馬金華，王麗娟，李進(jìn)章，馬金蘭，駱玉霜，沈存芳，馬金祥，李 豪，徐曉寧

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

青海地區(qū)位于青藏高原，胃癌屬該地高發(fā)腫瘤[1-2]。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)是參與缺氧應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，可以對(duì)多種基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，并介導(dǎo)某些病理過(guò)程[3-4]。現(xiàn)有研究證實(shí)HIF-1SNP與胃癌發(fā)病相關(guān)，HIF-2α單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與胃癌是否相關(guān)未見(jiàn)報(bào)道。本研究在基因水平檢測(cè)藏族健康者及胃癌患者血液HIF-2αSNP，分析兩者在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能存在的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

在青海大學(xué)附屬醫(yī)院、青海省人民醫(yī)院、青海省藏醫(yī)院，收集2014年11月～2016年12月體檢的世居青海的藏族健康者外周血62例作為對(duì)照組、45例胃癌患者外周血作為胃癌組。胃癌組男性29例，女性16例；年齡為20～79歲，平均年齡為(48.26±7.32)歲；所有患者病理分型皆為腺癌。對(duì)照組男性38例，女性24例；年齡為22～83歲，平均年齡為(46.45±6.51)歲；所有患者病理分型皆為腺癌。一般資料具有可比性(P<0.05)。本課題經(jīng)過(guò)青海大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器

PCR擴(kuò)增儀(Verity 96well，美國(guó) ABI)，凝膠成像儀(Gene Genius，英國(guó)Syngene)，3730XL測(cè)序儀(美國(guó) ABI)。

1.2.2 試劑

DNA marker(加拿大 BBI公司)，基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程有限公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血樣標(biāo)本收集

空腹靜脈采集胃癌組和對(duì)照組成員外周血，作EDTA抗凝處理。

1.3.2 基因組DNA提取

取上述血液樣品，嚴(yán)格按照上海生工生物工程有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒要求提取DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整度，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)其含量及純度后保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)和合成

通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)的GenBanb獲取HIF-2α基因序列及其相應(yīng)位點(diǎn)的SNP信息。并采用PrimerExpress 2.0軟件(美國(guó)Applied Biosystem Ine.)輔助設(shè)計(jì)引物。所有引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表 1。

1.3.4 PCR擴(kuò)增

以基因組DNA為模板，將HIF-2α rs13419896、rs7598371、rs6715787的引物分別建立25 μL PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 0.5 μL，Taq buffer 2.5 μL，Taq酶(5U/μL)0.2 μL，ddH2O 14.8 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。上述反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，在1%瓊脂糖凝膠上電泳(100V)40 min，用溴化乙錠染色后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)照相并保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物有限公司測(cè)序并進(jìn)行 SNP 技術(shù)分型，根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定基因型和基因頻率。

表1HIF-2αrs13419896、rs7598371、rs6715787SNP位點(diǎn)引物序列及擴(kuò)增片段大小

Table 1The order of sequence and the size of amplification fragment

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)照組基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0軟件，各基因型分布差異采用χ2檢驗(yàn)，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA電泳檢測(cè)結(jié)果

胃癌組和對(duì)照組血液做基因組DNA提取后，行DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并通過(guò)凝膠成像儀成像，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1-8：對(duì)照組，9-16：胃癌組，M：marker

圖1基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure1TheagaroseelectrophoresispictureofgenomeDNA

圖1示，基因組DNA提取成功，條帶清晰，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

以2.1所述基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2～4。

圖2HIF-2αrs13419896基因PCR擴(kuò)增圖

Figure2TheHIF-2αrs13419896genePCRamplification

圖3 HIF-2α rs7598371基因PCR擴(kuò)增圖

1-3：對(duì)照組，4-6：胃癌組，M：marker

圖2～4示，HIF-2α rs13419896、rs7598371和rs6715787位點(diǎn)擴(kuò)增片段大小分別在562 bp、621 bp和513 bp處。

2.3 測(cè)序結(jié)果

圖5HIF-2αrs13419896SNP基因型圖

Figure5ThepictureofHIF-2αrs13419896SNPgenotype

圖6 HIF-2α rs7598371 SNP基因型圖

圖7 HIF-2α rs6715787 SNP基因型圖

圖5～7示，HIF-2α rs13419896 SNP基因型分別為A/A、A/G、G/G型，rs7598371 SNP基因型分別為C/C、C/G、G/G型，rs6715787 SNP基因型分別為C/G、C/C、G/G型。

