張娜娜，姜 博，邢 奕*，連路寧，陳亞婷

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有機磷農(nóng)藥污染土壤的微生物降解研究進展①

張娜娜1,2，姜 博1,2，邢 奕1,2*，連路寧1,2，陳亞婷1,2

(1 北京科技大學(xué)能源與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083；2 北京市工業(yè)典型污染物資源化處理重點實驗室，北京 100083)

有機磷農(nóng)藥是目前我國使用量最大的農(nóng)藥之一，嚴(yán)重污染環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)，并通過食物鏈在生物體內(nèi)富集，進而危害人類健康。微生物降解技術(shù)具有降解效率高、代謝途徑多、無二次污染的優(yōu)勢，是目前清除環(huán)境中有機磷農(nóng)藥的主要手段，能有效降低有機磷農(nóng)藥的危害。目前有機磷農(nóng)藥的降解微生物主要是通過實驗室純培養(yǎng)方法獲得，與自然生態(tài)環(huán)境中存在的降解功能性微生物信息差異較大，而利用不可培養(yǎng)方法識別功能性微生物的技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。本文從有機磷農(nóng)藥的使用情況及引發(fā)的環(huán)境問題出發(fā)，概述了有機磷農(nóng)藥在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化途徑，穩(wěn)定同位素探測技術(shù)和磁性納米材料等不可培養(yǎng)方法對有機磷農(nóng)藥降解功能性微生物的識別，微生物降解有機磷農(nóng)藥污染土壤的功能基因、降解途徑及降解機理；探討了植物–微生物聯(lián)合修復(fù)在有機磷農(nóng)藥污染土壤修復(fù)中的作用，并分析了環(huán)境因子及農(nóng)藥自身性質(zhì)對有機磷農(nóng)藥降解的影響；最后，討論了微生物降解技術(shù)存在的問題及今后研究方向。

有機磷農(nóng)藥；微生物降解；不可培養(yǎng)微生物；功能基因；降解途徑

有機磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides，OPs)作為一種廣譜殺蟲/除草劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中，以殺除有害病蟲，確保農(nóng)作物正常生長。由于OPs 具有品種豐富、價格低廉和易被生物降解的優(yōu)點，在有機氯農(nóng)藥開始限制并禁止使用(1970年)后，作為其優(yōu)勢農(nóng)藥替代品迅速發(fā)展[1]，成為我國需求量最多的農(nóng)藥之一。據(jù)中國農(nóng)藥工業(yè)協(xié)會統(tǒng)計，2015年，我國農(nóng)藥總用量為30 萬t，其中OPs 用量為7.05 萬t(折百量)，占我國農(nóng)藥總用量的20% 以上。然而農(nóng)藥利用率普遍偏低，僅為35% 左右，剩余農(nóng)藥殘留在土壤、植物以及大氣中[2]，對環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)存在潛在的毒害作用。土層中殘留的OPs 會隨著大氣降水或灌溉水下滲，污染地下水[3]；OPs 易吸附于土壤顆粒上，破壞土壤結(jié)構(gòu)和功能，進而影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量[4]；同時OPs 污染會刺激土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[5]，使耐受農(nóng)藥的菌群替代敏感種成為優(yōu)勢種群，微生物種類減少，嚴(yán)重時導(dǎo)致物種滅絕，生物多樣性降低[6]。研究表明，大部分OPs 屬于高毒性，可通過皮膚接觸、呼吸吸入、食用食物等途徑進入人體，抑制體內(nèi)膽堿酯酶的活性，造成生物體中毒[7]。據(jù)統(tǒng)計，由于環(huán)境中OPs 的暴露，每年約有300 萬人中毒，20 萬人死亡[8]。土壤OPs 污染防治已成為目前全球面臨的嚴(yán)重問題。

