照射后的圖，Scale bar 5 μm；（e）顯示了將GO@lipid復(fù)合顆粒當作標準的球形在表面形成囊泡后的結(jié)構(gòu)示意圖，R代表了整個復(fù)合結(jié)構(gòu)的半徑，r代表了GO聚集體的半徑.

當我們用488 nm的氬離子激光器照射磷脂@復(fù)合顆粒表面5.2 μm×5.2 μm的區(qū)域，相當于輻射功率為0.055 mW mm2，照射2～5 min的過程中（不同顆粒表面照射時間不同，照射時間長短根據(jù)復(fù)合顆粒表面熒光什么時候會被激光完全淬滅來選擇），復(fù)合顆粒會震動并且在溶液中移動（激光照射前復(fù)合顆粒是靜止的），且磷脂@GO表面有明顯的變化.激光照射后復(fù)合顆粒表面形成一圈穩(wěn)定且數(shù)量較多的囊泡，同時復(fù)合顆粒在透射通道下會變得比激光照射前更暗，見圖3（b）、圖3（d）.

為了定量統(tǒng)計形成的囊泡的尺寸，我們將最初在共聚焦截面圖下觀察到的囊泡面積與復(fù)合顆粒面積之比定義為φ=（A-B）/A*100%，A代表了整個復(fù)合顆粒結(jié)構(gòu)包括表面形成的囊泡，其總面積需要從復(fù)合通道中去觀察，B代表了GO聚集體的面積，從透射通道中觀察，如圖3（e）所示.A-B就代表了形成囊泡的區(qū)域.我們對12個單獨的樣品進行統(tǒng)計，包括之前提到的兩種類型的GO聚集體（由很多GO碎片構(gòu)成的四周有棱角的GO聚集體，由整片的GO構(gòu)成的表面相對平滑的GO聚集體），其中φ計算為5.11±1.5%.如果我們將磷脂@GO，GO聚集體都看作是標準的球形，定義R代表了整個復(fù)合結(jié)構(gòu)的半徑，r代表了GO聚集體的半徑.因此φ=（4πR2-4πr2）/4πR2=0.511，R-r=0.43r，這表明GO@lipid表面囊泡層的厚度是GO層厚度的0.43倍.

圖2 GO聚集體的TEM圖：（a） （b）GO的TEM圖；（c） （f）lipid@GO 顆粒的TEM圖；（c） （d）樣品不同位置的TEM圖；（e） （f） 放大的條紋圖；（g） 顯示了GO/lipid的結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 （a）～（d）lipid@GO復(fù)合顆粒形成了不同結(jié)構(gòu)后的共聚焦顯微鏡圖（包括綠色熒光通道，透射通道和混合通道）.其中（a） （c）是lipid@GO復(fù)合顆粒在激光照射之前的圖；（b）（d）是相同的顆粒激光照射后的圖，Scale bar 5 μm；（e） 顯示了將GO@lipid復(fù)合顆粒當作標準的球形在表面形成囊泡后的結(jié)構(gòu)示意圖，R代表了整個復(fù)合結(jié)構(gòu)的半徑，r代表了GO聚集體的半徑

3.3 控制囊泡在磷脂@GO表面形成的位置

從多次實驗中（超過10次）發(fā)現(xiàn)囊泡的形成位置與顆粒上激光的照射位置密切相關(guān)，如圖4所示，圖4（a）是激光照射之前GO@lipid的形貌，圖4（b）是激光照射之后的形貌，其中虛線框為激光照射區(qū)域，3 μm×3 μm.可以看到，激光照射1 min后，照射區(qū)域的邊緣形成了磷脂突出物（圖中白色箭頭所指）.另外我們發(fā)現(xiàn)囊泡的形成與復(fù)合顆粒中GO的結(jié)構(gòu)有關(guān).囊泡更傾向于在很多GO碎片組成（邊緣有棱角）的GO@磷脂復(fù)合體的邊緣形成，而不會在由完整連續(xù)片層GO組成的表面光滑的GO@磷脂復(fù)合體表面形成.于是對于由很多GO碎片組成的GO@磷脂復(fù)合體而言，因為整個復(fù)合顆粒上都存在GO碎片有明顯的邊緣，導(dǎo)致整個GO@磷脂復(fù)合體表面都形成一圈穩(wěn)定的囊泡，見圖3（d）.

另外，囊泡的形成也依賴于GO聚集體的其他結(jié)構(gòu)特征.例如：單片的GO表面修飾lipid后，其形成的復(fù)合體激光照射直到復(fù)合物表面的熒光淬滅時都沒有明顯的囊泡形成，見圖5.

