吳夢(mèng)佳，唐成林，黃思琴，安薈羽，譚程方，邱麗，朱正威，楊之雪

1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市400016；2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400016通訊作者：唐成林。E-mail：cytcl996@163.com

失神經(jīng)骨骼肌萎縮是指由于失去神經(jīng)的支配和營(yíng)養(yǎng)作用，導(dǎo)致骨骼肌出現(xiàn)肌肉質(zhì)量和容積不斷流失、內(nèi)分泌及運(yùn)動(dòng)功能障礙的一種持續(xù)性病理狀態(tài)，嚴(yán)重影響患者正常生活[1]。若治療不及時(shí)，靶肌肉失去活性，將發(fā)生不可逆的失神經(jīng)性肌萎縮[2]。肌蛋白的合成代謝小于降解代謝是骨骼肌質(zhì)量減少和發(fā)生骨骼肌萎縮的主要原因之一[3]。治療骨骼肌萎縮，或通過(guò)抑制肌蛋白降解，或促進(jìn)肌蛋白合成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，電針能通過(guò)上調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路，促進(jìn)萎縮骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖；并通過(guò)下調(diào)萎縮骨骼肌中叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子3A和肌萎縮F-box蛋白的表達(dá)，抑制骨骼肌蛋白降解，延緩失神經(jīng)肌萎縮。

本研究觀察電針對(duì)萎縮腓腸肌中mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR,Ser2448)、70KD核糖體蛋白S6激酶(70-KD ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)和磷酸化p70S6K(p-p70S6K,Thr389)蛋白表達(dá)的影響，從mTOR/p70S6K蛋白合成信號(hào)通路的角度，探討電針延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠18只，鼠齡8周，體質(zhì)量270～290 g，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK渝2012-0002，代養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠編號(hào)1～18，計(jì)算機(jī)生成18個(gè)兩位隨機(jī)數(shù)字，分別對(duì)應(yīng)1個(gè)編號(hào)；將隨機(jī)數(shù)從小到大排列，序號(hào)1～6為假手術(shù)組，7～12為模型組，13～18為電針組。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物處置嚴(yán)格按照重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

mTOR、p70S6K一抗：美國(guó)R&D SYSTEMS公司。p-mTOR、p-p70S6K一抗：美國(guó)AFFINITY BIOSCIENCES公司。Trizol總RNA提取試劑盒，RR037A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Premix Ex Taq TMII，mTOR、p70S6K引物合成：日本TAKARA公司。

漢醫(yī)牌無(wú)菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。SDZ-II型電子針治療儀：蘇州醫(yī)療用品有限公司。柔軟型實(shí)驗(yàn)大鼠固定器：溫州原上草醫(yī)療科技有限公司。AL204型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。低溫高速離心機(jī)：美國(guó)SIGMA公司。實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)：上海和泰儀器有限公司。電泳儀：成都百樂(lè)科技有限公司。Thermo ND 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀、Odyssey FC成像系統(tǒng)：上海GENE公司。T100TMPCR儀、CFX PCR檢測(cè)系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD公司。CellSens Standard圖像采集軟件、BX53普通正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 造模方法

制備鉗夾大鼠坐骨神經(jīng)腓腸肌萎縮模型[6]。模型組和電針組大鼠4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，右后肢手術(shù)區(qū)消毒，常規(guī)備皮；于坐骨結(jié)節(jié)下緣斜向切口6～8 mm，沿肌肉紋理走向鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)；取16 cm長(zhǎng)持針器鉗夾坐骨神經(jīng)中段，全齒共鉗夾3次，每次鉗夾持續(xù)10 s，間隔10 s，造成寬3.0 mm急性神經(jīng)損傷，肉眼可見(jiàn)神經(jīng)軸索透明，但外膜完整?？p合切口，碘伏消毒，復(fù)溫促醒。

假手術(shù)組只暴露神經(jīng)，不行坐骨神經(jīng)鉗夾術(shù)。

1.4 電針干預(yù)