針對OPs 污染土壤的環(huán)境問題，目前的主要修復(fù)技術(shù)包括物理、化學(xué)及生物方法。而微生物在環(huán)境中分布廣泛，具有降解效率高、代謝途徑多、無二次污染的特點，成為目前降解OPs 的主要手段[9]。大量研究證明，自然界中存在多種微生物可利用OPs 作為碳源和能源，將其降解為小分子低毒或無毒物質(zhì)，最終轉(zhuǎn)化為CO2、水和礦物質(zhì)，實現(xiàn)無害化處理[10]。1971 年，首次有研究表明，微生物可降解OPs，由于殺蟲劑二嗪農(nóng)的生物降解，有害病蟲褐飛虱的控制效率有所下降[11]。此后通過富集、馴化、分離的純培養(yǎng)方法，篩選出多種能夠降解OPs 的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類等[12]，并對農(nóng)藥的降解途徑以及代謝方式進行了研究。微生物降解OPs 作為一種高效清除農(nóng)藥污染的環(huán)境生物技術(shù)已成為研究熱點。

近年來，利用新型分子生物學(xué)技術(shù)識別功能降解微生物取得了顯著進展，在此基礎(chǔ)上，本文對通過不可培養(yǎng)方法識別環(huán)境中OPs 降解功能性微生物的技術(shù)進行論述，揭示其在OPs 污染土壤中微生物降解的應(yīng)用前景。同時概述了OPs 在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化過程、微生物降解途徑、降解功能基因、降解過程中的限制因素以及植物-微生物聯(lián)合修復(fù) OPs 污染土壤的作用，為有效降低或清除環(huán)境中OPs 殘留提供科學(xué)依據(jù)。本文也批判性地綜述了微生物降解OPs 存在的問題，并對今后主要研究方向進行了討論。

1 OPs 在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化

OPs 在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化是一個復(fù)雜的過程，了解OPs 在土壤中的遷移行為是評價其安全性的重要依據(jù)。一般來說，農(nóng)藥在地下水系統(tǒng)中的遷移轉(zhuǎn)化過程包括：通過土壤表面蒸發(fā)進入大氣；經(jīng)徑流進入地表水或受淋溶進入地下水，污染地下水；以及植物根系吸收、土壤吸附、微生物的降解等[13]，如圖1 所示。OPs 在土層中的遷移與其本身吸附、降解、揮發(fā)性能相關(guān)，另外土壤有機碳含量、含水量、黏粒含量、pH 等因素也會影響農(nóng)藥的遷移能力[14]。調(diào)研結(jié)果表明，國內(nèi)外研究OPs 在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化方法有土柱淋溶法[15]、土壤薄層層析法[16]、同位素示蹤法[17]等。

圖1 OPs 在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化

為了綜合各種環(huán)境因素的影響，通過構(gòu)建模型的方法來表征農(nóng)藥在土壤中的運移規(guī)律已成為國內(nèi)外的研究熱點。楊大文等[18]建立了非飽和土壤中農(nóng)藥運移的數(shù)值模型，并利用滅幼脲III 號土柱淋溶試驗得到驗證，分析出農(nóng)藥在土壤中遷移轉(zhuǎn)化的主要影響因素是土壤吸附和農(nóng)藥的降解。另外，基于過程模擬的根區(qū)水質(zhì)模型(RZWQM)也被廣泛應(yīng)用，可以對農(nóng)藥在“植物-土壤-地下水”農(nóng)田系統(tǒng)中的運移和歸宿進行模擬預(yù)測[19]，但研究發(fā)現(xiàn)該模型對大孔土壤適用，而真實的土壤孔隙具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)性，包括大孔、小孔、微孔和死孔[20]。模擬土壤優(yōu)先流的結(jié)構(gòu)化土壤中農(nóng)藥的輸送模型也取得相當(dāng)大的進展[13]，Kjar 等[21]評估土壤優(yōu)先流和顆粒促進運輸模式對農(nóng)藥草甘膦和二甲戊樂靈的浸出影響，發(fā)現(xiàn)兩種模式均可增強該殺蟲劑的浸出性能。另外，Niu 等[22]對中國可耕地土壤中 DDT 的遷移轉(zhuǎn)化途徑進行評估，開發(fā)了基于多元回歸分析的方程來預(yù)測土壤中 DDT 的濃度。

