沈 東， 王 維

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院藥學(xué)部， 浙江 杭州 310018； 2杭州市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部， 浙江 杭州 310009)

近年來隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，我國肺癌患者的死亡率呈逐年上升趨勢，并且低齡化趨勢也越來越明顯，統(tǒng)計顯示肺癌發(fā)病率和死亡率均居于10大惡性腫瘤的首位[1]。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肺癌治療中最為棘手的問題，而上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe-lial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[2]。目前研究報道證實，EMT在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和肝癌等多種腫瘤的原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，且EMT的程度與細(xì)胞侵襲和遷移能力呈正相關(guān)[3]。因此，研究EMT的發(fā)生，對于尋找治療腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的目標(biāo)靶點有重要意義。

紫草素(shikonin)是草本植物紫草根部提取的一種萘醌類單體化合物，具有抗癌、抗菌、抗炎和促進(jìn)傷口愈合等多種藥理作用[4]。近年來，紫草素的抗腫瘤作用引起人們的廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)報道的紫草素抗腫瘤作用主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。然而，紫草素是否可通過抑制腫瘤細(xì)胞的EMT發(fā)揮抗腫瘤作用，目前還沒有文獻(xiàn)報道。本實驗探討紫草素對肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)誘導(dǎo)的肺癌PC9細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用及對細(xì)胞侵襲和遷移的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。紫草素、肝細(xì)胞生長因子和DMSO購自Sigma；胎牛血清購自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司； MTT 和RIPA細(xì)胞裂解液購自碧云天生物公司；抗上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo；ECL超敏發(fā)光液購自Millipore。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌PC9細(xì)胞用含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%之后，每3 d 用0．25%胰蛋白酶消化傳代并進(jìn)行相關(guān)實驗。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期細(xì)胞以5.0×107/L的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(0.5、1、2、4和8 μmol/L)shikonin，以DMSO溶劑組為對照組。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。最后，吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。每個濃度設(shè)平行重復(fù)6孔，重復(fù)實驗3次。

2.3劃痕愈合實驗 將PC9細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪滿孔底，用10 μL槍頭小心在孔底劃痕，PBS清洗3次，加入含有2.5%低血清的新鮮培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下拍照，沿劃痕邊緣等間距取3處測量劃痕寬度，取平均值。然后加入HGF(50 μg/L)或HGF(50 μg/L)+shikonin(1 μmol/L)作用，24 h后繼續(xù)拍照，在相同觀察點測量劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.4Transwell小室實驗 將HGF誘導(dǎo)前后的細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基制成8×107/L細(xì)胞懸液，在Transwell小室的上室中加入含有HGF(50 μg/L)或HGF(50 μg/L)+shikonin(1 μmol/L)的細(xì)胞懸液200 μL，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，吸棄小室內(nèi)液體，用棉簽輕輕擦去基質(zhì)膠和上室未穿膜細(xì)胞，PBS漂洗后，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，再用PBS漂洗后，倒置顯微鏡下觀察拍照，鏡下隨機(jī)選取5個視野計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目，取平均值。

2.5細(xì)胞形態(tài)的觀察 取對數(shù)生長期的肺癌PC9細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，實驗分為4組，分別為對照(control)組、HGF(50 μg/L)組、HGF(50 μg/L)+shikonin (1 μmol/L)組和HGF(50 μg/L)+shikonin(2 μmol/L)組，作用24 h后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并照相。

2.6Western blot法檢測EMT相關(guān)蛋白水平變化 采用50 μg/L的HGF作用肺癌PC9細(xì)胞24 h，然后加入shikonin(1 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，各組細(xì)胞用RIPA裂解液裂解提取各組細(xì)胞的總蛋白，用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度定量。每個泳道蛋白樣品10 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，利用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用現(xiàn)配的脫脂牛奶溫室封閉1 h后，分別加入抗E-cadherin、N-cadherin、vimentin和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入對應(yīng)II 抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次 每次5min, ECL加入電化學(xué)發(fā)光法發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實驗均重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 紫草素抑制肺癌PC9細(xì)胞的活力

MTT法檢測shikonin對PC9細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，隨著給藥劑量的增加，shikonin對肺癌PC9細(xì)胞的生長抑制率顯著上升(P<0.01)，見圖1。在給藥24 h后，shikonin的IC50為9.364 μmol/L。

Figure 1. The effects of shikonin on the viability of PC9 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖1不同濃度的紫草素對肺癌PC9細(xì)胞活力的影響

2 紫草素抑制HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞遷移

劃痕實驗的結(jié)果顯示，HGF可誘導(dǎo)PC9細(xì)胞遷移(P<0.01)；在HGF存在的條件下，用shikonin處后，HGF對PC9細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用減弱，與HGF作用組相比，在用shikonin作用24 h后，劃痕愈合率呈現(xiàn)明顯降低(P<0.01),說明shikonin可明顯抑制由HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞遷移，見圖2。

