章述軍， 肖 晴， 黃文祥

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科， 重慶市傳染病與寄生蟲重點實驗室， 重慶 400016)

巨噬細胞是天然免疫的重要成員之一，在感染、自身免疫疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均起著十分重要的作用，根據(jù)誘導(dǎo)其分化的細胞因子的種類和細胞功能的不同，主要包括M1和M2亞型。M1亞型巨噬細胞主要由Th1類細胞因子如干擾素γ(interfe-ron-γ，IFN-γ)等誘導(dǎo)分化而來，通過分泌腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-6等炎癥因子而促進炎癥反應(yīng); 而M2亞型主要由Th2類細胞因子如IL-4和IL-13等誘導(dǎo)分化而來，通過分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor-β，TGF-β)等抑制炎癥、促進組織修復(fù)，兩者間的平衡是維持穩(wěn)態(tài)的重要保障[1]。在感染的早期以巨噬細胞以M1亞型為主，通過促進炎癥反應(yīng)清除病原體，在感染后期以M2亞型為主，以促進炎癥消除，修復(fù)組織，但目前這種轉(zhuǎn)換的機制仍不清楚[2]。

細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是細菌重要的病原相關(guān)分子模式之一，是誘導(dǎo)巨噬細胞向M1亞型分化、促進炎癥反應(yīng)的重要因子。在細菌感染和嚴重肝臟疾病時，LPS也是重要的致病因子，除引發(fā)M1亞型巨噬細胞炎癥應(yīng)答外，還同時促進非M1亞型的巨噬細胞向M1亞型巨噬細胞進行分化，進一步加強機體的炎癥狀態(tài)，如果不加控制，機體會出現(xiàn)嚴重的免疫過激狀態(tài)導(dǎo)致多器官功能損傷而死亡。因此，機體存在相應(yīng)的保護機制來限制炎癥的進展，LPS可能參與其中[3]。

因此，本研究采用THP-1細胞體外模擬巨噬細胞及其M1亞型，探討LPS是否對其死亡具有影響，及其可能機制。

材 料 和 方 法

1 細胞及培養(yǎng)

人THP-1細胞系(TIB-2020)和胎牛血清(30-2020)購自ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基 (11835055)、β-巰基乙醇(31350010)、重組人IFN-γ(PHC4031)購自Gibco；佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA;P1585)購自Sigma；z-VAD-FMK(S7023)、necrostatin-1(S8037)、VX765(S2228)、GSK872(S8465)和SP600125(S1460)購自Selleck。用于實驗的THP-1細胞不超過20代, 生長密度不超過1×109/L，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和50 μmol/L巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。以PMA(100 μg/L, 160 nmol/L)刺激24 h后以無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)淋洗2次，再更換為不含PMA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。對于PMA誘導(dǎo)后的巨噬細胞，本文將其作為M0巨噬細胞， 繼以IFN-γ (50 μg/L)刺激24 h誘導(dǎo)分化后作為M1亞型細胞，相關(guān)基因譜的檢測與鑒定詳見既往報道[4]。

2 主要方法

2.1細胞死亡的檢測 本研究中，我們采用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放實驗和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法進行細胞死亡的判定。LDH釋放檢測試劑盒(88954)購自于Thermo Fisher Scientific，嚴格按照說明書進行實驗：接種0.5×109/L的THP-1細胞于培養(yǎng)板，誘導(dǎo)分化M0和M1亞型巨噬細胞，給予LPS(100 μg/L)分別刺激6、12和24 h后，收集上清檢測釋放出的LDH，裂解剩余的貼壁細胞檢測LDH，兩者之和即為總LDH，上清中的LDH除以總LDH即為所釋放的LDH。TUNEL試劑盒(G3250)購自于Promega，處理后的細胞先以PBS淋洗2遍，后以4%多聚甲醛-PBS溶液于室溫固定10 min，隨后按說明書操作。隨機取5個視野計數(shù)陽性信號細胞，對比4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色計算陽性率。