2 OPs污染土壤微生物修復(fù)的特性

2.1 基于富集–馴化–培養(yǎng)方法的OPs降解微生物的篩選

篩選能夠降解OPs 微生物的途徑主要有兩種：在長期受OPs 污染的土壤、污泥、水體等環(huán)境下采樣，在以O(shè)Ps 為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基中經(jīng)富集-馴化的純培養(yǎng)方法，分離出能夠降解OPs 的微生物，再以此為基礎(chǔ)，通過細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)獲得高效降解菌種[23]。其中，通過原生質(zhì)融合、基因重組等技術(shù)分離篩選出高效降解菌成為研究的熱點。另一種是通過人為向環(huán)境中施加農(nóng)藥，定向培育出能夠降解OPs 的優(yōu)良菌種，經(jīng)再次施藥，測定降解速率，驗證優(yōu)良菌種是否培育完全，之后將高效菌株分離出來[24-25]，此方法也是基于利用純培養(yǎng)篩選菌株的原理。

目前，國內(nèi)外已篩選出多種具有高效降解特性的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類。其中分離出的微生物大部分屬于細(xì)菌，涵蓋假單胞菌屬()、芽孢桿菌屬()、黃桿菌屬()、蒼白桿菌屬()、鄰單胞菌屬()、不動桿菌屬()等，而真菌在農(nóng)藥降解方面的報道相對較少。研究表明，與細(xì)菌相比，在自然條件下真菌具有較強的生存能力及降解能力，同時真菌具有生物量豐富、遺傳特性穩(wěn)定的特點[26]，因此，篩選出對OPs 具有廣譜降解特性的真菌是治理農(nóng)藥污染土壤的有效途徑。解順昌等[27]從土壤中分離出一株新型的能夠降解甲基對硫磷的真菌JMUPMD-2，經(jīng)鑒定為米曲霉()，并研究其對甲基對硫磷的耐受性，結(jié)果顯示耐受濃度顯著高于國標(biāo)最高排放標(biāo)準(zhǔn)，對治理甲基對硫磷的污染具有良好的應(yīng)用前景。付文祥[28]篩選出一株能高效降解敵敵畏的菌株，鑒定為木霉FM10 (. FM10)，對敵敵畏的降解率高達86.7%。Tian 等[29]分離出一株以敵百蟲為唯一碳源和磷源的真菌，鑒定為曲霉菌，并進一步研究其降解途徑。表1 列出6 種環(huán)境中污染水平較高的OPs降解微生物種類。

表1 6 種污染水平較高的OPs 及其降解微生物種類

2.2 基于不可培養(yǎng)方法的OPs 降解功能微生物的篩選

常規(guī)的實驗室純培養(yǎng)方法分離出的微生物只是群落系統(tǒng)發(fā)育中的一部分，與自然生態(tài)環(huán)境中存在的降解功能性微生物信息差異較大。事實上，生態(tài)環(huán)境中有99% 以上的微生物是活的不可培養(yǎng)微生物，現(xiàn)階段這些微生物的功能尚未得到很好的表征[57]。近年來，越來越多的新型分子生物學(xué)技術(shù)被用于揭示環(huán)境污染物與其功能微生物的作用關(guān)系。穩(wěn)定同位素探測技術(shù)(stable-isotope probing，SIP)將非培養(yǎng)的微生物與特異性穩(wěn)定同位素標(biāo)記底物的代謝過程相聯(lián)系，已應(yīng)用于鑒定和表征降解環(huán)境中農(nóng)藥的功能微生物[58-59]。其原理為：利用穩(wěn)定性同位素(13C或15N)標(biāo)記營養(yǎng)物質(zhì)，由于微生物的自身代謝使這些標(biāo)記物被同化吸收進入體內(nèi)，通過提取、分離、純化、鑒定微生物體內(nèi)核酸(DNA、RNA)或磷脂脂肪酸(PLFA)等生物標(biāo)志物，從而揭示微生物功能[60-61]。2000 年英國J. Colin Murrell 課題組最早采用13C-甲醇培養(yǎng)森林土壤，通過密度梯度離心方法首次成功獲得13C-DNA，發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)微生物以及酸性細(xì)菌具有同化甲醇的能力[62]。此后Cupples 和 Sims[63]將DNA-穩(wěn)定同位素探針(DNA-SIP)技術(shù)用于原位土壤中除草劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)降解功能微生物的研究，揭開了不依賴于純培養(yǎng)技術(shù)發(fā)掘環(huán)境中功能微生物的序幕。Tong 等[64]利用13C-五氯苯酚培養(yǎng)稻田土壤，利用密度梯度離心法分離DNA，通過末端限制性片段長度多樣性(TRFLP)和高通量測序(PCR)識別出稻田土壤中五氯苯酚厭氧降解的功能微生物是β-變形菌門的屬。