2.4 基因型和基因頻率在兩組中的分布結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果示，rs13419896SNP基因型分別為A/G、G/G、A/A，rs7598371SNP基因型分別為C/G、C/C、G/G，rs6715787SNP基因型分別為C/G、C/C、G/G。對(duì)照組檢驗(yàn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律(rs13419896SNP：χ2=3.07，P>0.05；rs7598371SNP：χ2=1.54，P>0.05；rs6715787SNP：χ2=2.28，P>0.05)。rs13419896的A/G、G/G、A/A基因型頻率在胃癌組中分別為28.89%、28.89%、42.22%，在對(duì)照組中的頻率分別為38.71%、27.42%、33.87%。rs7598371的C/G、C/C、G/G基因型頻率在胃癌組分別為26.67%、35.56%、37.78%，在對(duì)照組分別為41.94%、25.81%、32.26%。rs6715787的C/G、C/C、G/G基因型頻率在胃癌組分別為35.56%、40.00%、24.44%，在對(duì)照組分別為40.32%，32.26%、27.42%。其中rs13419896位點(diǎn)的基因型分布頻率在胃癌組中A/A型最高，在對(duì)照組中A/G型最高。rs7598371位點(diǎn)的基因型分布頻率在胃癌組中G/G型最高，在對(duì)照組中C/G型最高。rs6715787位點(diǎn)的基因型分布頻率在胃癌組中C/C型最高，在對(duì)照組中C/G型最高，經(jīng)χ2檢驗(yàn)示，胃癌組與對(duì)照組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具體數(shù)值見(jiàn)表2～4。

表2rs13149896基因型和等位基因頻率分析結(jié)果表(%)

Table 2The analysis of rs13149896 genotype and allele frequency(%)

表3rs7598371基因型和等位基因頻率分析結(jié)果表(%)

Table 3The analysis of rs7598371 genotype and allele frequency(%)

表4rs6715787基因型和等位基因頻率分析結(jié)果表(%)

Table 4The analysis of rs6715787 genotype and allele frequency(%)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，青海地區(qū)藏族HIF-2α基因單核苷酸多態(tài)性與藏族胃癌易感性無(wú)關(guān)。

胃癌是青海地區(qū)高發(fā)腫瘤。有學(xué)者提出，各地區(qū)、各民族胃癌發(fā)生率不同的原因是胃癌的發(fā)生為多重基因、多種因素共同作用的結(jié)果[5]。臨床上對(duì)HIF-1α與HIF-2α的研究比較多[6]。其中，HIF-1是調(diào)節(jié)亞基，它于1992年被Semenza等人發(fā)現(xiàn)。其可調(diào)控VEGF的表達(dá)，以此控制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。HIF-2α是HIF-1的功能亞基，其可識(shí)別并結(jié)合調(diào)控基因中的缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)調(diào)控下游基因合成，以此調(diào)節(jié)腫瘤血管生成、浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等[8-10]。HIF-2α是參與缺氧調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，在生物體的正常生理調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[11，12]。HIF-2α與胃癌的關(guān)系同樣十分密切，2010年Wang等人研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α在胃癌中的作用類似HIF-1α，提示 HIF-2α在胃癌的病理階段和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[13]。因此，HIF是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療研究的熱點(diǎn)[14]。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是由基因組核苷酸水平上的變異引起的，絕大多數(shù)SNPs本身雖不是易感性的原因，但在全基因組范圍內(nèi)比較易感和非易感人群之間的SNP圖譜，可顯示易感人群基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并通過(guò)關(guān)聯(lián)分析尋找易感基因。