2.2Western blot實驗 巨噬細胞接受相應(yīng)的處理后，以無菌冷PBS淋洗2遍，加入RIPA裂解液后刮取收集于EP管，繼續(xù)于冰上裂解30 min，期間采用超聲破碎3次，每次5 s。14 000×g離心15 min后保留上清，測定蛋白濃度后取40 μg每泳道以90 V電泳90 min，90 V下轉(zhuǎn)膜120 min，5%脫脂奶粉-PBST溶液封閉1 h，然后與相應(yīng) I 抗于4 ℃孵育過夜(16 h)，PBST溶液漂洗3次，每次5 min,與 II抗于室溫下孵育1 h，PBST漂洗3次，每次5 min,后使用ECL液發(fā)光于ChemiDoc XRS+系統(tǒng)(Bio-Rad)曝光采集圖像，使用ImageJ軟件分析。所采用的抗體：GAPDH(內(nèi)參照)抗體(sc-367714)購自Santa Cruz;受體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIP3)抗體(ab56164)購自Abcam；RIP1抗體(4926)、總c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)抗體(9252)、磷酸化JNK抗體(9251)、總細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)抗體(9102)、磷酸化ERK抗體(9101)、總P38抗體(9212)、磷酸化P38抗體(9211)和NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)抗體(15101)均購自Cell Signaling Technology。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。所有實驗均獨立完成3次, 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用Student’st檢驗，多組間比較進行正態(tài)分布性檢驗和方差齊性檢驗后采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS聯(lián)合z-VAD-FMK特異性誘導(dǎo)IFN-γ預(yù)處理巨噬細胞死亡

分化后的M0和M1亞型巨噬細胞接受LPS(100 μg/L)刺激后檢測LDH釋放和TUNEL陽性率。在接受LPS刺激0 h、6 h、12 h和24 h后，M0亞型巨噬細胞LDH釋放依次為(7.1±0.0)%、(9.1±0.6)%、(12.0±1.0%)和(12.8±0.7)%，而M1亞型依次為(8.2±0.0)%、(16.8±0.6)%、(22.3±1.2)%和(22.4±0.8)%，見圖1A。TUNEL陽性率在LPS刺激0 h、6 h、12 h和24 h時在M0亞型依次為(0.3±0.1)%、(4.8±0.2)%、(3.8±0.5)%和(2.3±0.4)%；M1亞型依次為(1.0±0.2)%、(12.9±1.0)%、(11.2±1.0)%和(8.5±1.7)%，見圖1B。2個亞型的巨噬細胞接受LPS刺激后其LDH 釋放和TUNEL陽性率均顯著升高(P<0.05)，除基線(0 h)外，LPS處理6 h、12 h和24 h后M1亞型巨噬細胞的LDH釋放及TUNEL陽性率均顯著高于M0亞型(P<0.05)。

Figure 1. LPS at 100 μg/L induced significantly higher LDH release (A) and TUNEL positive rate (B) in M1 macrophages than M0 macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsM0;#P<0.05,##P<0.01vs0 h.

圖1LPS對M0和M1亞型巨噬細胞死亡的影響

LPS處理2種亞型巨噬細胞后，LDH釋放在12 h達峰值，TUNEL陽性率在6 h達峰值，因此，對于LDH釋放和TUNEL陽性率分別選擇12 h和6 h作為時間節(jié)點，進一步使用泛caspase抑制劑、caspase-1抑制劑和RIP1抑制劑以觀察對細胞死亡的影響并分析其死亡模式。結(jié)果顯示，LPS介導(dǎo)的LDH釋放和TUNEL陽性率在M0細胞均可被泛caspase抑制劑z-VAD-FMK(20 μmol/L)阻斷；在M1亞型細胞，z-VAD-FMK(20 μmol/L)阻斷了TUNEL陽性率的升高(P<0.01)，但顯著增強了LDH釋放(P<0.01)。而caspase-1 抑制劑VX765(20 μmol/L)及RIP1抑制劑necrostatin-1(100 μmol/L)對LPS介導(dǎo)的M1亞型巨噬細胞的LDH釋放和TUNEL陽性率均無影響。而LPS聯(lián)合z-VAD-FMK所介導(dǎo)的LDH釋放可以被necrostatin-1所阻斷，見圖2。因此，LPS介導(dǎo)的M1亞型巨噬細胞凋亡，加用z-VAD-FMK后TUNEL陽性率被抑制，LDH釋放增加，而升高的LDH釋放可被necrostatin-1完全阻斷，考慮LPS聯(lián)合z-VAD-FMK誘導(dǎo)M1亞型巨噬細胞發(fā)生了程序性壞死，而LPS聯(lián)合z-VAD-FMK對M0巨噬細胞并無此作用。

