田曉玲，韓鐫竹，李欣南，高鐸，武鳳嬌

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

沙門氏菌（Salmonella）屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌[1]。沙門氏菌（Salmonellosis）病是指由各種血清型的沙門氏菌所引起的對(duì)人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱[2]，沙門氏菌屬有的專對(duì)人類致病，有的只對(duì)動(dòng)物致病，也有對(duì)人和動(dòng)物都致病[3]。雞沙門氏菌可引起雞白痢、雞傷寒和禽副傷寒，具有垂直傳播和水平傳播的特點(diǎn)，是嚴(yán)重危害家禽業(yè)的重要致病菌[4-6]。沙門氏菌的抗原主要分為3種類型：菌體O抗原、鞭毛或菌毛H抗原、莢膜Vi抗原[7-8]。沙門氏菌有2 535個(gè)血清型，我國(guó)已檢出292個(gè)血清型[9-10]，全世界已確認(rèn)其中腸炎沙門氏菌能夠在禽類及其產(chǎn)品中穩(wěn)定傳播[11-12]。從國(guó)內(nèi)外的研究情況來看，沙門氏菌的檢出率不斷上升，耐藥性逐漸加強(qiáng)[13-15]。本文借鑒生化分離鑒定方法，通過分析遼寧省養(yǎng)殖場(chǎng)雞源沙門氏菌的耐藥性變化趨勢(shì)，為臨床沙門氏菌應(yīng)用提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 質(zhì)控菌株為ATCC14028，購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司；試驗(yàn)菌株于養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）采集。

1.2 儀器生物安全柜CLASSⅡ（美國(guó)NUAIRE公司）；全自動(dòng)高壓滅菌器（日本三洋電器集團(tuán)）；恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)BINDER公司）；ABT Expression鑒定儀（BIOMERIEUX公司）。

1.3 培養(yǎng)基與材料 緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、SC培養(yǎng)基、DHL培養(yǎng)基、SWARM瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自上海欣中生物工程有限公司；API NaCl 0.85%培養(yǎng)基和ID32E鑒定條均購(gòu)自BIOMERIEUX公司；腸桿菌藥敏檢測(cè)板購(gòu)自天津市金章科技發(fā)展有限公司；O多價(jià)血清、O單價(jià)血清、抑制劑、H多價(jià)血清和H單價(jià)血清購(gòu)自泰國(guó)S&A公司。

1.4 方法

1.4.1 分離純化采集新鮮雞盲腸樣品，直接放入緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中，36±1℃培養(yǎng)18 h。吸取預(yù)增菌培養(yǎng)物10 mL接種于SC培養(yǎng)基36±1℃培養(yǎng)48 h。將選擇性增菌液劃線接種于DHL培養(yǎng)基上36±1℃培養(yǎng)24 h。挑取黑色疑似菌落劃線接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上36±1℃培養(yǎng)24 h，生長(zhǎng)出的粉色菌落為疑似單菌落。

1.4.2 生化鑒定將上述獲得的疑似單菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線36±1℃培養(yǎng)24 h。將待檢細(xì)菌單個(gè)菌落，懸浮于3 mL懸浮培養(yǎng)基，制備0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙海褂米詣?dòng)加樣器將菌懸液滴入試紙條反應(yīng)杯中，每個(gè)反應(yīng)杯中滴入55 μL，菌液和試劑滴加完畢后，37℃培養(yǎng)24 h，用細(xì)菌鑒定儀判讀。

1.4.3 血清型鑒定用接種針挑取適量菌苔，在SWARM培養(yǎng)基中間點(diǎn)一點(diǎn)，37℃正向培養(yǎng)16～18 h。在蓋玻片上滴加7 μL血清，挑取少量菌苔與血清混勻，10～30 s后在日光燈下觀察凝集反應(yīng)，凝集為陽(yáng)性，渾濁或澄清為陰性。分別判斷營(yíng)養(yǎng)瓊脂上和SWARM上的沙門氏菌的O抗原和H抗原類型，查閱White-Kauffmann抗原表，確定沙門氏菌的血清型。