2014 年，Zhang 等[65]開發(fā)了一種新型磁性納米材料介導(dǎo)(magnetic nanoparticl e-mediated isolation，MMI)識別不可培養(yǎng)微生物的技術(shù)，并應(yīng)用于苯酚污染的原位活性污泥中，分離出不可培養(yǎng)的降解功能微生物，其原理為：利用磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNPs)將復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中的微生物細(xì)胞功能化，使其具有磁性作用；當(dāng)提供污染物苯酚作為唯一碳源時，具有降解特性的功能化微生物進行細(xì)胞代謝在體系中分裂，分裂產(chǎn)生的細(xì)胞表面不再有磁性材料包被；通過外加磁場，可以將活性降解功能微生物從復(fù)雜體系中分離出來。該方法克服了DNA- SIP 方法不能獲得活體功能微生物的弊端，開拓了利用磁性納米材料分離環(huán)境中不可培養(yǎng)微生物的研究領(lǐng)域。2016年，Wang等[66]將該技術(shù)應(yīng)用于原油污染土壤中功能性烷烴降解菌的分離和表征。目前還未有應(yīng)用于識別農(nóng)藥降解功能微生物的相關(guān)報道，但是基于該技術(shù)對環(huán)境污染物降解功能菌篩選的原理，在分離和表征OPs 污染土壤中原位降解活體功能微生物領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

2.3 降解 OPs 的功能基因

一般OPs由3個磷脂鍵組成，磷脂鍵的水解可以使OPs毒性降低。而有機磷降解酶可破壞磷脂鍵，起到OPs的去毒效果。目前國內(nèi)外已對編碼OPs降解酶的基因展開大量研究，并從不同生物體中分離出多種降解基因，如表2所示。第一個有機磷降解基因()在中發(fā)現(xiàn)，并顯示位于質(zhì)粒上，之后對該基因進行廣泛研究。Cui等[67]從克隆出的甲基對硫磷水解酶基因()與來自的基因不具有同源性，是一種新型有機磷水解酶基因，可將甲基對硫磷水解為對硝基酚。另外，Islam 等[68]在降解毒死蜱的短乳桿菌WCP902 中分離并克隆了編碼有機磷水解酶基因，使之在大腸桿菌中得到表達，研究表明，pH 6.0、35℃時該基因編碼的水解酶表現(xiàn)出降解OPs 的最佳活性。Chino-Flores等[69]將來自腸桿菌屬Cons002 的基因在大腸桿菌中克隆并表達，該基因由753 pb 組成，編碼25 kDa 的蛋白質(zhì)，并與其他有機磷降解基因沒有同源性，具有廣譜性，可以同時水解甲基對硫磷、對硫磷和磷酸鹽等。伍寧豐課題組[70]從篩選的假產(chǎn)堿假單胞菌()中發(fā)現(xiàn)OPs 降解酶—— OPHC2 的活性，克隆該酶的基因()與同類基因最高有46.4% 的同源性，是一種新的OPs 降解酶基因，同時該基因具有降解安全、工序簡單的優(yōu)點，在基因工程中具有良好的應(yīng)用前景。

