郭杰 焦炳欣 劉穎 曲沛 徐新民 李娟

[摘要] 目的 探討不同組合的血清學(xué)檢測在梅毒診斷中的價值。 方法 收集2016年9月～2017年8月在北京地壇醫(yī)院就診的20 325例患者血清，分別應(yīng)用甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）、梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）和熒光密螺旋體抗體吸收試驗（FTA）檢測梅毒血清樣本。 結(jié)果 20 325例患者中，有4480例確診為梅毒螺旋體感染，在4480例TPPA陽性TP患者中，TRUST陽性者3342例，占74.6%；TRUST陰性者1138例，占25.4%；其中在3342例TPPA陽性，TRUST陽性的梅毒（TP）患者中，F(xiàn)TA-ABS-IgM陽性者979例，占29.3%；在1138例TPPA陽性，TRUST陰性的TP患者中，F(xiàn)TA-ABS-IgM陽性者12例，占1.05%；979例梅毒患者FTA-ABS-IgM陽性率與TRUST不同稀釋倍數(shù)呈對數(shù)相關(guān)（R2 = 0.9351）。 結(jié)論 對于開展梅毒血清學(xué)檢測的實驗室，應(yīng)該同時進行TPPA和TRUST兩種梅毒抗體的檢測，在TRUST陰性和治療后TRUST持續(xù)陽性的情況下，F(xiàn)TA-ABS-IgM可作為其他兩種方法的有效補充。

[關(guān)鍵詞] 梅毒螺旋體；陽性率；梅毒螺旋體明膠凝集試驗；甲苯胺紅不加熱血清試驗；熒光密螺旋體抗體吸收試驗

[中圖分類號] R446 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（a）-0138-04

[Abstract] Objective To investigate the value of different combinations of serological tests in the diagnosis of syphilis. Methods The serum of 20 325 patients visited Beijing Ditan Hospital from September 2016 to August 2017 were collected. Three methods including toluene red unheated serum test （TRUST）， treponema pallidum gelatin agglutination test （TPPA） and fluorescent treponema pallidum antibody absorption test （FTA） were used to test the syphilis antibodies in the serum sample. Results Among the 20 325 patients， 4480 were diagnosed with treponema pallidum （TP） infection and among these patients with TPPA-positive， 3342 cases were positive for TRUST， accounted for 74.6%； 1138 cases were negative for TRUST， accounted for 25.4%. Among 3342 cases of TPPA-positive and TP-positive patients， 979 cases were positive for FTA-ABS-IgM， accounted for 29.3%. Among 1138 cases of TPPA-positive and TRUST-negative patients， 12 cases were positive for FTA-ABS-IgM， accounted for 1.05%. The positive rate of IgM antibody in 979 patients with syphilis was logarithmically correlated with different dilutions of the TRUST （R2 = 0.9351）. Conclusion For laboratories that carried out syphilis serological tests， TPPA and TRUST should be carried out simultaneously. FTA-ABS-IgM was an effective complement for two other methods with TRUST-negative and TRUST persistent positive after treatment.

[Key words] Treponema pallidum； Positive rate； Treponema pallidum gelatin agglutination test； Toluidine red unheated serum test； Fluorescent tethered spirochetes antibody absorption test

梅毒是由梅毒螺旋體（TP）感染引起的一種慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病。人體受感染后，螺旋體可播散到全身，幾乎可侵犯全身各組織與器官，臨床表現(xiàn)多種多樣，且時顯時隱，病程較長，人類對梅毒無先天免疫性，尚無疫苗，僅能在受感染后產(chǎn)生感染性免疫，完全治愈的梅毒患者仍可再感染，未經(jīng)治療的早期梅毒傳染性最強。據(jù)世界衛(wèi)生組織評估，TP感染導(dǎo)致全世界每年增加約1200萬新發(fā)梅毒病例。梅毒患病率不斷上升[1-3]，且有不斷蔓延趨勢，已成為嚴重影響全球民眾健康的公共衛(wèi)生問題之一。因此，臨床及時地檢測和診斷對控制梅毒的傳播具有非常重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月～2017年8月在北京地壇醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的患者，共計20 325例，其中男9802例，女10 523例，年齡3 d～88歲。以上所有患者中，最終確診為TP感染的患者有4480例，其中男2354例，平均年齡（40.00±16.00）歲；女2126例，平均年齡（36.89±14.63）歲。