造模后第2天，電針組用大鼠固定器[7]固定，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》方法[8]，選右足三里、環(huán)跳，針灸針直刺5～7 mm，接電針儀，連續(xù)波，1.0 mA，2 Hz，刺激10 min，見(jiàn)大鼠下肢輕微震動(dòng)。每天1次，連續(xù)干預(yù)2周。

假手術(shù)組和模型組每天相同時(shí)間同法固定，但不行電針干預(yù)。

1.5 標(biāo)本采集

干預(yù)2周后，各組4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，手術(shù)完整剝離雙側(cè)腓腸肌，吸干表面殘血。腓腸肌組織均分2份，一份固定于4%多聚甲醛中，用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)；一份保存于-80℃冰箱待測(cè)。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 濕重比

手術(shù)完整剝離雙側(cè)腓腸肌，清除多余肌腱及血管，電子天平稱(chēng)取肌濕重，記錄雙側(cè)濕重，計(jì)算患/健側(cè)濕重比。

1.6.2 腓腸肌纖維橫截面積和直徑

取出經(jīng)4%多聚甲醛固定的腓腸肌，沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明45 min，浸蠟并包埋，制備石蠟切片，厚4 μm，烘干?？酒⒚撓?，蘇木素染色2 min，沖洗2 min；伊紅染色1 min，沖洗，鏡下觀察染色情況。封片，晾干。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，Image-Pro Plu 6.0圖像分析軟件計(jì)算腓腸肌纖維的橫截面積和直徑。

1.6.3 Western blotting

取-80℃冰箱保存的待測(cè)組織50 mg，提取蛋白，調(diào)勻濃度，配置12%凝膠，室溫待凝15 min，60 V預(yù)電泳20 min，120 V上樣電泳100 min，300 mA轉(zhuǎn)膜90 min，室溫?fù)u床封閉2 h。加mTOR(1∶1000)、p70S6K(1∶1000)、p-mTOR(1∶1000)、p-p70S6K(1∶1000)一抗4℃冰箱過(guò)夜，二抗(1∶1000)室溫?fù)u床孵育1 h，TBST清洗3次，每次15 min，化學(xué)發(fā)光2 min，以GAPDH為內(nèi)參，Odyssey FC成像系統(tǒng)成像分析計(jì)算條帶相對(duì)灰度值。1.6.4實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)

取-80℃冰箱待測(cè)組織50 mg，Trizol液提取總RNA，加入異丙醇沉淀10 min，12,000 r/min離心15 min，75%酒精清洗，自然晾干；加入無(wú)酶水，彈勻。充分清洗超微量核酸蛋白測(cè)定儀探頭5次，記錄總RNA純度和污染值，按比例稀釋。使用SYBR Green配制反應(yīng)體系，合成反應(yīng)體系，彈勻，離心后行逆轉(zhuǎn)錄：37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。96孔板加樣，標(biāo)板，上機(jī)行qPCR反應(yīng)：90℃30 s，95℃5 s，60℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。使用CFX Manager 3.1軟件讀取Ct值。

上下游引物序列如下。

mTOR：上游5'-AAT GGG CAC GAG TTT GTT TTC C-3'；下游5'-CGA GTT GGT GGA CAG AGG AAT G-3'。

p70S6K：上游5'-CAG CCC CGA TGA CTC AAC TCT C-3'；下游5'-GCG TTC GTG GGC TAC CAA TAA-3'。

β-actin：上游 5'-ACG GTC AGG TCA TCA CTA TCG-3'；下游5'-GGC ATA GAG GTC TTT ACG GAT G-3'。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肌濕重比

與假手術(shù)組相比，模型組腓腸肌濕重比顯著降低(P＜0.001)，電針組明顯高于模型組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 形態(tài)學(xué)

假手術(shù)組右側(cè)肌纖維呈規(guī)則多邊形，無(wú)細(xì)胞核內(nèi)移及外泄情況，形態(tài)飽滿正常。模型組肌纖維邊緣不規(guī)則，細(xì)胞核內(nèi)移或外泄，肌纖維縮小。電針組較模型組肌纖維邊緣規(guī)則，細(xì)胞核內(nèi)移和外泄減少。見(jiàn)圖1。