研究青海地區(qū)藏族HIF-2α基因rs13419896、rs7598371、rs6715787位點(diǎn)的多態(tài)性以及它們與胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性具有重要意義。若能明確它們的相關(guān)性，便可以為高危人群提供預(yù)警信號(hào)[15]。本研究采用的主要研究技術(shù)為“巢式PCR-RFLP”基因分型技術(shù)，這種技術(shù)相比較于傳統(tǒng)的SNP分型技術(shù)來(lái)講，可以對(duì)任何位點(diǎn)行常規(guī)性限制內(nèi)切酶鑒定，同時(shí)該SNP分型技術(shù)利用巢式PCR技術(shù)，使得對(duì)多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行分析成為可能。而SNP分型技術(shù)只能對(duì)有酶切位點(diǎn)的部位進(jìn)行切割，這就在一定程度上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析。因此，即便所得的DNA濃度較低，也可以對(duì)其進(jìn)行快速的分型[16]。青藏高原為低氧環(huán)境，患者體內(nèi)的HIF-2α容易被過(guò)度激活，導(dǎo)致患者體內(nèi)的紅細(xì)胞明顯增多及組織血管生成紊亂，進(jìn)一步導(dǎo)致高原病的發(fā)生。而長(zhǎng)期篩選形成的基因多態(tài)性對(duì)于藏族人群來(lái)講，可以使其適應(yīng)高原的環(huán)境，在低氧環(huán)境下亦能滿足自身的需求。有學(xué)者認(rèn)為基因多態(tài)性是對(duì)種族的正選擇。我國(guó)和日本、英國(guó)、加拿大、美國(guó)以及尼日利亞科學(xué)家共同合作創(chuàng)建了HapMap項(xiàng)目，此項(xiàng)目的主要目的是為了確定人類遺傳基因的相似性以及差異性，以此來(lái)揭示多態(tài)信息的單體型圖，探究遺傳基因的奧秘。現(xiàn)階段，HapMap標(biāo)簽單核苷酸分布(SNPs)數(shù)據(jù)已然成為了科研中的參考數(shù)據(jù)之一。在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，并將其信息與HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)，可發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異基因與疾病之間的關(guān)系[17]。

腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的相同點(diǎn)是，在生長(zhǎng)過(guò)程中皆會(huì)出現(xiàn)局部的缺血，進(jìn)而導(dǎo)致氧氣供應(yīng)不足。HIFα家族轉(zhuǎn)錄因子是生物體對(duì)缺氧條件做出應(yīng)答的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。在腫瘤中，HIF蛋白會(huì)因VHL基因的突變使其失調(diào)，這一基因的突變會(huì)阻礙VHL通過(guò)其泛素連接酶活性對(duì)HIF蛋白起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。這一觀點(diǎn)已經(jīng)在HIF-2α中得到了證實(shí)，HIF-2α是HIF的一種異構(gòu)體形式，這種形式在VHL突變型腫瘤中很容易發(fā)生上調(diào)，最近有報(bào)道稱其是腫瘤干細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)因素。然而，我們還不清楚有哪些信號(hào)傳導(dǎo)作用將干細(xì)胞的內(nèi)在轉(zhuǎn)錄作用機(jī)制與腫瘤中HIF-2α調(diào)節(jié)作用機(jī)制聯(lián)系在一起[18]。

HIF-1α的表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)是有氧濃度依耐性的，氧誘導(dǎo)的羥化酶的作用途徑是調(diào)節(jié)HIF-1最重要的途徑。

HIF-1α轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，特別是廣為人知的HIF-2α(亦稱EPAS1)，會(huì)在腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)而且是維護(hù)腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)所必需的。然而ID2在CSCs中通過(guò)哪些途徑促進(jìn)HIF-2α在腫瘤干細(xì)胞中積累我們并不清楚。在此我們報(bào)道DYRK1A和DYRK1B激酶會(huì)對(duì)ID2上的27號(hào)蘇氨酸(Thr27)進(jìn)行磷酸化。缺氧條件會(huì)通過(guò)使DYRK1A和DYRK1B的失活而使這種磷酸化作用降低。這些激酶的活性會(huì)在常氧的條件下通過(guò)對(duì)氧具有感知作用的脯氨酰羥化酶PHD1(亦稱EGLN2)被激活。ID2會(huì)與VHL泛素連接酶復(fù)合物結(jié)合，取代與VHL有相關(guān)性的Cullin 2，對(duì)HIF-2α的泛素化和降解作用進(jìn)行破壞。由DYRK1對(duì)ID2的Thr27的磷酸化作用會(huì)阻斷ID2與VHL的相互作用，從而維護(hù)HIF-2α的泛素化作用[19]。

綜上所述，探究藏族HIF-2α基因位點(diǎn)的多態(tài)性以及它們與胃癌的相關(guān)性具有積極意義。本研究結(jié)果尚待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和更進(jìn)一步的分型人群確認(rèn)。