圖4 lipid@GO表面囊泡形成的位置依賴于激光照射的位置（方框所示）

3.4 調(diào)控囊泡形成的動力學(xué)過程

除了囊泡產(chǎn)生的位置可調(diào)控外，我們還可通過激光照射的功率來調(diào)控囊泡產(chǎn)生的動力學(xué)過程.激光照射有兩種模式，激光不斷照射功率為5.5×10-2mW/μm2，激光間隔掃描模式功率為6.0×10-5mW/μm2.將激光模式由不斷照射模式調(diào)節(jié)至間隔掃描模式時，GO@lipid表面會形成磷脂突出物，最后長成磷脂微管而不是形成囊泡，見圖6（b）.這個動力學(xué)過程用視頻的形式拍攝下來，其中第1幀和第112幀的圖片被選取出來，如圖6所示.在激光的間隔掃描模式照射下，僅僅只有少量的囊泡形成，大多形成微管，并且大量的微管在復(fù)合顆粒的表面穩(wěn)定存在。當過了某個臨界狀態(tài)后，微管穩(wěn)定存在。形成微管的面積φ達到40%，在復(fù)合顆粒表面形成的微管會穩(wěn)定存在，并且延長激光照射時間會導(dǎo)致熒光的完全淬滅.

在連續(xù)激光照射模式下（在熒光完全淬滅前）我們將激光照射模式轉(zhuǎn)化為間隔掃描模式時，在形成囊泡穩(wěn)定存在的復(fù)合顆粒表面也會觀察到微管的存在.這個動力學(xué)的過程是可以通過激光照射的強度來調(diào)控的.

4 結(jié)果討論

共聚焦顯微鏡圖片顯示，激光照射后磷脂@石墨粉，磷脂@rGO復(fù)合顆粒表面會形成均勻的磷脂膜，但不會形成囊泡和微管，如圖7（a）、圖7（b）所示.為了解磷脂與GO的比例對于形成囊泡和微管的影響，我們將磷脂/GO的比例減半，激光照射復(fù)合顆粒，發(fā)現(xiàn)沒有囊泡和微管形成，見圖7（c）.該結(jié)果表明GO材料，充分的磷脂與GO比例是在GO@磷脂復(fù)合顆粒表面形成囊泡和微管的先決條件.另外，我們發(fā)現(xiàn)激光照射GO@磷脂復(fù)合顆粒后，在透射通道下可以清楚地看到GO聚集體表面顏色會變暗，這表明激光照射后GO表面的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化.此外，用上海同步輻射測GO@磷脂，rGO@磷脂的小角X射線散射，發(fā)現(xiàn)GO（rGO）表面形成了多層磷脂膜.XRD測試的結(jié)果也表明激光照射GO@磷脂復(fù)合顆粒后GO會被還原成rGO.在我們的實驗中，復(fù)合顆粒表面形成囊泡和微管主要是由于GO在激光照射下轉(zhuǎn)變成rGO.

激光照射GO后會被還原，這個變化導(dǎo)致復(fù)合顆粒表面形成囊泡/微管.通過除去含氧基團，包括分解和重建，實現(xiàn)將GO還原為rGO的過程［19-20，29］.含氧基團分成氣體：CO2，CO，O2和H2O［28］.氣體的釋放會擾動和破壞GO表面的磷脂膜，例如GO@磷激光照射后，復(fù)合顆粒會震動和移動以及磷脂膜表面會形成囊泡和微管.這是因為GO被激光照射表面的含氧基團分解產(chǎn)生氣體對膜進行擾動從而使磷脂膜表面形成微管和囊泡.而石墨粉、rGO表面激光照射時不可能產(chǎn)生氣體，因而沒有這些現(xiàn)象.

圖7 激光掃描共聚焦顯微鏡圖：（a）磷脂@graphite；（b）磷脂@rGO；（c）磷脂@GO，磷脂/GO的比例減半后激光照射后的圖

5 總結(jié)

本實驗中，我們制備了一種新型微米級lipid@GO復(fù)合材料，lipid在GO表面形成了多層磷脂膜.通過激光照射lipid@GO復(fù)合材料表面，調(diào)節(jié)激光的模式來調(diào)控lipid@GO表面是形成囊泡或者微管.我們發(fā)現(xiàn)，激光照射lipid@GO復(fù)合材料后，在復(fù)合物的邊緣先形成磷脂突出物，然后形成大量的囊泡，囊泡都吸附在復(fù)合物的表面，囊泡的尺寸是GO尺寸的0.43倍，形成囊泡的區(qū)域及囊泡形成的動力學(xué)過程都可以調(diào)控.降低激光的強度照射lipid@GO復(fù)合材料，其表面會形成微管而不是囊泡，復(fù)合材料表面形成囊泡和微管可能是由于激光照射GO還原成rGO的原因.通過本實驗我們發(fā)現(xiàn)了一種新的方法來調(diào)節(jié)磷脂膜的形變.