1.2 診斷標(biāo)準

梅毒診斷參考原衛(wèi)生部頒布的《梅毒診斷標(biāo)準》[4]。

1.3 試劑及儀器

1.3.1 試劑及廠家 日本富士瑞必歐株式會社提供TP明膠凝集試驗（TPPA）試劑；德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司提供熒光TP吸收試驗（FTA-ABS）；上海榮盛生物公司提供甲苯胺紅快速血漿反應(yīng)素試驗（TRUST）。

1.3.2 儀器 歐蒙EUROSII熒光顯微鏡。

1.4 方法

患者于清晨空腹抽取靜脈血，送至我院檢驗科，所采集的標(biāo)本按照3000 r/min的速度進行離心處理5 min后，取血清進行熒光TP抗體吸收試驗、TP明膠顆粒凝集試驗以及梅毒甲苯胺紅不加熱血清反應(yīng)素試驗的檢測。所有檢驗試劑均在有效期以內(nèi)，檢驗的步驟和方法如下：

1.4.1 TP明膠顆粒凝集試驗（TPPA） 在微量反應(yīng)板第1孔、第2孔、第3孔、第4孔中各加入血清稀釋液100、25、25、25 μL，用微量加樣器取樣品25 μL加到第1孔中，然后用微量加樣器從第1孔中吸取25 μL加至第2孔中，以此類推，用試劑盒中提供的滴管在第3孔中滴入1滴（25 μL）未致敏粒子，在第4孔中滴入1滴（25 μL）致敏粒子。震蕩混勻，加蓋孵育2 h后觀察反應(yīng)圖像并記錄。

1.4.2 熒光密螺旋體抗體吸收實驗（FTA-ABS） 用LFTA吸附劑以1∶5稀釋，旋渦混勻器充分混勻，37℃水浴30 min，除去非特異性抗體，將稀釋后血清25 μL加至加樣板反應(yīng)區(qū)，避免產(chǎn)生氣泡。將生物薄片載片蓋在加樣板的凹槽里，室溫（18～25℃）溫育30 min。用燒杯盛PBS-吐溫緩沖液流水沖洗載片，將載片放入裝有PBS-吐溫緩沖液的洗杯中浸洗至少5 min。滴加20 μL熒光二抗至潔凈加樣板的反應(yīng)區(qū)。室溫溫育30 min，載片放入裝有PBS-吐溫緩沖液的洗杯中浸洗至少5 min。將蓋玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加甘油/PBS至蓋玻片，每一反應(yīng)區(qū)約10 μL。從PBS吐溫緩沖液中取出1張載片，用吸水紙擦干背面和邊緣的水分。將載片覆有生物薄片的一面朝下放在已準備好的蓋玻片上，立即查看并輕輕調(diào)整使蓋玻片嵌入到載片的凹槽里。熒光顯微鏡下判讀熒光模型。

1.4.3 甲苯胺紅快速血漿反應(yīng)素試驗（TRUST） 在反應(yīng)紙板圈內(nèi)加入50 uL生理鹽水，勿將鹽水涂開，吸取50 μL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內(nèi)，將抗原輕輕搖勻，加抗原懸液50 μL，在梅毒旋轉(zhuǎn)儀上以100 r/min振蕩8 min，肉眼觀察結(jié)果，有凝集者為陽性，反之為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示，變量間的關(guān)系以對數(shù)回歸方程進行分析；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP患者TPPA和FTA-ABS-IgG檢測結(jié)果

在20 325例就診患者中，TPPA確診的梅毒患者4480例，陽性率為22.0%；FTA-ABS-IgG檢測的TP例數(shù)為4480例，陽性率為22.0%，兩者陽性率高度一致。

2.2 TPPA陽性TP患者TRUST檢測結(jié)果

在4480例TPPA陽性TP患者中，TRUST陽性者3342例，占74.6%；TRUST陰性者1138例，占25.4%。

2.3 FTA-ABS-IgM和TRUST檢測結(jié)果比較

在3342例TPPA陽性，TRUST陽性的TP患者中，F(xiàn)TA-ABS-IgM陽性者979例，占29.3%；FTA-ABS-IgM陰性者2363例，占70.7%；在1138例TPPA陽性，TRUST陰性的TP患者中，F(xiàn)TA-ABS-IgM陽性者12例，占1.05%；FTA-ABS-IgM陰性者1126例，占98.9%。兩種方法檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

2.4 TRUST不同滴度梅毒患者與FTA-ABS-IgM陽性率相關(guān)性

979例梅毒患者TRUST（Y）不同稀釋倍數(shù)與FTA-ABS-IgM陽性率（x）經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示兩者成對數(shù)相關(guān)。

