洛桑達(dá)哇 ，劉文磊，楊寶良，湯 鋒，王海久，久美彭措，樊海寧*

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧 810001；2.青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；4.青海省久美藏藥藥業(yè)有限公司 青海 西寧 810001)

多房棘球蚴病(alveolar echinocococosis，AE)又稱泡型包蟲(chóng)病，治療藥物主要為苯并咪唑衍生物，如阿苯達(dá)唑(ABZ)和甲苯咪唑，但這些藥物的主要作用是抗寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)，而不是殺滅寄生蟲(chóng)，同時(shí)有效率較低，長(zhǎng)期應(yīng)用后還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用[1]。因此，探索新藥物受到研究者的關(guān)注，也成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。經(jīng)過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)棘球蚴病的發(fā)生、病理變化有著較深的認(rèn)識(shí)，同時(shí)在實(shí)踐中總結(jié)了一些較為可靠的治療方法。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了中藥消包粉、漢防己甲素在小鼠的抗棘球蚴病的治療中有一定的效果，且漢防己甲素與阿苯達(dá)唑聯(lián)用時(shí)能增強(qiáng)阿苯達(dá)唑的療效[2]。本實(shí)驗(yàn)中所使用的藏藥久美2號(hào)屬于廣譜類(lèi)驅(qū)蟲(chóng)藥，其主要成分酸藤果、紫鉚子、天仙子等幾種藥材組成，用于治療鉤蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、施毛蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)病，本實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)、體外水平研究并觀察藏藥久美2號(hào)對(duì)小鼠多房棘球蚴病的對(duì)抗作用。

1 材料與方法

1.1 材料

藏藥久美2號(hào)(青海久美藏藥藥業(yè)有限公司)，RPMI-1640(Gibco公司)，青霉素-鏈霉素混合溶液(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)。振蕩混勻器(Thermo公司)，超聲破碎儀(冠森生物公司)，制冰機(jī)(上海析達(dá)儀器公司)，BT224S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，恒溫箱(中國(guó)常州國(guó)華公司)，純水制備器(Thermo公司)，制冰機(jī)(上海析達(dá)儀器公司)，BB150型培養(yǎng)箱(Thermo公司)，Axio Vert.A1型光學(xué)顯微鏡(蔡司公司)，微量加樣器(Eppdorf公司)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)康寧公司)。

SPF級(jí)BALB/c小鼠[7～8周齡，購(gòu)于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藏藥久美2號(hào)在體外對(duì)小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴原頭蚴的作用觀察

1.2.1.1 原頭蚴提取

在已感染多房棘球蚴的小鼠(取自青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)腹腔內(nèi)取出感染病灶組織，用含雙抗的PBS溶液(60μg/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素)沖洗數(shù)次后，在含雙抗的PBS溶液中將病灶剪碎，然后將含病灶碎片的溶液進(jìn)行兩次過(guò)濾(先后通過(guò)孔徑為150、30μm的聚酯紗)，過(guò)濾后得到的沉淀即為原頭蚴[3]，再用含雙抗的PBS沖洗三次后，若鏡檢活原頭蚴占90%左右即可進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.2.1.2 藥物處理

將久美2號(hào)水提物溶于RPMI1640培養(yǎng)液中，通過(guò)超聲破碎法配制成溶液(160mg/mL)備用。實(shí)驗(yàn)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(未加入藥物的培養(yǎng)基)。其中實(shí)驗(yàn)組分為高濃度組(16.0mg/mL)、中濃度組(8.0mg/mL)、低濃度組(1.6mg/mL)。

