黃佳純，柴爽，黃宏興，汪悅東

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510240)

雌激素對婦女骨骼所具有的重要作用眾所周知，雌激素水平的下降加速了骨質(zhì)流失并增加了骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的可能性[1]。兒童期時(shí)雌激素主要作用于骨骺的融合，到了成年期則用于維持骨小梁骨量結(jié)構(gòu)[2]。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥患者的B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl2)表達(dá)下降，老年大鼠的Bcl2蛋白水平亦有所降低[4]，骨質(zhì)疏松癥與性別、年齡相關(guān)，其發(fā)生與雌激素的缺乏和衰老的關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)前期研究[5]表明，Bcl2基因沉默后MG63細(xì)胞存活率降低，而Bak1基因沉默后MG63細(xì)胞存活率升高，表明Bcl2/Bak1在調(diào)控MG63細(xì)胞凋亡平衡當(dāng)中發(fā)揮重要作用，Bcl2基因沉默后MG63細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)表達(dá)降低，而Bak基因沉默的MG63細(xì)胞ALP表達(dá)增強(qiáng)，說明Bcl2/Bak在調(diào)節(jié)成骨活動(dòng)中起到了重要作用。本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討雌激素相關(guān)受體α(estrogen-related receptor alpha，ERRɑ)與Bcl2家族蛋白對骨質(zhì)疏松癥的作用影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人成骨肉瘤細(xì)胞(MG63)由中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫提供，Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Pen/Strep從Gibco公司購買；Bak1(D4E4) Rabbit mAb、Bcl2(50E3) Rabbit mAb、ERRɑ(E1G1J) Rabbit mAb均自CST公司購入；HRP-Goat Anti-Mouse IgG、HRP-Goat Anti-Rabbit IgG均從Jackson公司購入；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、Lipofectamine 2000、TRIzol Reagent、One Shot?Stbl3TM E.coli感受態(tài)細(xì)胞、bP Clonase Ⅱ enzyme mix、LR Clonase Ⅱ enzyme mix、Taq DNA聚合酶均購自Invitorgen公司；Age Ⅰ、EcoR Ⅰ、Pac Ⅰ、T4 DNA連接酶購自NEb公司；MTT、RIPA細(xì)胞裂解液、EGTA均購自Sigma公司；DMSO購自廣州化學(xué)試劑廠；Calcium Indicators購自Molcular Probes公司；蛋白酶抑制劑/磷酸化抑制劑均于Merck公司購買；抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein-4，BMP-4)抗體、抗骨橋蛋白(osteopontin，OPN)抗體、抗Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)抗體、抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-ɑ)抗體于abcam公司購入；抗結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗體購自Santa公司；膠回收/純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京天根生物有限公司；DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞購自北京鼎國生物有限公司；蛋白酶K購自上海碧云天生物有限公司；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD 中國江蘇蘇凈)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(DHP-9052 中國上海-恒)；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、蛋白轉(zhuǎn)印儀、凝膠成像系統(tǒng)(伯樂)；普通PCR儀(TCS 中國博日)；熒光定量PCR儀(AbI 7500 美國Thermo)；酶標(biāo)儀(美國Thermo)；倒置熒光顯微鏡(IX73 美國OLYMPUS)；微孔板震蕩器(Scientific industries)；高速低溫離心機(jī)(beckMan-22R)；微量核酸定量儀(Thermo NanoDrop)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和總RNA提取 MG63細(xì)胞以1×106細(xì)胞/mL接種于T75，于5% CO2、飽和濕度下在DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待長至約80%融合時(shí)消化、收集細(xì)胞，傳代。舍棄舊培養(yǎng)基，以預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細(xì)胞3次，盡可能吸盡液體后加入1 mLTrizol破碎溶解細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 目的基因沉默重組腺病毒載體構(gòu)建 ERRɑ沉默重組腺病毒載體(Ad-shERRɑ)構(gòu)建：經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增目的基因、重組質(zhì)粒構(gòu)建、同源重組構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒、重組腺病毒顆粒的包裝、重組腺病毒滴度測定、重組腺病毒感染MG63細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)檢測Ad-shERRɑ重組腺病毒感染MG63后ERRɑ的表達(dá)以確定ERRɑ沉默重組腺病毒載體構(gòu)建成功。