與假手術(shù)組相比，模型組右側(cè)腓腸肌纖維橫截面積和直徑顯著降低(P＜0.001)，電針組顯著高于模型組(P＜0.001)。見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠右側(cè)腓腸肌纖維病理學(xué)改變(HE染色，bar=50 μm)

表1 各組腓腸肌萎縮指標(biāo)比較

2.3 Western blotting

與假手術(shù)組相比，模型組右側(cè)腓腸肌mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)；電針組高于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

2.4 qPCR

與假手術(shù)組相比，模型組右側(cè)腓腸肌mTOR、p70S6K基因表達(dá)升高(P＜0.05)；電針組高于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 大鼠腓腸肌中相關(guān)基因表達(dá)比較(2-△△Ct)

圖2 各組大鼠腓腸肌Western blotting

3 討論

失神經(jīng)性骨骼肌萎縮導(dǎo)致的肢體痿軟、酸困無(wú)力屬中醫(yī)學(xué)“痿癥”范疇[9]?！鹅`樞·根結(jié)》認(rèn)為：“痿疾者，取之陽(yáng)明?！弊闳?、環(huán)跳為治療下肢癱瘓、肌肉痿痹的要穴。研究表明，電針足三里和環(huán)跳能誘導(dǎo)腓腸肌出現(xiàn)適應(yīng)性肥大，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化，提高骨骼肌運(yùn)動(dòng)耐力[10]；并通過(guò)抑制過(guò)度激活的自噬水平，延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮[11]。

肌蛋白合成代謝的正常對(duì)維持骨骼肌質(zhì)量的穩(wěn)定十分重要[12]。mTOR/p70S6K信號(hào)通路是促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的主要通路[13]。mTOR/p70S6K通路抑制，不利于肌細(xì)胞的分化和肌管的肥大[14]；激活此通路將對(duì)肌肉生長(zhǎng)起促進(jìn)作用[15]。

mTOR是維持肌肉穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)肌肉再生的關(guān)鍵因子[16]，也是參與調(diào)節(jié)mRNA翻譯的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐[17]，p-mTOR是其持續(xù)活化的標(biāo)志。電針能上調(diào)衰老骨骼肌中mTOR和p-mTOR表達(dá)，促進(jìn)蛋白合成，延緩衰老性骨骼肌萎縮[18]。

mTOR激活下游效應(yīng)分子p70S6K、真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)和真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIf4E)[19]。在促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的過(guò)程中，p70S6K與mTOR的協(xié)同性更好[20]。p70S6K被p-mTOR激活，繼而發(fā)生磷酸化，啟動(dòng)蛋白翻譯過(guò)程[21]，協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖分化。對(duì)8月齡增齡性大鼠連續(xù)預(yù)防性電針干預(yù)6個(gè)月，能上調(diào)mTOR和p70S6K表達(dá)，促進(jìn)肌蛋白翻譯與合成，從而減緩增齡性大鼠骨骼肌萎縮[22]。

在重新接受神經(jīng)支配的過(guò)程中，維持骨骼肌質(zhì)量的穩(wěn)定和活性，延緩其萎縮速度，是保持骨骼肌功能正常的關(guān)鍵。本研究表明，失神經(jīng)肌萎縮2周后，大鼠腓腸肌中mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K的表達(dá)升高，提示腓腸肌啟動(dòng)自我修復(fù)；而電針能進(jìn)一步上調(diào)mTOR/p70S6K信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)并刺激其活化，促進(jìn)肌蛋白翻譯與合成，延緩腓腸肌質(zhì)量下降。

綜上所述，失神經(jīng)骨骼肌萎縮后，電針能上調(diào)骨骼肌中mTOR、p70S6K蛋白及基因表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控其磷酸化水平，激活mTOR/p70S6K信號(hào)通路，促進(jìn)肌蛋白翻譯與合成，維持骨骼肌質(zhì)量和容積，達(dá)到延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的目的。