1.4.4 藥物敏感性試驗(yàn) 用接種環(huán)挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)1～18 h的3～5個(gè)單菌落，用無菌生理鹽水或M-H肉湯稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝?。取稀釋?×105CFU/mL濃度的菌液0.1 mL分別加入含系列抗菌藥物溶液的板中，混勻，試管中最終抗菌藥物的濃度為原稀釋濃度的一半。將加有菌液和抗菌藥物的板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。取出培養(yǎng)后的板，觀察結(jié)果，以無菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物溶液的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。在質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定范圍的前提下，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷被檢菌株的敏感性：敏感（S）、中度敏感（I）或耐藥（R），判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果采集了遼寧省4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的雞盲腸共632份樣品，分離鑒定得到131株沙門氏菌，分離率為20.73%。DHL培養(yǎng)基上無色半透明有黑色中心或幾乎全為黑色，有些菌株無色半透明為疑似單菌落，結(jié)果見圖1。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上菌落圓形、粉紅色，表面凸起濕潤(rùn)，有光澤，邊緣整齊的菌落確定為陽(yáng)性沙門氏菌，結(jié)果見圖2。

圖1 DHL培養(yǎng)基上沙門氏菌的生長(zhǎng)形態(tài)Fig.1 The growth morphology of Salmonella on DHL medium

圖2 顯色培養(yǎng)基上沙門氏菌的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.2 The growth state of Salmonella on the chromogenic medium

2.2 鑒定結(jié)果經(jīng)細(xì)菌鑒定儀判讀后得到的沙門氏菌生化鑒定，與中國(guó)微生物菌種目錄給出的沙門氏菌一致，具體結(jié)果見表1。

2.3 血清型鑒定結(jié)果對(duì)131株雞源沙門氏菌分離株進(jìn)行血清型鑒定并分群，結(jié)果如表2所示。

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 沙門氏菌的耐藥率和MIC分布 根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，將最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分布列于表3。

表 1 沙門氏菌生化鑒定譜Table 1 Biochemical identification spectrum of Salmonella

表 2 遼寧省雞源沙門氏菌分離株血清型分析表Table 2 Serotype analysis of Salmonella isolates from chickens in Liaoning

總體來說，沙門氏菌對(duì)9類測(cè)試抗生素普遍耐藥，只對(duì)頭孢類抗生素較為敏感，但總體耐藥率均較低，未超過70%耐藥，只有磺胺異噁唑的耐藥相對(duì)高一些，在60%以上，其余均在20%～40%之間波動(dòng)。MIC也主要分布在敏感區(qū)域；但相對(duì)野生型菌株來說，沙門氏菌耐藥譜明顯右移，證明其已獲得耐藥基因，應(yīng)引起高度的重視。

2.4.2 多重耐藥性狀況 本文中的多重耐藥均是以藥物類別來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，具體數(shù)據(jù)見表4。沙門氏菌41.98%的分離株為3類及3類以上耐藥菌株；沙門氏菌25.95%的分離菌株對(duì)7類的藥物耐藥，未見全部耐藥菌株。

表 4 遼寧省雞源沙門氏菌多重耐藥率情況Table 4 Multidrug resistance rate of Salmonella in Liaoning chicken

3 討論

本文對(duì)遼寧省的雞源沙門氏菌進(jìn)行了考察監(jiān)測(cè)，分離出的沙門氏菌主要是腸炎沙門氏菌，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的流行沙門氏菌一致[16]，雖然血清型種類繁多、菌株復(fù)雜，分布具有很強(qiáng)的區(qū)域特點(diǎn)，但以腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、印第安納沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌等為主。

藥敏試驗(yàn)表明分離獲得的沙門氏菌對(duì)獸醫(yī)臨床常用的多種抗菌藥物有耐藥率，但總體耐藥率均較低。王嘉煒等[17]研究表明，沙門氏菌對(duì)磺胺異噁唑（89.81%）耐藥最為普遍，對(duì)磺胺甲噁唑、萘啶酮酸、四環(huán)素、氨芐西林、氯霉素和阿莫西林-克拉維酸等抗生素的耐藥率均在50%以上。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球每年有大約90%的抗生素用于食用動(dòng)物的飼料添加劑和疾病的防治，其中以作為飼料添加劑為主，只有10%用于人類疾病的治療。這可能跟采樣的范圍有關(guān)，導(dǎo)致分離菌株數(shù)有限，代表性不夠，應(yīng)擴(kuò)大采樣范圍，增加采樣地區(qū)。同時(shí)，試驗(yàn)中的采集的樣本均來自健康動(dòng)物，耐藥率低是正?，F(xiàn)象。