表2 國內(nèi)外分離的OPs 降解酶基因

2.4 OPs 污染土壤微生物降解途徑及機理

微生物作用于OPs 的方式有兩種：一是微生物通過酶促反應(yīng)直接作用于OPs，包括3個步驟：首先OPs 吸附在微生物細(xì)胞表面；然后農(nóng)藥透過細(xì)胞膜進入微生物細(xì)胞內(nèi)；最后微生物本身的降解酶與進入細(xì)胞內(nèi)的農(nóng)藥發(fā)生酶促反應(yīng)，使OPs 分解。另一種是微生物通過自身活動結(jié)合環(huán)境中其他物質(zhì)間接分解OPs[75]，包括3種方式：礦化作用、共代謝作用和中間協(xié)同代謝。酶促反應(yīng)的主要機制是脫氫、氧化、還原、合成等，參與的降解酶一般包括水解酶、裂解酶、氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶等，其主要作用形式如表3 所示[24]。

表3 OPs 微生物降解酶類型及作用機制

許多微生物對OPs 的降解途徑已被研究證明，Tian 等[29]通過分析曲霉菌PA F-2降解敵百蟲(trichlorfon，TCF)的中間產(chǎn)物，提出了敵百蟲的生物降解途徑。敵百蟲在堿性條件下會水解為毒性更強的敵敵畏(dichlorvos，DDCV)，接種PA F-2 后，TCF 經(jīng)P-C 鍵裂解水解為磷酸二甲酯(dimethyl hydrogen phosphate)和水合氯醛(2.2.2-三氯-1.1-乙二醇)，其中磷酸二甲酯為主要代謝中間體，然后脫氧形成中亞磷酸二甲酯(dimethyl hydrogen phosphite)，繼而被代謝為PO3– 4、H2O 和CO2，該菌可以以TCF 作為唯一碳源和磷源。而DDCV 在降解過程中以磷酸三甲酯(trimethyl orthophosphate)和二氯甲烷(dichloromethane)作為主要代謝中間體，過程如表4 所示。甲基對硫磷(methyl parathion，MP)的代謝途徑也被清楚闡明。Qiu 等[39]從土壤中分離出一株蒼白桿菌B2 能迅速礦化MP，經(jīng)水解、羥基化、氧化脫硝基、雙氧酶作用形成對硝基苯酚(PNP)、4-硝基鄰苯酚(4-NC)、1,2,4-苯三酚(BT)、對苯二酚(HQ)4種主要代謝物，該菌可以將MP 完全降解(表4)。王軍華等[76]提出草甘膦(glyphosate)的主要降解途徑包括2 條：一種是通過C-N鍵斷裂生成氨甲基膦酸(AMAP)和乙醛酸；或者通過C-P 鍵斷裂生成肌氨酸，為微生物提供磷源。一般1 株降解菌只進行一種代謝途徑，但研究發(fā)現(xiàn)，一種菌株如GPK3 可同時存在這2 種降解方式，在該菌株降解草甘膦的中間產(chǎn)物中同時檢測到AMAP 和少量肌氨酸，表明該微生物主要進行AMAP 降解途徑，同時還可裂解草甘膦的C-P 鍵[77]。

表4 OPs 的生物降解途徑

2.5 OPs 污染土壤的微生物原位修復(fù)

目前，微生物修復(fù)OPs 污染土壤還處于實驗室或小規(guī)模田間試驗階段，用于原位修復(fù)OPs 污染土壤的報道很少。李順鵬等[78]從活性污泥中分離出甲基對硫磷降解菌，并利用該菌株進行小區(qū)試驗和田間試驗，探究其降解效果，結(jié)果表明，小區(qū)試驗中接種菌株的稻米中甲基對硫磷含量比對照組降低了81.88% ~ 100%，而田間應(yīng)用試驗中，噴灑降解菌的稻米中基本檢測不出甲基對硫磷農(nóng)藥的殘留。這項研究表明利用微生物可有效消除土壤中的農(nóng)藥殘留。之后Yang 等[79]分離出能夠降解毒死蜱的菌株，接種于土壤后發(fā)現(xiàn)毒死蜱的降解效率明顯提高。

