李龍昱，米云昊，李向陽(yáng)

(1.青海省人民醫(yī)院藥學(xué)部；2.承德醫(yī)學(xué)院；3.青海大學(xué))

目前未見(jiàn)對(duì)麻花秦艽多糖提取工藝的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬采用超聲輔助提取法提取青竹葉多糖，通過(guò)單因素考察對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

麻花秦艽(GentianastramineaMaxim.)取自于本院中藥房。粉碎后過(guò)20目篩備用。

恒溫干燥箱(DGG-9003，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；酒精計(jì)(廣州宇宙玻璃儀器廠)；WIGGENS UE03SFD型超聲波清洗器(北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所)；高速冷凍離心機(jī)(GL-20C型，英泰儀器有限公司)；FA1204C電子分析天平(精科天美儀器有限公司)；UV759掃描型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(青島聚創(chuàng)儀器有限公司)；Joanlab電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋(寧波市群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚(沸程30℃～60℃)、丙酮、戊醇、乙醚、濃硫酸、苯酚(分析純，天津市百世化工有限公司)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品(分析純，天津市百世化工有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麻花秦艽多糖的提取

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

采用苯酚-硫酸法測(cè)定麻花秦艽多糖的含量，方法依據(jù)參考文獻(xiàn)略做改動(dòng)[6]。精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入一定量純凈水于容量瓶中，定容至刻度，使成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于試管中，加入純凈水至1 mL，加入重蒸苯酚(5%)1.0 mL，充分劇烈震搖后沿管壁緩慢加入濃硫酸5.0 mL，室溫放置5 min。于沸水中充分反應(yīng)10 min后用冰水沖洗5 min，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各樣本的吸光度值。同法用純凈水制備空白對(duì)照組。以濃度為橫坐標(biāo)(x)、吸光度為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 麻花秦艽中多糖含量的測(cè)定

取1.0 mL脫蛋白后的待測(cè)多糖溶液，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的各步驟分別加顯色劑，測(cè)定各組的吸光度值。多糖的提取率計(jì)算公式：

多糖提取率(%)=[(C1×V1)/m1×103]×100%

式中C1為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的多糖的濃度(mg/mL)；V1為待測(cè)液的總體積(mL)；m1為稱取的青竹葉的質(zhì)量(g)。

1.2.4 麻花秦艽多糖提取的單因素考察

1.2.4.1 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

1.2.4.2 液料比對(duì)多糖提取率的影響

1.2.4.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

1.2.4.4 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

圖1示，根據(jù)吸光度和濃度繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸方程： y=7.3073x-0.0076，R2=0.9993。

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure1Thestandardcurveofglucose

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

考察超聲提取次數(shù)(1、2、3、4次)對(duì)多糖提取率的影響，按2.1項(xiàng)下方法計(jì)算多糖的提取率。結(jié)果分別為1.351%、1.978%、2.046%、1.932%，由圖2可知當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí)提取率幾乎不變，隨著提取次數(shù)的增加，濃縮過(guò)程也增加致多糖損失量增加。故將提取次數(shù)定為2次。

圖2超聲提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響圖

Figure2TheeffectofUltrasonicextractionfrequencyontheextractionrateofpolysaccharides

2.2.2 液料比對(duì)多糖提取率的影響

圖3液料比對(duì)多糖提取率的影響圖

Figure3Theeffectofliquidratioonextractionrateofpolysaccharides

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

如圖4所示，當(dāng)超聲時(shí)間在60～120 min內(nèi)，麻花秦艽多糖的提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)120 min后多糖的提取率無(wú)顯著的提高。故將提取時(shí)間定為60～120 min。

圖4提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響圖

Figure4Theeffectofextractiontimeontheextractionrateofpolysaccharides

2.2.4 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

圖5示，超聲功率在從300 W升高到800 W時(shí)，提取率明顯增加，功率在400～800 W時(shí)，多糖提取率顯著性增大。故將功率范圍定為400～800 W。