1.2.1.3 原頭蚴的體外培養(yǎng)及活性測(cè)定

在RPMI1640培養(yǎng)液中加入20%胎牛血清和雙抗(60μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)至終體積為40 mL，再將配好的培養(yǎng)基加入到已提取的原頭蚴中，使?jié)舛葹?1000～2000)個(gè)原頭蚴/mL，將所得原頭蚴溶液與濃度為160 mg/mL的藥物(高濃度組50μL，中濃度組25μL，低濃度組5μL)加入24孔板中，每孔0.5 mL，混勻后置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)，每天各組吸出一個(gè)孔(即0.5mL)中的混合溶液，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液染色，3 min內(nèi)進(jìn)行計(jì)數(shù)(鏡下觀察，死亡原頭蚴被染成藍(lán)色，未著色為活原頭蚴)，每次計(jì)數(shù)原頭蚴約300個(gè)。

1.2.2 藏藥久美2號(hào)在體內(nèi)對(duì)小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病的作用觀察

1.2.2.1 小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病體內(nèi)模型建立

將已感染多房棘球蚴的小鼠處死后，放置于75%酒精中浸泡60 s，取出后立即用無(wú)菌紗布擦拭干凈，并放置于無(wú)菌操作臺(tái)中，用已滅菌的鑷子和剪刀在小鼠腹腔中取出多房棘球蚴的病灶組織，放置于已加入青霉素(60μg/mL)、鏈霉素(100μg/mL)的PBS緩沖液中，用已滅菌的眼科剪剪碎，制成原頭蚴濃度為3000個(gè)/mL的懸液，然后取32只健康小鼠，經(jīng)腹腔注射已配好的等濃度的原頭蚴懸液(0.2mL/只)。

1.2.2.2 治療劑量計(jì)算及藥物處理

取人用藥劑量的12倍作為小鼠的治療劑量。將藏藥久美2號(hào)(0.6g/kg·d)、阿苯達(dá)唑(0.24g/kg·d)兩種藥物與無(wú)菌純水充分混合后進(jìn)行超聲破碎。

1.2.2.3 藥物治療

將32只小鼠分成四組，每組8只，分別為久美2號(hào)組、阿苯達(dá)唑組、模型對(duì)照組及空白對(duì)照組。用小鼠灌胃針以0.15 mL/10 g·d的劑量對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃治療，連續(xù)90 d。

1.2.2.4 藏藥久美2號(hào)和阿苯達(dá)唑連續(xù)用藥90 d后對(duì)小鼠多房棘球蚴病灶組織濕重和病灶囊重抑制率的計(jì)算

通過(guò)眼球取血法收取小鼠血液，完畢后處死小鼠并放置于75%酒精中，浸泡約1 min，待取出小鼠后立即用無(wú)菌紗布擦拭干凈，置于無(wú)菌操作臺(tái)中。直視下剖開(kāi)小鼠腹腔，游離并取多房棘球蚴組織， 測(cè)定病灶組織的重量， 計(jì)算小鼠多房棘球蚴的囊重抑制率[多房棘球蚴囊重抑制率(%)=(對(duì)照組多房棘球蚴囊重-治療組多房棘球蚴囊重)/對(duì)照組泡球蚴囊重×100 %]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 久美2號(hào)在體外對(duì)小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病原頭蚴的作用觀察

三組不同時(shí)間原頭蚴死亡率的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，組別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，時(shí)間與組別的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