2 IFN-γ上調(diào)巨噬細胞RIP3的表達

上述結(jié)果提示LPS聯(lián)合z-VAD-FMK可特異性誘導(dǎo)M1巨噬細胞發(fā)生程序性壞死，可能是一種限制炎癥反應(yīng)的自我保護機制。為進一步探討LPS聯(lián)合z-VAD-FMK特異性發(fā)生于M1亞型巨噬細胞而非M0亞型的機制，我們比較了M0和M1亞型巨噬細胞RIP1和RIP3的表達，與M0亞型巨噬細胞相比較，IFN-γ 能夠顯著上調(diào)M1亞型巨噬細胞RIP3的表達(P<0.05)，后續(xù)的LPS刺激使得其進一步升高，而無論IFN-γ還是LPS都不能在巨噬細胞中上調(diào)RIP1的表達，見圖3。

3 IFN-γ增強LPS介導(dǎo)的巨噬細胞JNK磷酸化和NLRP3的表達

除了RIP1和RIP3是參與程序性壞死的重要分子外，LPS還可通過結(jié)合巨噬細胞表面的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)而進一步激活絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，其中JNK的活化也與程序性壞死的發(fā)生密切相關(guān)。因此我們首先檢測了IFN-γ對MAPK通路的活化的影響，發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)P38和JNK磷酸化(P<0.05)，而IFN-γ 能夠增強LPS所誘導(dǎo)的JNK磷酸化(P<0.05)，而對LPS介導(dǎo)的P38磷酸化無顯著影響，見圖4。既往有報道JNK的活化需要NLRP3的參與[5]，因此本研究也檢測了IFN-γ對NLRP3表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ能顯著上調(diào)NLRP3的表達(P<0.05)，見圖5。

Figure 2. The effects of various inhibitors on LPS-mediated LDH release (A) and TUNEL positive rate (B) of macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDMSO group;##P<0.01vsz-VAD-FMK group.

圖2不同抑制劑對LPS介導(dǎo)的巨噬細胞LDH釋放和TUNEL陽性率的影響

Figure 3. INF-γ upreguated the expression of RIP3, but not RIP1, in the macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsM0.

圖3IFN-γ上調(diào)巨噬細胞RIP3的表達而對RIP1無影響

4 GSK872和SP600125可阻斷LPS聯(lián)合z-VAD-FMK介導(dǎo)的IFN-γ預(yù)處理巨噬細胞死亡

上述結(jié)果提示IFN-γ可能是通過上調(diào)RIP3和促進JNK磷酸化，使得巨噬細胞在接受LPS聯(lián)合z-VAD-FMK處理時發(fā)生程序性壞死。為進一步明確RIP3和JNK的作用，進一步探討了RIP3抑制劑GSK872(5 μmol/L)和JNK抑制劑SP600125(10 μmol/L)對IFN-γ預(yù)處理的巨噬細胞在LPS聯(lián)合z-VAD-FMK介導(dǎo)的程序性壞死中的作用。如圖6所示，GSK872和SP600125均可顯著阻斷LDH的釋放(P<0.05)。