圖5超聲功率對(duì)多糖提取率的影響圖

Figure5TheeffectofUltrasonicpowerontheextractionrateofpolysaccharides

2.3 以響應(yīng)曲面法優(yōu)化的麻花秦艽多糖提取工藝

2.3.1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素的實(shí)驗(yàn)水平及編碼

Table 1The experimental levels and codes in different factors of experimental design

表2Box-Behnken試驗(yàn)響應(yīng)值(多糖提取率)

Table 2Box-Behnken experimental response value(extraction rate of polysaccharides)

2.3.2 模型的擬合

利用Design Expert軟件(Design-Expert v.8.0.5b，Stat-Ease Inc.，Minneapolis，USA)對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元二次擬合方程模型：

Y=2.14+0.11X1+0.11X2+0.29X3+0.22X1X2-0.11X1X3+0.087X2X3-0.094X12-0.26X22+0.024X32

這里的X1、X2、X3分別是被測(cè)變量液料比、提取時(shí)間和提取功率的編碼值。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，模型F=18.07，P<0.001，表明該回歸模型具有顯著差異，如表3所示。從回歸模型項(xiàng)目的各系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型一次項(xiàng)X3極顯著性，X1、X2具有顯著性；交互項(xiàng)X1X2具有顯著性，而X1X3、X2X3不具有顯著性；二次項(xiàng)X22具有極顯著性，表明各因素對(duì)多糖的提取率影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素參數(shù)選擇是成功的。

表3二次多項(xiàng)式方差分析結(jié)果

Table 3The results of Quadratic polynomial variance analysis

2.3.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)表3中回歸分析的結(jié)果，用Design Expert軟件作出模型的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，為圖6-8所示。

圖6超聲時(shí)間與液料比對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

Figure6Theeffectofextractedtimeandliquidratioonextractionrateofpolysaccharides

圖6示，當(dāng)超聲功率固定時(shí)，超聲時(shí)間和液料比對(duì)多糖提取率的影響十分顯著，表現(xiàn)為坡度較陡的曲線。開(kāi)始階段，提取率隨著時(shí)間增加顯著提高，當(dāng)達(dá)到一定的提取時(shí)間后，提取率反而下降，提示多糖在超聲過(guò)程中可能因?yàn)樘崛r(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)一定的鍵斷裂而引起提取率的降低。

圖7超聲功率與液料比對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

Figure7TheeffectofUltrasonicpowerandliquidratioonextractionrateofpolysaccharides

圖7示，超聲功率對(duì)多糖提取率的影響較顯著，而液料比對(duì)多糖提取率影響相對(duì)較小。但超聲功率過(guò)大同樣也會(huì)造成多糖的鍵斷裂而引起提取率的降低。

圖8超聲功率與時(shí)間對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

Figure8TheeffectofUltrasonicpowerandtimeonextractionrateofpolysaccharides

圖8示，超聲時(shí)間和超聲功率增加，多糖的提取率迅速隨之增加，之后呈略有下降趨勢(shì)。用Design Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析，確定提取麻花秦艽多糖的最佳提取工藝條件：液料比為60 mL/g，設(shè)定功率為800 W，超聲提取時(shí)間為90 min，殘?jiān)偬崛∫淮危碚摰穆榛ㄇ剀炊嗵堑奶崛÷蕿?.36%。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取麻花秦艽粉末(過(guò)20目篩)適量，加入60倍量的水，設(shè)定超聲功率為800 W，每次提取90 min，提取兩次，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖的提取率，試驗(yàn)重復(fù)5次，計(jì)算平均值，結(jié)果如表5所示，五組實(shí)驗(yàn)多糖的平均提取率為2.363%，與預(yù)測(cè)值相差甚微，RSD值為0.48%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用的響應(yīng)曲面法可行，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

表4驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

Table 4The results of Confirmatory test

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化麻花秦艽中多糖的超聲輔助提取工藝參數(shù)。優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可以高效提取麻花秦艽多糖。