Bak1及Bcl2沉默重組腺病毒載體(Ad-shBak1、Ad-shBcl2)構(gòu)建：構(gòu)建shRNA腺病毒載體并用其轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，篩選出shRNA腺病毒載體沉默效率最好的進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及定量PCR反應(yīng)，通過Western blot檢測shRNA腺病毒質(zhì)粒沉默效率后進(jìn)行腺病毒包裝。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 MG63細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，感染空載病毒組命名為NC對照組，感染Bak1和ERRɑ沉默重組腺病毒命名為Ad-shERRɑ+Ad-shBak1組，感染Bcl2和ERRɑ沉默重組腺病毒命名為Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2組，同時(shí)感染Bak1、Bcl2和ERRɑ沉默重組腺病毒命名為Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2組四組，感染復(fù)數(shù)(MOI)為50。重組腺病毒感染48h后，分別消化收集細(xì)胞，qPCR、Western blot檢測ERRɑ、Bcl2、Bak1在MG63細(xì)胞中的表達(dá)，以確定過表達(dá)重組腺病毒感染MG63后ERRɑ、Bcl2、Bak1基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用AbI7500公司自帶的PCR系統(tǒng)軟件分析，觀察擴(kuò)增曲線，分別計(jì)算出各組樣本的結(jié)果并進(jìn)行組間比較。

1.2.4 細(xì)胞增殖、ALP活性、鈣離子濃度檢測 MG63細(xì)胞感染重組腺病毒48h后，棄舊培養(yǎng)基，消化收集細(xì)胞，分別采用MTT法檢測MG63細(xì)胞增殖，用酶標(biāo)儀490 nm測定光密度值(OD)。ALP活性的測定：MG63細(xì)胞感染重組腺病毒48 h后，收集對數(shù)期MG63細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液后置于37℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，于冰上放置考馬斯亮藍(lán)蛋白定量后測定ALP活性。細(xì)胞鈣離子濃度的檢測：消化、收集細(xì)胞，PBS洗滌3次。取細(xì)胞懸液，加入Calcium Orange Indicator，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h上機(jī)，加入10% Triton 100后再加入CaCl2，吹打均勻，避光孵育10 min，測定熒光值。

1.2.5 骨調(diào)節(jié)蛋白BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ檢測 MG63細(xì)胞感染重組腺病毒48 h后，舍棄舊培養(yǎng)基，消化收集細(xì)胞，離心，提取總蛋白，樣品蛋白處理后測定蛋白濃度，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過夜后在室溫下洗滌3次，室溫下二抗孵育后洗滌3次，將膜蛋白放入暗匣中曝光進(jìn)行顯影和定影，化學(xué)發(fā)光顯色后使用Image J軟件處理系統(tǒng)分析各組目標(biāo)蛋白帶的光密度值進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié) 果

2.1 Ad-shERRɑ、Ad-shBak1、Ad-shBcl2對各組MG63細(xì)胞增殖、ALP活性、鈣離子濃度的影響結(jié)果(見表1，見圖1) 與NC對照組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)組細(xì)胞活性、ALP活性明顯升高，鈣離子濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組細(xì)胞活性、ALP活性均降低，鈣離子濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組的鈣離子濃度降低(P<0.01)，細(xì)胞活性、ALP活性亦下降，但差異不明顯(P>0.05)。與(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組與(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組細(xì)胞活性、ALP活性明顯下降，鈣離子濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組的細(xì)胞活性、鈣離子濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，ALP活性稍升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 Ad-shERRɑ干預(yù)Bak1、Bcl2重組腺病毒轉(zhuǎn)染的各組MG63細(xì)胞中骨調(diào)節(jié)蛋白的影響結(jié)果(見表2，見圖2～3) 與NC對照組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)組BMP-4、TNF-ɑ均降低，而CTGF、OPN、Runx2均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組BMP-4、CTGF、OPN、Runx2均降低，而TNF-ɑ升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組和(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組CTGF、OPN、Runx2和(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組BMP-4、TNF-ɑ均降低，而(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組TNF-ɑ升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組BMP-4雖亦降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組BMP-4、CTGF、OPN均升高，而TNF-ɑ降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Runx2基本持平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