討 論

巨噬細胞在感染早期以M1亞型為主，促進炎癥反應(yīng)從而清除病原體，后期以M2亞型為主，促進炎癥的消除和組織修復(fù)。既往文獻報道在酒精性肝炎小鼠模型中， M2亞型巨噬細胞可介導(dǎo)M1亞型巨噬細胞發(fā)生凋亡，從而限制炎癥反應(yīng)，促進組織修復(fù)[6]。目前認為，對于沒有進一步分化的M0巨噬細胞，LPS在激活凋亡通路的同時也會激活促進增殖的核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和ERK通路從而維持細胞存活。但在某些情況下，LPS也可直接誘導(dǎo)巨噬細胞通過多種方式死亡，例如在NF-κB通路受抑制的情況下，LPS可介導(dǎo)巨噬細胞凋亡；LPS聯(lián)合三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)可誘導(dǎo)包括巨噬細胞在內(nèi)的多種細胞發(fā)生焦亡[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)未分化的M0巨噬細胞發(fā)生死亡的作用較弱，LDH釋放從對照組到LPS(100 μg/L)刺激6 h僅從7.1%上升到9.1%，TUNEL陽性率從(0.3±0.1)%上升到(4.8±0.2)%，這與以往的報道是一致的[8]。然而，當(dāng)使用IFN-γ分化誘導(dǎo)的M1亞型巨噬細胞在接受LPS刺激6 h后，TUNEL陽性率達峰值(12.9%)，而LDH釋放在12 h達峰值(22.3%)，2種死亡檢測指標(biāo)峰值時間的差異提示LPS誘導(dǎo)M1亞型巨噬細胞發(fā)生凋亡，隨著時間延長，晚期凋亡細胞的細胞膜出現(xiàn)破壞，導(dǎo)致LDH釋放進一步升高。

Figure 4. IFN-γ pretreatment enhanced LPS-induced activation of JNK in macrophages. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS group.

圖4IFN-γ預(yù)處理增強LPS介導(dǎo)的JNK蛋白磷酸化

為進一步明確其死亡方式，本研究使用了多種抑制劑進行了初步驗證，對于IFN-γ預(yù)處理的M1亞型巨噬細胞，單獨caspase-1抑制劑和RIP1抑制劑均不能抑制LPS所介導(dǎo)的LDH釋放和DNA斷裂。泛caspase抑制劑z-VAD-FMK可阻斷LPS介導(dǎo)的DNA斷裂，但反而使得其LDH 釋放增加，聯(lián)合使用z-VAD-FMK和necrostatin-1則可完全阻斷LDH釋放和DNA斷裂。因此，LPS介導(dǎo)的M1巨噬細胞死亡考慮為凋亡，LPS聯(lián)合z-VAD-FMK所介導(dǎo)的M1亞型巨噬細胞考慮為程序性壞死。