但這種生物投菌的方法具有局限性，原因在于，大部分微生物對環(huán)境較為敏感，直接在受污染的環(huán)境中投加微生物菌株，其適應(yīng)環(huán)境的能力遠(yuǎn)不及土著微生物，因此無法發(fā)揮作用。而根據(jù)環(huán)境條件，將篩選出的具有降解功能的微生物按合適的比例混合，配制成微生物菌劑再投加到環(huán)境中的方法在一定程度上可避免上述問題，在凈化環(huán)境污染方面得到廣泛應(yīng)用[80]。研究表明，從毒死蜱污染土壤中篩選出的菌株處理后制成DSP 菌劑，施加到大棚和露地土壤中，可以促進毒死蜱的降解，與對照相比，毒死蜱的半衰期分別縮短了12.0%(=0.05)和37.1% (≤0.05)[81]。此外，利用混合微生物菌群來修復(fù)有機物污染土壤的技術(shù)已得到研究，劉一凡等[82]通過模擬污染土壤體系，研究添加嗜熱菌和多環(huán)芳烴特異性降解菌的混合微生物對污染體系中菲、芘的去除效果，研究表明，在原位土壤中接種這兩種優(yōu)勢微生物培養(yǎng) 18 d，菲、芘的去除率分別為 87.6%、92.5%，與對照組相比顯著提高了菲、芘的降解率，降低了菲、芘的半衰期。

2.6 OPs 污染土壤的植物–功能微生物聯(lián)合修復(fù)

目前，將分離出的微生物與其他工藝聯(lián)合修復(fù)OPs 污染土壤已成為一種頗為有效的方法。而植物-功能微生物的聯(lián)合修復(fù)技術(shù)是今后關(guān)注的重要領(lǐng)域之一，這種修復(fù)技術(shù)利用土壤-植物-功能微生物的共存關(guān)系，分別發(fā)揮植物和微生物兩者的優(yōu)勢來提高污染土壤OPs 的去除效率[83]。目前，植物-微生物聯(lián)合修復(fù)包括兩種類型：一種是植物-專性降解菌聯(lián)合修復(fù)；另一種是植物-菌根真菌聯(lián)合修復(fù)。前者是通過向污染土壤中接種外來具有專性降解特性的降解菌株，與種植的植物共同去除污染物。后者是利用土壤中與植物根共生的營養(yǎng)體，促進有機污染物的降解和轉(zhuǎn)化[84]。

近年來，植物-功能微生物聯(lián)合技術(shù)修復(fù)有機物污染土壤已取得較好的成果，而在修復(fù) OPs 污染土壤方面尚待進一步研究。表 5 列出了近幾年國內(nèi)外對有機物污染土壤的植物-功能微生物聯(lián)合修復(fù)研究。林璀[85]將分離的專性降解菌株DSP-A 分別聯(lián)合高丹草、紫花苜蓿、多花黑麥草，進行毒死蜱污染土壤的生物修復(fù)，結(jié)果表明，植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的效果優(yōu)于單一植物及單一微生物的修復(fù)效果，與DSP-A 聯(lián)合修復(fù)效果最好的是高丹草，該組合可降解96.44% 的毒死蜱。朱治強[86]在 Cd-DDT 復(fù)合污染土壤中，利用超積累植物東南景天和低積累植物南瓜混作，并接種 DDT 降解菌株DDT-1，結(jié)果表明東南景天和南瓜地上部 DDT 含量分別降低 19.3% ~ 39.2%、38.2% ~ 44.5%，且這項聯(lián)合修復(fù)技術(shù)可在修復(fù)復(fù)合污染土壤的同時保證產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。Gao 等[87]研究發(fā)現(xiàn)菲、芴污染土壤種植黑麥草后，與其共生的從枝菌根菌可以將多環(huán)芳烴污染物吸收并運輸?shù)街参镏?，降低土壤中污染物濃度。而某些農(nóng)藥如久效磷對植物的根際微生物有一定的刺激作用，可對植物的生長產(chǎn)生有益的作用[88]。Jabeen 等[89]利用黑麥草和對毒死蜱具有降解特性的內(nèi)生根瘤菌 HN3 聯(lián)合修復(fù)毒死蜱污染土壤，研究發(fā)現(xiàn) HN3 可促進黑麥草根際細(xì)菌的定植，有助于去除土壤中毒死蜱及其有毒代謝物，修復(fù)污染土壤。