雌激素相關(guān)受體ERR分α、β、γ3種亞型，迄今仍未發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)配體，其中對ERRα在腫瘤、冠心病、糖尿病等疾病中的功能作用研究受到較大的關(guān)注[6]。雌激素相關(guān)受體ERR和雌激素受體ER的序列在DNA結(jié)合域上相似度高達(dá)68%，在配體結(jié)合E域等蛋白的其他部分僅36%的相似度，這也許是ERRα不能與雌激素結(jié)合的原因之一[7-8]，但不少數(shù)據(jù)均強(qiáng)調(diào)了ERRα在調(diào)節(jié)骨代謝中的重要地位[9]，Shoukry等[10]以200例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女和180例健康且年齡匹配的絕經(jīng)后婦女作對照，通過AluI的PCR片段長度多態(tài)性，證明了ER-b AluI G/A和ERRa 23-重復(fù)多態(tài)性與骨密度(bone mineral density，BMD)的關(guān)聯(lián)，說明了ER-b和ERRa多態(tài)性可能對sRANKL水平產(chǎn)生影響。Huang等[11]的研究也表明了ERRα/Gls信號通路在MSCs成骨分化中發(fā)揮重要作用。近些年來，ERRα在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中的地位逐步被提高，其有望成為防治骨質(zhì)疏松癥的新靶點(diǎn)[12]。

B細(xì)胞淋巴瘤2家族蛋白介導(dǎo)內(nèi)源性凋亡通路[13]，根據(jù)家族內(nèi)各蛋白的功能和結(jié)構(gòu)可將其分成三個(gè)主要亞家族：4指Ad-shBcl2+Ad-shBak1組抗凋亡BCL2蛋白(BCL2，MCL1，BCLxL，BCLW，BFL1)，促凋亡效應(yīng)因子(BAK，BAX，BOK)和促凋亡蛋白BH3[14]，BCL2家族成員不僅能調(diào)控線粒體的凋亡，還能通過對Ca2+信號的調(diào)節(jié)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-16]。Song等人[3]發(fā)現(xiàn)與年輕大鼠相比，老年大鼠Bcl2蛋白水平降低了20%，并且老年大鼠的Bax蛋白水平比年輕大鼠高11%。國內(nèi)劉嘉眉等[4]檢測絕經(jīng)后婦女患者髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)中取下股骨頭或股骨頸中松質(zhì)骨成骨細(xì)胞中Caspase蛋白和Bcl2蛋白，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥組中Bcl2表達(dá)下降，即骨質(zhì)疏松癥組中細(xì)胞凋亡情況較對照組嚴(yán)重。國內(nèi)外的研究均表明，衰老或患骨質(zhì)疏松癥都會(huì)降低Bcl2的表達(dá)量。

表1 Ad-shERRɑ干預(yù)Bak1、Bcl2重組腺病毒轉(zhuǎn)染的各組MG63細(xì)胞增殖、ALP、鈣離子濃度影響±s)

表2 Ad-shERRɑ干預(yù)Bak1、Bcl2重組腺病毒轉(zhuǎn)染的各組MG63細(xì)胞中骨調(diào)節(jié)蛋白的影響±s，c/(μmol·L-1)]

圖1 各組MG63細(xì)胞增殖、ALP活性、鈣離子濃度檢測結(jié)果(GraphPad prism 5)

注：1指NC對照組；2指Ad-shBcl2組；3指Ad-shBak1組；

圖2 各組MG63細(xì)胞中(BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ)蛋白灰度分析(凝膠電泳法)

