孫遜沙 吳潔瑩 陳勁松 陸琰 喻秋霞 李茹 王丹 李焱 吳韶清

[摘要] 目的 探討環(huán)狀RNA在人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞低氧預處理和常氧培養(yǎng)中表達譜的差異。 方法 利用芯片技術(shù)檢測3例低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞及其相應對照的常氧培養(yǎng)細胞的環(huán)狀RNA表達，分析兩者差異表達的環(huán)狀RNA及其結(jié)合miRNA。 結(jié)果 在檢測的13 617條環(huán)狀RNA中，有分析結(jié)果的環(huán)狀RNA 12 114條，低氧和常氧培養(yǎng)人胎盤間充質(zhì)干細胞差異表達環(huán)狀RNA共102條，其中低氧中表達上調(diào)的85條，下調(diào)的17條（倍數(shù)變化>1.5倍且P < 0.05），而表達差異倍數(shù)變化大于2倍以上的環(huán)狀RNA有27條，且均為上調(diào)表達。每個環(huán)狀RNA預測到5個結(jié)合miRNA。 結(jié)論 低氧預處理使得人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞的環(huán)狀RNA表達譜發(fā)生了顯著變化，這些環(huán)狀RNA可能和低氧預處理有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 低氧；人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞；環(huán)狀RNA；表達譜

[中圖分類號] R394.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（c）-0009-03

[Abstract] Objective To analyze the expression profile variation of circular RNA （circRNA） between hypoxia preconditioned human placenta chorionic mesenchymal stem cells （H-hpcMSCs） and normoxic preconditioned hpcMSCs （N-hpcMSCs）. Methods Human circRNA microarray was performed to detect the difference of circRNA expression between 3 paired specimens of H-hpcMSCs and its N-hpcMSCs. The circRNA differental expression and the predicted miRNA of differentially expressed circRNA were analyzed. Results Of the 13 617 circRNAs， 12 114 circRNAs with analytical results. In H-hpcMSCs， a total of 102 circRNAs showed differentially expressed which have more than 1.5 times variation and significant difference （P < 0.05）. Among them， 85 increased and change′s fold more than 1.5 times， while 17 reduced and change′s fold more than 1.5 times， a total of 27 circRNAs showed a greater than 2-fold change and all were up-regulated. Five miRNAs of each with differentially expressed circRNA were predicted according to specific base pairing. Conclusion The circRNA expression profile of H-hpcMSCs changed significantly in comparison with N-hpcMSCs， the circRNA may be associated with the hypoxia precondition.

[Key words] Hypoxia precondition； Human placenta chorionic mesenchymal stem cells； Circular RNA； Expression profile

環(huán)狀RNA是一類特殊的內(nèi)源性RNA分子，大量存在于真核生物細胞中，是RNA領域最新的研究熱點之一[1-3]。已有研究表明，circRNA參與了多種疾病、衰老等生理病理現(xiàn)象的發(fā)生發(fā)展過程[4]。目前，circRNA參與調(diào)控間充質(zhì)干細胞生理過程的研究報道較少，而低氧預處理對間充質(zhì)干細胞中circRNA表達的影響未見報道。因此，本研究預期篩選出低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞差異表達的circRNA，為circRNA參與間充質(zhì)干細胞的生物學功能提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TRIzol試劑（Invitrogen life technologies），無RNA酶的水（Invitrogen life technologies），RNase R（Epicentre），人circRNA芯片v2.0（Arraystar），Arraystar Supper RNA Labeling試劑盒（Arraystar），二氧化氮培養(yǎng)箱（Labotect），基因芯片掃描儀（Agilent），計算機圖像分析系統(tǒng)（Leica），基因芯片雜交儀（Illumina）

1.2 標本收集和分組

人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞按照已有實驗室方法提取并驗證為合格的間充質(zhì)干細胞[5]。本研究中，復溫3例不同孕婦胎盤來源的P3代人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞，接種培養(yǎng)至80%融合時消化傳代，1∶2分離培養(yǎng)，一瓶置于1%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為本次研究的實驗組；一瓶置于21%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為本次研究的對照組。

1.3 環(huán)狀RNA芯片實驗操作流程

實驗組和對照組細胞培養(yǎng)至70%～80%融合度時，用TRIzol提取總RNA，經(jīng)RNase R處理，去除線性RNA，富集circRNA，然后用隨機引物對circRNA進行擴增并轉(zhuǎn)錄為熒光cRNA。cRNA純化后在circRNA芯片上65℃雜交17 h。雜交后的芯片洗片后，應用Agilent Scanner G2505C掃描。

