王睿智，任立汆，加楊娥，燕華玲#

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科；2.西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院；3.重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院)

對黑果枸杞多糖(LyciumRuthenicumMurr.polysaccharide)的研究主要集中在其抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等方面[1-3]。本文通過觀察經(jīng)黑果枸杞多糖處理過的HaCaT細(xì)胞，及其對UVB輻射后的增殖活力和p16蛋白表達(dá)水平的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

黑果枸杞，經(jīng)青海大學(xué)藥理教研室鑒定，為柴達(dá)木野生黑果枸杞。HaCat細(xì)胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG二抗購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；p16(Abcam，ab51243)單克隆抗體購自英國abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測試劑盒購自北京Solarbio科技有限公司；飛利浦TL20W/12紫外線UVB燈管購自上海杰圖商貿(mào)有限公司；UVB輻照度監(jiān)示器購自臺灣路昌公司；X-Mark型BIO-RAD酶標(biāo)儀購自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.2 HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：將細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中(37℃、5% CO2)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)90%融合度時，將HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為3組，對照組：不接受UVB輻射；UVB輻射組：予30 mJ/cm2的UVB輻射；UVB組(30mJ/cm2)+黑果枸杞多糖組：加入黑果枸杞多糖(2mg/mL)6 h后移除各組中的培養(yǎng)基，用少量PBS沖洗2次，再加入少量PBS覆蓋后進(jìn)行輻射(30mJ/cm2UVB)。輻射后置于DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測：用MTS法檢測細(xì)胞增殖。每孔中加入MTS溶液20 μL，置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中，繼續(xù)孵育3 h。終止培養(yǎng)后，在490 nm 波長處測定各孔吸光度并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力

表1顯示，UVB輻射后細(xì)胞活性下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明UVB輻射可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生凋亡。經(jīng)黑果枸杞多糖干預(yù)后的HaCaT細(xì)胞活性升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 p16蛋白表達(dá)水平

圖1及表2顯示，UVB輻射組及UVB輻射+黑果枸杞多糖組的p16蛋白表達(dá)均升高，但UVB輻射+黑果枸杞多糖組不如單純UVB輻射組明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示黑果枸杞多糖具有抑制UVB誘導(dǎo)的p16蛋白表達(dá)升高的作用。

Table 1HaCaT cells proliferative activity in each

☆：表示與對照組相比，UVB輻射組HaCaT細(xì)胞增殖活性下降(P<0.05)；＊：表示與UVB輻射組比較，UVB輻射+黒果枸杞多糖組的HaCaT細(xì)胞增殖活性上升(P<0.05)。

☆：Show that compared with control group，HaCaT cell proliferative activity decrease in UVB-irradiated group(P<0.05)；*：Show that compared with UVB-irradiated group，a increase in UVB-irradiated+LyciumRuthenicumMurr.polysaccharide group(P<0.05).

1：對照組；2：UVB輻射組；3：UVB輻射+黑果枸杞多糖組

1：control group；2：UVB-irradiated group；3：UVB-irradiated+LyciumRuthenicumMurr.polysaccharide group

圖1黑果枸杞多糖對UVB輻射誘導(dǎo)HaCat細(xì)胞p16蛋白表達(dá)的影響圖

Figure1TheeffectofLyciumRuthenicumMurr.polysaccharideonUVB-inrradiatedHaCatcellsp16proteinexpression

Table 2Protein expression levels of p16 in each

注：與對照組相比，UVB輻射組及UVB輻射+黑果枸杞多糖組中p16蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與UVB輻射組相比，UVB輻射+黑果枸杞多糖組p16蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。

Note：Compared with control group，protein expression of p16 in HaCaT cells.increase in UVB-irradiated group，and UVB-irradiated+LyciumruthenicumMurr.polysaccharide group(P<0.05)；compared with UVB-irradiated group，a decrease in UVB-irradiated+LyciumruthenicumMurr.polysaccharide group(P<0.05).