表5 國內(nèi)外污染土壤的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)研究

3 OPs 污染土壤微生物降解的限制因素

3.1 環(huán)境因素

微生物對污染土壤中OPs 的降解主要受土壤pH、溫度、含水量、有機質(zhì)含量、根系分泌物等環(huán)境因素的限制。大多數(shù)微生物在一定的pH 和溫度下表現(xiàn)出較好的降解特性，方華[81]在研究中也發(fā)現(xiàn)分離株DSP 對毒死蜱的降解速率隨溫度的升高而升高，在pH 7.0、35℃時降解效果最好。研究發(fā)現(xiàn)，微生物一般適合生長在中性或弱堿性環(huán)境中。水分是微生物生長所必需的，土壤含水量在影響微生物活性的同時會影響農(nóng)藥的生物利用度[92]，含水量過高或過低均會影響微生物正常生長。有機質(zhì)是土壤的重要組成成分，提供微生物生長所需的碳源。研究表明，土壤含水量和有機質(zhì)含量增加可提高微生物的活性，使OPs 降解速率加快[93]。根系分泌物可為根際微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)，使根際微生物的活動增強，因而加快對土壤污染物OPs 的降解[94]。

3.2 農(nóng)藥本身因素

OPs 本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)也是微生物降解的限制因素[95]。農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)影響其溶解性、分子排列和空間結(jié)構(gòu)、化學(xué)官能團、分子間的吸引和排斥等特征，并因此影響農(nóng)藥能否被微生物所攝取[96]。OPs 具有相似的結(jié)構(gòu)，但取代基上的鹵素、苯環(huán)、氮、氫等均會限制微生物的降解。Ramu 和Seetharaman[54]分離出的假單胞菌Is-6 對甲胺磷的降解效率達92%，對樂果、對硫磷、甲基對硫磷、毒死蜱和馬拉硫磷等也具有一定的降解特性。農(nóng)藥的物理化學(xué)性質(zhì)如水溶性、揮發(fā)性、吸附性等也會對微生物的降解產(chǎn)生影響。

由于OPs 的疏水性會影響微生物降解的效率，因此，改進污染物的生物可利用性已成為微生物修復(fù)OPs 的關(guān)鍵。而具有親水、親油特性的表面活性劑可增強有機污染物的溶解性，提高其生物可利用性，目前主要集中在修復(fù)土壤中的PAHs、PCBs、石油，農(nóng)藥方面的研究多是針對有機氯農(nóng)藥[97]。Ahmad 等[98]發(fā)現(xiàn)在生物表面活性劑存在下，菲的生物降解更加明顯。楊慧娟等[99]研究了AGP0810、AGP1214 等3 種生物表面活性劑對土壤中DDT 等有機氯農(nóng)藥、氯氰菊酯、乙草胺的去除效果，結(jié)果表明，這3 種表面活性劑均起到增溶的作用，并且AGP0810 與皂角苷復(fù)配表面活性劑對六六六的去除率最高達82.70%，對乙草胺的去除率最高達98.62%，顯著優(yōu)于單一表面活性劑。陳蘇等[100]研究表面活性劑和DDT 降解菌株聯(lián)合作用對DDT 污染土壤修復(fù)效果，研究顯示，表面活性劑-菌株聯(lián)合處理可顯著提高DDT 的降解效率，處理1 個月后DDT 的降解率最高可達63.53%。

4 存在問題及展望

近年來，OPs 在環(huán)境中的殘留帶來的環(huán)境問題日益嚴(yán)重，高效、低污染、低成本的微生物降解技術(shù)取得良好發(fā)展，成為當(dāng)今去除環(huán)境中農(nóng)藥污染頗為有效的途徑。結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，本文針對目前研究存在的問題，提出了今后的研究方向：

1) 目前對OPs 的研究多集中在農(nóng)藥母體，對中間代謝產(chǎn)物研究不夠充分。某些品種的OPs 母體毒性不高，但中間產(chǎn)物具有高毒性，應(yīng)深入研究微生物降解OPs 的機理和代謝途徑。