程序性壞死是由2個關(guān)鍵分子RIP1和RIP3參與調(diào)控的細胞死亡方式，已證明多種刺激信號可以誘導(dǎo)程序性壞死的發(fā)生[9]。LPS與TLR4結(jié)合后，通過2個接頭分子髓樣分化因子88(myeloid differen-tiation factor 88，MyD88)和Toll樣受體接頭分子1(Toll-like receptor adapter molecule 1, TICAM1)激活NF-κB和MAPK通路，TICAM1的活化可募集RIP1和RIP3形成復(fù)合體，在凋亡通路被抑制的情況下(例如某些病毒感染或使用z-VAD-FMK)，RIP3被磷酸化并進一步聚集，進而磷酸化混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)，磷酸化的MLKL轉(zhuǎn)位至細胞膜最終介導(dǎo)程序性壞死[10]。該過程并不依靠LPS誘導(dǎo)巨噬細胞自分泌所產(chǎn)生的TNF-α[11]。而我們結(jié)果顯示LPS聯(lián)合z-VAD-FMK僅能誘導(dǎo)M1亞型巨噬細胞發(fā)生程序性壞死，這可能是機體自我保護的一種可能機制，以限制本身行使促炎功能的M1亞型巨噬細胞在接受LPS刺激時進一步增強炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致免疫過激。進一步探討LPS聯(lián)合z-VAD-FMK誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生程序壞死的為何僅僅特異性地發(fā)生于IFN-γ誘導(dǎo)分化形成的M1亞型細胞的機制，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)分化的M1亞型巨噬細胞具有顯著高于M0亞型巨噬細胞中RIP3的表達，而RIP1在2種巨噬細胞亞型中并無顯著差異。IFN-γ主要通過與其受體結(jié)合激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)通路，該通路的激活被報道在小鼠中可以上調(diào)MLKL的表達[12], 而其是否參與對RIP1和RIP3轉(zhuǎn)錄層面的調(diào)控迄今未見報道。因此，IFN-γ是通過激活STAT1直接上調(diào)RIP3表達，還是通過分泌其它細胞因子間接促進RIP3表達需要進一步研究。另外，除了上游RIP1和RIP3的活化外，程序性壞死的發(fā)生也需要JNK參與，JNK的活化也可與RIP3的活化相互促進[13-15]，而LPS主要的靶信號通路就是NF-κB和MAPK通路。因此，我們檢測了INF-γ是否對LPS介導(dǎo)的JNK磷酸化有影響，發(fā)現(xiàn)IFN-γ對JNK的磷酸化并無直接活化或抑制作用，但卻能夠顯著增強LPS介導(dǎo)的JNK磷酸化。進一步使用RIP3和JNK的抑制劑，發(fā)現(xiàn)2者均可阻斷LPS聯(lián)合z-VAD-FMK介導(dǎo)的IFNγ預(yù)處理的M1亞型巨噬細胞所發(fā)生的的LDH釋放，提示RIP3和JNK可能參與程序性壞死的發(fā)生。Bulosan等[16]發(fā)現(xiàn)IFN-γ能夠通過抑制巨噬細胞中MAPK磷酸酶(MAPK phosphatase,MKP)家族即MKP-1、 MKP-2和MKP-4的活性，從而增強ERK、JNK和P38的磷酸化。但本研究中，IFNγ對MAPK通路在沒有接受LPS刺激的基線并無明顯增強作用，而在接受LPS刺激后，僅僅增強JNK的磷酸化，而對ERK和P38并沒有作用，因此在不同的巨噬細胞模型中，IFN-γ還可能存在不同的機制對MAPK通路進行調(diào)控。

Figure 5. IFN-γ (50 μg/L) upregulated NLRP3 expression in the macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h.

圖5IFN-γ上調(diào)巨噬細胞NLRP3的表達

Figure 6. GSK872 (5 μmol/L) and SP600125 (10 μmol/L) significantly blocked the LDH release mediated by LPS combined with z-VAD-FMK in IFN-γ-pretreated macrophages. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsDMSO group;*P<0.05vsz-VAD-FMK group.

圖6GSK872和SP600125顯著阻斷LPS聯(lián)合z-VAD-FMK介導(dǎo)的M1亞型巨噬細胞LDH釋放

NLRP3作為被研究的最為廣泛的炎癥小體，既往的研究主要集中于IL-1β和IL-18的成熟分泌和焦亡中，近期NLRP3還被發(fā)現(xiàn)參與JNK的激活，敲除NLRP3會阻斷JNK的磷酸化[5]，因此我們檢測了IFN-γ對NLRP3的影響，發(fā)現(xiàn)IFN-γ能夠上調(diào)巨噬細胞NLRP3的表達，但本研究中NLRP3的上調(diào)是否是IFN-γ增強LPS介導(dǎo)的JNK磷酸化的機制有待進一步證實。同時，IFN-γ上調(diào)NLRP3的機制也并不清楚，由于IFN-γ激活STAT通路后所涉及調(diào)控細胞因子過多，需要在今后的研究中進一步探討。

綜上所述，IFN-γ能夠通過增強巨噬細胞RIP3的表達，并可增強LPS介導(dǎo)的JNK磷酸化，使得M1亞型巨噬細胞在LPS聯(lián)合z-VAD-FMK刺激時發(fā)生程序性壞死，從而作為機體一種可能的自我保護機制。