圖2 各組HaCaT細(xì)胞P16蛋白的表達(dá)水平比較圖

3 討論

UVB(290～320nm)是導(dǎo)致皮膚光老化的最主要因素，UVB穿透能力較差。由角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCat細(xì)胞)組成的表皮層是皮膚最外層的結(jié)構(gòu)，所以HaCat細(xì)胞即成為UVB最主要的靶細(xì)胞。長期過量的UVB輻射至皮膚表面時，被最表層的HaCat細(xì)胞吸收，并在其線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS可抑制超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性，使其清除ROS能力大大降低，進(jìn)一步導(dǎo)致ROS堆積，造成ROS的產(chǎn)出和清除的失衡，高濃度的ROS可破壞DNA的結(jié)構(gòu)而引發(fā)DNA損傷應(yīng)答[7]，或者直接調(diào)控衰老相關(guān)信號通路[8]，促進(jìn)細(xì)胞衰老的發(fā)生。本研究模擬自然光照射至地面的強(qiáng)度(30mJ/cm2)建立細(xì)胞損傷模型。結(jié)果顯示，經(jīng)UVB輻射后的HaCat細(xì)胞增殖活性明顯降低，推測UVB輻射HaCat細(xì)胞后發(fā)生氧化應(yīng)激(reactive oxygen )，產(chǎn)出大量ROS引發(fā)了DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖。本研究所選生長在青海省柴達(dá)木盆地的黑果枸杞富含豐富的黑果枸杞多糖。與普通紅果枸杞相比，黑果枸杞中多糖含量(4.201mg/g)顯著高于紅果枸杞的多糖(2.582mg/g)含量。[1]加楊娥等研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖可通過上調(diào)SOD、CAT等抗氧化酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量及下調(diào)丙二醛(MDA)水平來降低UVB導(dǎo)致的過氧化現(xiàn)象，進(jìn)而緩解氧化損害，提高細(xì)胞增殖活性。[9]本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)先加入黑果枸杞多糖干預(yù)的HaCat細(xì)胞增殖活性較UVB組，所受影響相對較小，提示黑果枸杞多糖可促進(jìn)UVB輻射后HaCat細(xì)胞增殖。

p16蛋白由定位于9p21的INK4a/ARF基因編碼，其N端具有與細(xì)胞周期蛋白cyclin D同源結(jié)構(gòu)，能與cyclin D競爭結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6(cyclin-dependent kinase，CDK4/6)，影響CDK4/6視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb蛋白)的磷酸化及接下來轉(zhuǎn)錄因子E2F的激活，阻止細(xì)胞周期通過G1/S監(jiān)測點(diǎn)，使細(xì)胞周期停滯[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，p16蛋白的高表達(dá)并不單一地通過Rb發(fā)生作用，在應(yīng)激情況下，p38基因和p16基因的表達(dá)具有相關(guān)性[9]。Ito等[10]研究表明，UVB誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS可激活p38MAPKs信號通路，上調(diào)p16和p19ARF的表達(dá)，限制小鼠造血干細(xì)胞的自我更新能力。本實(shí)驗(yàn)中，對照組僅表達(dá)少量p16蛋白，經(jīng)UVB輻射后的HaCat細(xì)胞p16蛋白表達(dá)顯著增加，黑果枸杞多糖預(yù)處理后的HaCat細(xì)胞p16蛋白表達(dá)則明顯下調(diào)，推測UVB輻射后的HaCat細(xì)胞中有大量ROS堆積，從而激活p38MAPKs信號通路，繼而上調(diào)p16蛋白表達(dá)，致其表達(dá)升高，激活CDK4/6促進(jìn)Rb蛋白磷酸化使HaCat細(xì)胞有絲分裂停滯在G1/S期，加速細(xì)胞衰老進(jìn)程。此結(jié)果與劉凌[11]等研究結(jié)果一致。黑果枸杞多糖可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)清除ROS堆積，同時阻斷p38MAPKs信號通路，下調(diào)p16蛋白表達(dá)，從而達(dá)到減輕光老化的目的。

綜上所述，黑果枸杞多糖可對抗UVB對HaCat細(xì)胞造成的光老化損傷，并通過下調(diào)p16蛋白的表達(dá)提高細(xì)胞增殖活性。