2) 現(xiàn)階段的研究獲取降解菌株的手段單一，主要是在實驗室通過純培養(yǎng)方法獲得，但生態(tài)環(huán)境中超過99% 的功能性微生物是不可培養(yǎng)的。利用新型分子生物學(xué)技術(shù)——SIP 方法、磁性納米材料，結(jié)合宏基因組學(xué)、基因工程、高通量測序等篩選環(huán)境中不可培養(yǎng)的高效降解OPs 的優(yōu)勢菌群，完善高效降解菌的資源庫，具有良好的應(yīng)用前景。

3) OPs 污染土壤原位微生物修復(fù)技術(shù)具有局限性，但作為一種綠色、環(huán)保、節(jié)能的修復(fù)技術(shù)具有巨大的發(fā)展前景，因此深入研究原位微生物修復(fù)的影響因素、作用機制，綜合分析農(nóng)藥在微生物體內(nèi)遷移、轉(zhuǎn)化、代謝的機理是未來一個科學(xué)研究的方向。

4) 加強對微生物菌劑作用機理的研究，探索在不同環(huán)境下的作用對象。農(nóng)業(yè)實際應(yīng)用中可能存在多種OPs 同時使用的情況，因此應(yīng)考慮幾種農(nóng)藥同時存在的污染情況，可利用微生物混合培養(yǎng)技術(shù)，研究混合菌系之間協(xié)同或抑制機理，篩選出最佳的微生物組合，充分利用微生物的優(yōu)勢特性。

5) 進一步篩選能夠高富集 OPs 的植物和高降解 OPs 的微生物，在聯(lián)合修復(fù)過程中同時施以生化強化措施，并對其影響機理進行研究[101]，建立一套適合 OPs 污染土壤植物–功能微生物聯(lián)合修復(fù)的安全性體系，提高修復(fù)效率。

隨著研究的深入，OPs 污染土壤的微生物降解技術(shù)將會得到進一步完善，為解決環(huán)境中農(nóng)藥殘留提供技術(shù)支持，成為一種環(huán)境友好和經(jīng)濟有效的修復(fù)途徑。

致謝：感謝王志強、閆伯俊、岳會芳在成文過程中給予的幫助。

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Microbial Degradation of Organophosphorus Pesticide Contaminated Soils

ZHANG Nana1,2, JIANG Bo1,2, XING Yi1,2*, LIAN Luning1,2, CHEN Yating1,2

(1 School of Energy and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China; 2 Beijing Key Laboratory of Resource-oriented Treatment of Industrial Pollutants, Beijing 100083, China)

Organophosphorus pesticides(OPs) are widely used in agriculture, which have caused serious environmental pollution and ecological damage. In addition, OPs can accumulate in the organisms through food chain, leading to severe threat to human health. Microbial degradation serves as an efficient tool for remediation of OPs contaminated soils without secondary pollution. At present, the cultivable method is most commonly used for screening OPs-degrading microorganisms, while most microorganisms are uncultivable in the natural ecological environment. Identification of functional microbes with the novel uncultivable technology is becoming a promising technology. This paper, based on the use of OPs and the environmental problems, summarized the migration and transformation patterns of OPs in soils and the identification of the uncultivable functional microbes using the recently developed Stable Isotope Probing (SIP) and magnetic nanoparticle technology, discussed the functional genes for OPs degradation and the degradation pathways as well as the combination of plants and microbes in remediation of OPs-contaminated soils, introduced the limiting environmental factors influencing OPs degradation, including pH, temperature, organic matter content, etc., and finally, put forward the challenges and prospectives of microbial degradation of OPs.

Organophosphorus pesticides; Microbial degradation; Uncultivable microorganisms; Functional gene; Degradation pathways

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(FRF-TP-16-063A1)資助。

(Xingyi@ustb.edu.cn)

張娜娜(1992—)，女，河北衡水人，碩士研究生，研究方向為污染場地的微生物修復(fù)。E-mail：zhcm.na@foxmail.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.04.001

S154

A