擬合成回歸方程：Y = 20.489ln（x）-11.407；R2=0.9351。見圖1。

3 討論

人體感染TP后，機體可產(chǎn)生兩種抗體，非特異性TP抗體和特異性TP抗體[5]。特異性抗體主要包括IgM和IgG型抗體，特異性抗體出現(xiàn)早，消失晚，其中首先產(chǎn)生的是TP IgM抗體，在感染后2周即可測出，因此可作為早期感染且活動的血清學(xué)標(biāo)志物[6-7]。特異性IgG抗體在感染梅毒后4周左右產(chǎn)生，即使經(jīng)足量抗梅治療，TP抗原消失后很長時間，IgG抗體仍可終生在血清中檢出，可作為既往感染的梅毒血清學(xué)標(biāo)志物。目前國內(nèi)最為常用的檢測方法主要有TPPA和FTA-ABS。非特異性抗體，一般在感染后5～7周（或下疳出現(xiàn)后2～3周）產(chǎn)生，經(jīng)正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸降低滴度至轉(zhuǎn)為陰性；故可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征[8]，但可有血清固定現(xiàn)象。目前國內(nèi)最為常用的檢測方法是TRUST和RPR。

本研究結(jié)果顯示：TPPA和FTA-ABS-IgG在TP診斷中二者的陽性率均為100%，檢測結(jié)果高度一致，F(xiàn)TA-ABS是長期以來公認的TP抗體檢測金標(biāo)準。美國CDC已應(yīng)用FTA—ABS技術(shù)作為TP感染者確認試驗[9-10]，但其必須用熒光顯微鏡觀察驗證實驗結(jié)果，限制了臨床應(yīng)用。

本研究顯示：在3342例TPPA（+）TRUST（+）陽性的TP患者中，F(xiàn)TA-ABS-IgM陽性者979例，占29.3%，F(xiàn)TA-ABS-IgM陰性者2363例，占70.7%；FTA-ABS-IgM陽性提示體內(nèi)有活的TP存在，如果在治療中FTA-ABS-IgM為陰性，即使TRUST試驗為陽性，也可以推斷其喪失傳染性，可以繼續(xù)隨訪或判愈。有文獻報道[11-14]：抗梅毒治療后，如TP被完全清除，TP-IgM首先轉(zhuǎn)陰，是血清治愈的指標(biāo)；如TP-IgM持續(xù)陽性，則是梅毒感染并活動及再感染的重要血清學(xué)標(biāo)志。FTA-ABS-IgM轉(zhuǎn)陰早于TRUST，且其沒有血清固定現(xiàn)象，而TRUST在驅(qū)梅療效中會出現(xiàn)血清抵抗，因此FTA-ABS-IgM可以為梅毒活動性檢測和治療檢測提供補充資料。

在1138例TPPA（+），TRUST（-）的TP患者中，F(xiàn)TA-ABS-IgM陽性者占1.05% 。對于TPPA來說，雖然特異，但不能反映患者的感染狀況；FTA-ABS-IgM是反映梅毒現(xiàn)癥感染的指標(biāo)，只要有活的TP，IgM就會維持在一定水平，當(dāng)血清TP IgM消失，提示體內(nèi)沒有活的TP。治療后IgM仍為陽性，則提示體內(nèi)可能殘存TP；治療后血清TP IgM陰性的患者，隨訪時IgM再轉(zhuǎn)為陽性，表明患者再次感染[15-16]。同時，感染TP之后及出現(xiàn)癥狀體征之前2～4周的窗口期間，血清中只有IgM存在，可作為早期梅毒診斷和再感染的標(biāo)志物[17]。

同時研究顯示：在979例確診的TP患者中，隨著TRUST陽性稀釋倍數(shù)的增高，F(xiàn)TA-ABS-IgM陽性率呈升高趨勢，TRUST滴度在1∶1時，F(xiàn)TA-ABS-IgM的陽性率為0，TRUST滴度在1∶256時，F(xiàn)TA-ABS-IgM的陽性率達到92%，本研究顯示，979例確診的TP患者中，TRUST滴度高低和FTA-ABS-IgM的陽性率呈對數(shù)相關(guān)。提示TRUST滴度越高，現(xiàn)癥感染和再感染的概率大，活動性增強。