組間分析，第1、3、6 d時(shí)，三組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第12 d時(shí)，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步做兩兩比較可知，16.0 mg/mL組高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，8.0 mg/mL組高于對(duì)照組和1.6 mg/mL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組和1.6 mg/mL組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第18 d時(shí)，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步做兩兩比較可知，對(duì)照組明顯低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，16.0 mg/mL組和8.0 mg/mL組明顯高于1.6 mg/mL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，16.0 mg/mL組和8.0 mg/mL組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組內(nèi)分析，對(duì)照組與16.0 mg/mL組、8.0 mg/mL組、1.6 mg/mL組不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步做兩兩比較可知，對(duì)照組表現(xiàn)為第1 d明顯低于第3、6、12、18 d(P<0.05)，第3 d明顯低于第12 d和第18 d(P<0.05)，其他兩兩時(shí)點(diǎn)間差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；16.0 mg/mL組、8.0 mg/mL組、1.6 mg/mL組均表現(xiàn)為第18 d>第12 d>第3 d和第6 d>第1 d，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第3 d和第6 d差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組別n第1 d第3 d第6 d第12 d第18 dFP對(duì)照組312.33±2.8921.33±2.52a25.67±1.53a29.67±2.52ab34.00±5.00ab24.8680.008久美2號(hào)(16mg/mL)組312.33±2.8928.33±2.08a29.33±3.51a50.67±3.51abcA66.67±2.89abcdA121.080<0.001久美2號(hào)(8mg/mL)組312.33±2.8926.67±4.73a28.67±1.53a42.67±1.53abcAB57.67±7.23abcdA54.5190.016久美2號(hào)(1.6mg/mL)組312.33±2.8925.67±1.53a27.00±5.29a33.67±1.53abcBC48.33±3.51abcdABC48.0500.008F <0.001 3.031 0.731 45.429 23.846 - -P 1.000 0.093 0.562 <0.001 <0.001 - -

a：與第1 d比較，P<0.05；b：與第3 d比較，P<0.05；c：與第12 d比較，P<0.05；d：與第12 d比較，P<0.05；A：與對(duì)照組比較，P<0.05；B：與16.0 mg/mL組比較，P<0.05；C：與8.0 mg/mL組比較，P<0.05。

圖1 培養(yǎng)18d期間對(duì)照組與不同濃度藥物組原頭蚴死亡率的比較圖

A：對(duì)照組3 d后觀察結(jié)果；B：8.0 mg/mL組干預(yù)3 d后觀察結(jié)果；C：16.0 mg/mL組干預(yù)6 d后觀察結(jié)果；D：1.6 mg/mL組干預(yù)12 d后觀察結(jié)果；E：8.0 mg/mL組干預(yù)12 d后觀察結(jié)果；F：16.0 mg/mL組干預(yù)12 d后觀察結(jié)果；G：對(duì)照組18 d后觀察結(jié)果；H：8.0 mg/mL組干預(yù)18 d后觀察結(jié)果；I：16.0 mg/mL組干預(yù)18 d后觀察結(jié)果。圖中→ 表示失去正常形態(tài)的原頭蚴。

圖2光鏡下不同濃度藥物干預(yù)后原頭蚴的形態(tài)圖(40×)

Figure2MorphologicalmapoftheProtoscolexofechinococcusmultilocularisafterinterventionwithdifferentconcentrationsunderlightmicroscope(40×)

圖2為光鏡下不同濃度藥物干預(yù)組原頭蚴的形態(tài)，A圖可以看到正常原頭蚴形態(tài)(活動(dòng)正常，胞體飽滿，被摸完整，頂突存在，鉤體結(jié)構(gòu)正常，微毛排列整齊)；8.0 mg/mL組干預(yù)3 d后(B圖)原頭節(jié)胞體皺縮數(shù)量明顯增多；16.0 mg /mL組干預(yù)6 d(C圖)、1.6 mg/mL組干預(yù)12 d(D圖)、8.0 mg/mL組干預(yù)12 d后(E圖)原頭蚴胞體皺縮數(shù)量明顯增多的同時(shí)，死亡率也較對(duì)照組有明顯差異；16.0 mg/mL組干預(yù)12 d后(F圖)除了原頭蚴死亡數(shù)量增多、胞體皺縮增多外，還可看到大量的鈣粒漏出；在16.0 mg/mL組干預(yù)18 d后(I圖)其視野內(nèi)已經(jīng)看不到正常形態(tài)的原頭蚴，除之前觀察的結(jié)果外，還發(fā)現(xiàn)有大量的胞體碎片和鈣小體，頂突上的鉤體排列紊亂，基本脫落，微毛排列紊亂，其中少量原頭蚴雖失去了正常原頭蚴形態(tài)，但在臺(tái)盼藍(lán)染色過(guò)程中拒染，所以未被視作死亡原頭蚴。