1.4 數(shù)據(jù)采集與分析

將芯片掃描圖片導入Agilent Feature Extraction軟件提取原始數(shù)據(jù)，應用R軟件包進行標準化和分析，兩組樣本間差異表達的circRNA通過變化倍數(shù)進行篩選。應用預測軟件TargetScan和miRanda，對于每個差異倍數(shù)大于1.5倍的circRNA預測5個高匹配值的miRNA。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用Rv.3.3統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，以標準化處理后數(shù)據(jù)為基礎，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義；篩選出倍數(shù)變化大于1.5，P < 0.05的circRNA為差異表達circRNA。

2 結(jié)果

2.1 散點圖分析circRNA表達譜變化

用實驗組和對照組表達的circRNA繪制散點圖，平行于對角線的1.5倍線有效區(qū)分兩組樣本中表達一致和差異表達的circRNA。見圖1（封四）。

2.2 火山圖分析circRNA表達譜變化

用實驗組和對照組表達的環(huán)狀RNA繪制火山圖，紅色區(qū)域代表的circRNA符合差異表達條件的環(huán)狀RNA（倍數(shù)變化>1.5倍，且P < 0.05）。見圖2（封四）。

2.3 分層聚類分析circRNA表達譜的差異

用實驗組和對照組表達的circRNA進行分層聚類分析，紅色表示circRNA表達上調(diào)，藍色表示circRNA表達下調(diào)。結(jié)果顯示分層聚類分析能夠正確區(qū)分實驗組和對照組中circRNA的差異表達。見圖3（封四）。

2.4 實驗組和對照組差異表達circRNA篩選

實驗組和對照組差異表達的circRNA共102條，其中實驗組中表達上調(diào)的85條，下調(diào)17條（倍數(shù)變化>1.5倍，P < 0.05），每條circRNA均預測5個高配值的miRNA。見表1。

3 討論

circRNAs（Circular RNAs，circRNA分子）是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴、并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性RNA分子。自從20世紀70年代Sanger等[6]首次在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)circRNA以來，雖然經(jīng)過幾十年的發(fā)展，circRNA研究一直進展緩慢。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學的發(fā)展，人們在大規(guī)模研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時，發(fā)現(xiàn)了大量的circRNA[7-9]。當Hansen等[10]報道circRNA作為分子“海綿”吸附miRNA從而影響基因功能，引起科研人員對circRNA的極大關(guān)注，circRNA不再被認為是基因轉(zhuǎn)錄后錯誤剪接的產(chǎn)物，使得circRNA成為目前生物醫(yī)學領域研究熱點之一[1-3]。已有研究表明，circRNA過高或過低表達，都與機體穩(wěn)態(tài)失衡以及疾病有關(guān)，circRNA參與疾病發(fā)生發(fā)展、衰老等生理病理過程的研究成果不斷報道[11-13]，但circRNA參與間充質(zhì)干細胞相關(guān)生理過程的研究報道較少[14-15]，低氧預處理對間充質(zhì)干細胞circRNA表達的影響未見報道。

已有研究表明，低氧對MSCs的細胞周期、凋亡、遷移、增殖和分化均有影響[16-17]。在氧體積分數(shù)<5%時，低氧預處理可以作為在一定程度上克服MSCs的增殖緩慢、移植后遷移率低、基因不穩(wěn)定等細胞治療缺陷的有效手段，可以提高其臨床應用的有效性及安全性，對再生醫(yī)學的研究有至關(guān)重要的意義[18]。

本研究中，對13 617條circRNA進行檢測，獲得有檢測分析結(jié)果的circRNA為12 114條，通過同常氧條件下培養(yǎng)的hpcMSCs相比較分析，低氧條件下培養(yǎng)的hpcMSCs在circRNA表達譜上存在差異表達，按照差異表達倍數(shù)>1.5倍且P < 0.05的標準進行篩選，共獲得102條差異表達circRNA，其中表達上調(diào)的85條，下調(diào)17條，表達差異達到2倍以上的27條，均為表達上調(diào)。提示這些差異表達的circRNA可能參與低氧條件下hpcMSCs的各種生物過程和分子調(diào)控機制。通過生物信息學技術(shù)分析差異表達circRNA的靶結(jié)合位點，軟件預測顯示多個circRNA和miR-150結(jié)合。文獻檢索分析表明，miR-150是一個重要的分子元件，涉及到影響間充質(zhì)干細胞歸巢的SDF-1/CXCR4軸通路[19-20]。因此，在目前的基礎上，需要用qRT-PCR驗證獲得的circRNA，然后借助生物信息學技術(shù)、文獻檢索分析和LOF/GOF操作，上調(diào)或下調(diào)相關(guān)circRNA表達，觀察細胞的生物學特征和功能，以及進一步用實驗研究來驗證circRNA引起hpcMSCs產(chǎn)生的具體生物過程。這些有待開展的研究將闡明低氧培養(yǎng)條件下hpcMSCs發(fā)生變化的一系列生理生物過程的發(fā)生機制，為間充質(zhì)干細胞的臨床細胞治療提供科學依據(jù)。

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