3 紫草素抑制 HGF 誘導(dǎo)的 PC9細(xì)胞侵襲

Transwell小室實驗結(jié)果顯示，HGF作用組穿透細(xì)胞的數(shù)量要比未經(jīng)HGF作用組處理的細(xì)胞明顯增多(P<0.01)；而加入shikonin(1 μmol/L)作用肺癌PC9細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲能力明顯下降(P<0.01),表明shikonin可明顯抑制由HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞侵襲，見圖3。

4 紫草素對肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響

與對照組細(xì)胞形態(tài)比較，加入50 μg/L HGF刺激后，PC9細(xì)胞形態(tài)失去了上皮細(xì)胞所特有的多邊、排列較為規(guī)則、緊密的形態(tài)，變成了更為細(xì)長的形態(tài)；然而，加入shikonin作用后則逐漸逆轉(zhuǎn)了這一變化,見圖4。

Figure 2. The effect of shikonin on migration of PC9 cells. The cell migration ability was examined by wound healing assay. The scale bar=200 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHGF group.

圖2劃痕愈合實驗檢測紫草素對肺癌PC9細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 3. The effect of shikonin on invasion ability of PC9 cells. The cell invasion ability was examined by Transwell assay. The sale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHGF group.

圖3Transwell小室法檢測紫草素對肺癌PC9細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 4. The morphological changes of PC9 cells after HGF and shikonin treatment (×200).

圖4HGF和紫草素處理前后細(xì)胞形態(tài)的變化

5 紫草素逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞EMT

用Western blot 檢測shikonin對EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin的影響，發(fā)現(xiàn)HGF可顯著下調(diào)PC9細(xì)胞E-cadherin 的蛋白表達(dá)，而上調(diào)N-cadherin和vimentin的蛋白表達(dá)(P<0.01)，加入shikonin(1 μmol/L)作用后則可逆轉(zhuǎn)由HGF 誘導(dǎo)的PC9 細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)下調(diào)和N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，見圖5。

討 論

肺癌是當(dāng)今全球危害性最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因[2]。盡管治療腫瘤的方法不斷發(fā)展與更新，新的抗腫瘤藥物也是層出不窮，但肺癌患者長期生存率并沒有明顯提高。因此，尋找一種抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的新方法和策略已成為醫(yī)藥界的一個重要課題。

Figure 5. The protein levels of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in HGF-induced PC9 cells treated with shikonin. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHGF group.

圖5紫草素對HGF誘導(dǎo)的PC9細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和vimentin表達(dá)水平的影響

EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。典型的EMT是指上皮細(xì)胞失去上皮特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的一種生物現(xiàn)象，表現(xiàn)為遷移及侵襲能力增強(qiáng)、細(xì)胞播散能力增強(qiáng)、細(xì)胞形態(tài)延伸以及抗調(diào)亡能力增強(qiáng)。E-cadherin用于維持正常上皮細(xì)胞間的穩(wěn)定性，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，是EMT的關(guān)鍵分子；間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin則具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運動和轉(zhuǎn)移的作用。EMT的發(fā)生可受環(huán)境刺激或胞外基質(zhì)因子調(diào)節(jié)[6]。HGF是肝細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，在一些腫瘤模型中[7]，HGF可誘導(dǎo)EMT，從而降低腫瘤細(xì)胞間的黏附并增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力。如詹建偉等[8]報道姜黃素逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)PC9細(xì)胞對吉非替尼的耐藥中HGF可誘導(dǎo)肺癌發(fā)生EMT；莫翠菊等[9]報道HGF可誘導(dǎo)肝癌Huh7細(xì)胞發(fā)生EMT。在本實驗中，我們通過HGF誘導(dǎo)，成功建立了肺癌PC9細(xì)胞EMT模型，加入HGF 刺激后，PC9細(xì)胞形態(tài)變得更為細(xì)長，且細(xì)胞遷移侵和襲能力比誘導(dǎo)前明顯增強(qiáng)；上皮細(xì)胞的E-cadherin標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)。

紫草素是從我國傳統(tǒng)中藥紫草根部提取出來的萘醌色素，具有抗炎、抑制脂肪形成、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等廣泛的藥理作用及生物學(xué)效應(yīng)[5]，其中抗腫瘤作用是目前研究的熱點。紫草素類化合物的抗腫瘤機(jī)制涉及多個靶點，文獻(xiàn)報道的紫草素類化合物的抗腫瘤作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]、抑制蛋白酪氨酸激酶[11]、抗腫瘤血管生成[12]及影響腫瘤細(xì)胞信號傳遞[13]等。本文將在文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上，重點闡述紫草素對HGF誘導(dǎo)肺癌PC9細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響。

綜上所述，我們觀察到HGF誘導(dǎo)使肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的形態(tài)變化，并通過EMT標(biāo)志性蛋白分子進(jìn)一步證明了EMT的發(fā)生。在加入紫草素干預(yù)后，細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯降低；同時檢測EMT標(biāo)志性蛋白分子的變化，細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)相對于EMT模型明顯上調(diào)，N-cadherin和vimentin 蛋白表達(dá)則明顯下調(diào)。本實驗初步研究表明紫草素作為一種天然存在的化合物能明顯能逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的肺癌PC9細(xì)胞EMT，為紫草素應(yīng)用于肺癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。