2.2 久美2號(hào)在體內(nèi)對(duì)小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病的作用觀察

久美2號(hào)和阿苯達(dá)唑連續(xù)用藥90 d后小鼠多房棘球蚴病灶組織濕重和病灶囊重抑制率的計(jì)算結(jié)果如表2～3所示。久美2號(hào)組和阿苯達(dá)唑組連續(xù)用藥90 d后與模型對(duì)照組相比較：在小鼠體內(nèi)多房棘球蚴病灶組織濕重的數(shù)值上的差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且其中久美2號(hào)組和模型對(duì)照組相比差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0039，P<0.01)，阿苯達(dá)唑組與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0164，P<0.05)，久美2號(hào)組與阿苯達(dá)唑組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.2053)；在小鼠多房棘球蚴病灶囊重抑制率方面，久美2號(hào)組和阿苯達(dá)唑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.2103)；三組多房棘球蚴濕重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步做兩兩比較可知，藏藥久美2號(hào)組、阿苯達(dá)唑組明顯低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藏藥久美2號(hào)組與阿苯達(dá)唑組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Table 2Comparison of wet weights of three groups of

*：與久美2號(hào)組比較，P<0.05；#：與阿苯達(dá)唑組比較，P<0.05。

藏藥久美2號(hào)組、阿苯達(dá)唑組分別有4例、3例抑制，抑制率分別為57.1%和42.9%，兩組抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3兩組囊重抑制率比較結(jié)果[n(%)]

Table 3Comparison of cystic weight inhibition rates in two groups[n(%)]

3 討論

AE是多房棘球蚴所致的一種嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病。高發(fā)于青海省三江源和四川交界地域，其具有發(fā)病范圍廣、惡性程度高、預(yù)后效果差的特點(diǎn)。目前用于治療AE的有效藥物很少，主要為甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑，但因其溶解性差，腸道吸收率及生物利用度低，療效不穩(wěn)定，治療效果不盡人意。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，很多研究者做了一些這方面的探索，王軼等人[4]研究發(fā)現(xiàn)，川穹嗪聯(lián)合阿苯達(dá)唑治療小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病，發(fā)現(xiàn)對(duì)多房棘球蚴有明顯的抑制效果，而且兩者聯(lián)合使用比單獨(dú)使用效果更佳，證明兩者間有協(xié)同治療作用。李小娟[5]研究發(fā)現(xiàn)，蒿甲醚在體外也對(duì)多房棘球蚴原頭蚴有一定的破壞作用；陳根等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素和阿苯達(dá)唑可單獨(dú)或聯(lián)合用藥于小鼠繼發(fā)性泡球蚴病，在聯(lián)合使用的時(shí)候，漢防己甲素能有效增強(qiáng)阿苯達(dá)唑的效果，兩者具有一定的協(xié)同作用；張睿等人[7]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿對(duì)小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴病有一定的治療作用，并能增強(qiáng)阿苯達(dá)唑?qū)π∈罄^發(fā)性多房棘球蚴病的療效。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯聯(lián)合阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體抑制包蟲(chóng)的復(fù)發(fā)作用不佳[8]。

本研究首次從體內(nèi)、體外綜合水平驗(yàn)證了藏藥久美2號(hào)對(duì)抗多房棘球蚴及原頭蚴生長(zhǎng)的抑制作用，證明此藥物對(duì)多房棘球蚴病有一定的療效，并且在體內(nèi)對(duì)小鼠繼發(fā)性多房棘球蚴的抑制作用明顯優(yōu)于阿苯達(dá)唑。由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)有限，未能以電鏡下所觀察結(jié)果來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證此藏藥對(duì)原頭蚴的作用。未來(lái)我們將進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)，證明此藥對(duì)多房棘球蚴病具有療效的同時(shí)，對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。