圖3 各組MG63細(xì)胞中BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ檢測結(jié)果

骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達(dá)對于骨骼的發(fā)育重塑至關(guān)重要[17]，有研究[18]表明，BMP4可促進(jìn)骨組織愈合時(shí)的血管生成和骨的再生，還可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成熟的軟骨細(xì)胞分化，增多軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)，有助于骨和軟骨組織的修復(fù)[19]。結(jié)締組織生長因子是一種細(xì)胞外基質(zhì)分泌蛋白，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增殖，促進(jìn)其分化為成熟多核破骨細(xì)胞，使破骨細(xì)胞的骨吸收功能被激活[20]，Hendesi等[21]實(shí)驗(yàn)說明，CTGF通過αvβ1整合素增強(qiáng)成骨細(xì)胞黏附，通過對細(xì)胞骨架的重組和Rac1的激活促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。骨橋蛋白可參與各種生物活動(dòng)包括基質(zhì)重組和組織鈣化，產(chǎn)生各種促炎細(xì)胞因子和趨化因子，以及抑制細(xì)胞凋亡活動(dòng)，在骨的形態(tài)發(fā)生和重塑上起著重要作用[22]。有體外實(shí)驗(yàn)[23]表明，Runx2在未成熟成骨細(xì)胞達(dá)到了最高的表達(dá)水平，而在成骨細(xì)胞成熟時(shí)表達(dá)減少了。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[24]說明，Runx2基因敲除的小鼠骨形成減少而導(dǎo)致骨質(zhì)下降。腫瘤壞死因子α是一種強(qiáng)大的破骨細(xì)胞激活因子，是骨代謝和骨重塑的重要調(diào)節(jié)因子，可以刺激破骨細(xì)胞的分化，屬于骨吸收因子。TNF-α可降低成骨細(xì)胞分化的特殊標(biāo)志物，還可以調(diào)控BMP-2的表達(dá)，可抑制成骨細(xì)胞的分化[25]。Liao等[26]實(shí)驗(yàn)證明，TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激是通過增加活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的合成速率和降低ROS的消除速率來實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-α蛋白的表達(dá)均與成骨細(xì)胞的增殖分化息息相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)前期研究表明[5]，沉默Bak1基因后MG63細(xì)胞細(xì)胞活性升高，成骨活動(dòng)增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，沉默Bcl2基因后MG63細(xì)胞細(xì)胞活性降低，成骨活動(dòng)減少，鈣離子濃度升高，而Bak1+Bcl2聯(lián)合沉默組與對照組在各觀察指標(biāo)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)研究中用沉默Bak1、Bcl2腺病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，再用沉默ERRα進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步研究不同組別MG63細(xì)胞的增殖、ALP活性、鈣離子濃度和相關(guān)蛋白的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默ERRα的干預(yù)能提高Bak1沉默腺病毒轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞活性，降低細(xì)胞鈣離子濃度，促進(jìn)BMP4、CTGF、OPN、Runx2等蛋白的表達(dá)和抑制TNF-α的表達(dá)，且能降低Bcl2沉默腺病毒轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞活性，升高細(xì)胞鈣離子濃度，抑制BMP4、CTGF、OPN、Runx2等蛋白的表達(dá)和促進(jìn)TNF-α的表達(dá)；而對于被沉默Bak1、Bcl2同時(shí)轉(zhuǎn)染的MG63細(xì)胞，其細(xì)胞鈣離子濃度和蛋白表達(dá)量均降低，對細(xì)胞活性的影響不明顯。BMP4、CTGF、OPN、Runx2為促成骨蛋白，TNF-α可削弱成骨分化，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)及前期研究[5]可說明，ERRα的沉默可能間接減弱了雌激素對成骨的作用，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了雌激素相關(guān)受體在骨代謝中的地位。

2014 年美國國家骨質(zhì)疏松癥基金會(huì)的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥臨床醫(yī)生指南[27]認(rèn)為，人體99%的鈣儲(chǔ)量在骨骼中，當(dāng)外源性鈣供應(yīng)不足時(shí)，骨組織從骨骼吸收出鈣，釋放到血液，以保持血清鈣水平的恒定。胞內(nèi)高濃度的Ca2+可激活Ca2+依賴性酶，使DNA發(fā)生斷裂，細(xì)胞骨架破壞，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。絕經(jīng)后的雌激素水平急速下降，使破骨細(xì)胞形成和成骨細(xì)胞凋亡的速度加快，從而導(dǎo)致骨流失[29]，骨是Ca2+的重要儲(chǔ)存場所，當(dāng)骨量下降，Ca2+濃度升高，加速了骨細(xì)胞的凋亡，二者之間的相互作用或許是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的關(guān)鍵。Bcl2蛋白是鈣信號的主要抑制因子之一[15-16]，因此，ERRα和Bcl2基因與胞內(nèi)Ca2+濃度間的關(guān)系是值得探討的。

總之，此次研究證實(shí)了沉默ERRα對沉默Bak1、Bcl2腺病毒載體轉(zhuǎn)染的MG63細(xì)胞增殖分化具有影響，這為診治骨質(zhì)疏松提供了新的思路。然而本實(shí)驗(yàn)存在一定局限，沒能更深入探討其具體作用方式，故需在此基礎(chǔ)上對ERRα、Bak1、Bcl2三者間共同作用及與其他信號通路的聯(lián)系進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探討。