綜上所述，單一TP抗體檢測陽性存在一定不確定性，TP血清學(xué)檢測不同方法之間的敏感度、特異度不同，因此聯(lián)合檢測對于方法學(xué)之間的互補以及臨床診斷的準確性方面有著重要的作用[18]對于開展梅毒血清學(xué)試驗的實驗室，都應(yīng)該同時進行兩種梅毒抗體的檢測，必要時檢測IgM型抗體，TPPA作為公認的梅毒確診的理想檢查手段，其抗體在體內(nèi)持續(xù)存在，檢測結(jié)果不會因為病情的發(fā)展而變化[19-20]；TRUST法可用于觀察治療后梅毒患者的療效，F(xiàn)TA-ABS-IgM可協(xié)助臨床判定梅毒是否復(fù)發(fā)、再感染及臨床治愈，尤其在非特異性抗體陰性和治療后非特異性抗體持續(xù)陽性的情況下，可作為其他兩種方法的有效補充。

[參考文獻]

[1] Hesketh T，Zhu WX，Zhou XD. Syphilis and social up-heaval in China [J]. N Engl J Med，2010，363（11）：1088-1089.

[2] Cabe A，Rollin B，Pierre-Francois S，et al. Reemergence of syphilis in Martinique，2001-2008 [J]. Emerg Infect Dis，2010，16（1）：106-109.

[3] Casal CA，Silva MO，Costa IB. Molecular detection of Treponema pallidum sp.pallidum in bloodsamples of VDRL-seroreactive womenwith lethal pregnancy outcomes：a retrospective observational studyin northern Brazil [J]. Rev Soc Bras Med Trop，2011，44（4）：451-456.

[4] 衛(wèi)生部.WS273-2007 梅毒診斷標(biāo)準[S].

[5] Aktas G，Young H，Moyes A，et al. Evaluation of the fluorescent treponemal antibody absorption test for Detection of antibodies（immunoglobulins G and M）to Treponema pallidum in serologic diagnosis of syphilis [J]. Int J STD AIDS，2007，18（4）：255-260.

[6] 黃進梅，鄭和平.梅毒螺旋體特異性IgM抗體檢測的臨床評價[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，27（2）：108-110.

[7] 李武藝.不同檢測方法在梅毒血清學(xué)檢測中的應(yīng)用效果[J].臨床合理用藥，2016，9（5c）：161-162.

[8] Ebel A，Vanneste L，Cardinaels M，et al. Validation of the INNO‐LIA syphilis kit as confirmatory assay for treponema pallidumantibodies [J]. J Clin Microbiol，2000，38（1）：215-219.

[9] 武建國.梅毒實驗室診斷與相關(guān)問題[J].臨床檢驗雜志，2006，24（4）：316-320.

[10] 柯吳堅，楊斌.2015美國疾病控制中心性傳播疾病（梅毒）治療指南[J].皮膚性病診療學(xué)雜志，2015，22（4）：343-344.

[11] 馮凌思，余健全，陳航華，等.梅毒螺旋體的檢測方法和應(yīng)用探討[J].醫(yī)藥前言，2016，6（17）：126-127.

[12] 施辛.已治早期顯性梅毒患者血清RPR試驗和梅毒螺旋體IgM抗體檢查聯(lián)合隨訪[J].中華皮膚科雜志，2002， 35（4）：290-292.

[13] 李布榮，賀軍濤，張毅，等.梅毒螺旋體IgM抗體檢測的臨床意義[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，28（16）：1494-1496.

[14] 文海燕，張華榮，陳正明，等.梅毒檢測方法的研究進展[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2012，26（4）：354-357.

[15] Smith BC，Simpson Y，Morshed MG，et al. New proteins for a new perspective on syphilis diagnosis [J]. J Clin Microbi，2013，51（1）：105-111.

[16] 何玉清，鄧建華，楊日東，等.隱性梅毒患者血清抗梅毒螺旋體抗體的檢測及其臨床意義[J].新醫(yī)學(xué)，2004，35（3）：165-166.

[17] 何立娟，徐飛，袁慧.三種方法對梅毒的臨床診斷價值[J].中國醫(yī)藥，2015，10（12）：1856-1858.

[18] 李軍，王林娜，鄭和義.梅毒血清IgM抗體與傳染性的關(guān)系[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2012，178（7）：28-30.

[19] 顧偉鳴，楊陽，吳磊.梅毒血清學(xué)試劑性能評估方案的優(yōu)化及應(yīng)用[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2014，29（11）：1169-1174.

[20] Chua AC，Chen MI，Cavailler P，et al. Challenges of respondent driven sampling to assess sexual behaviour and estimate the prevalence of human immunodeficiency virus（HIV）and syphilis in men whohavesexwithmen（MSM）insingapore [J]. Ann Acad Med Singapore，2013，42（7）：350-353.