王希春 儲(chǔ)小燕 張婭菲 朱 雷 范夢(mèng)雪 馮士彬 李 玉 吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥230036)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又稱為嘔吐毒素，是由多種鐮刀菌侵染小麥和玉米等谷類作物產(chǎn)生的一種有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，由于其在食物鏈中具有高水平暴露和高污染頻率特性而受到極大關(guān)注[1-2]。DON作為谷物中檢出率和檢出量最高的霉菌毒素，對(duì)人類和動(dòng)物的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[3]。通過(guò)研究DON對(duì)動(dòng)物流行病學(xué)的影響，食品科學(xué)委員會(huì)(SCF)在2002年已經(jīng)設(shè)定了DON的每日可接受攝入量(TDI)為1.0 μg/kg[4]。研究表明，DON對(duì)動(dòng)物的毒性作用主要體現(xiàn)在損害免疫系統(tǒng)、胃腸道和大腦的健康[5]。當(dāng)豬攝入DON后，表現(xiàn)為采食量下降，體重增加緩慢，攝入的DON至少有67%被吸收，表明豬對(duì)DON有高度敏感性[6]。Lessard等[7]給仔豬飼喂DON污染飼糧，發(fā)現(xiàn)回腸中主要抗氧化劑谷胱甘肽過(guò)氧化物酶2(GPx-2)基因表達(dá)上調(diào)，而編碼酶的抗氧化劑谷胱甘肽過(guò)氧化物酶3(GPx-3)、超氧化物歧化酶3(SOD-3)基因表達(dá)下調(diào)，表明DON對(duì)仔豬腸道免疫系統(tǒng)具有一定的毒性作用。盡管有人認(rèn)為成年家畜對(duì)DON具有一定的耐受性，但DON對(duì)仔豬的毒害作用尤其是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷卻不容忽視。Gaigé等[8]試驗(yàn)證明，腦是DON的敏感區(qū)域，也是激活神經(jīng)元的區(qū)域，下丘腦和腦干能調(diào)節(jié)DON引起的反應(yīng)。耿芳芳等[9]研究報(bào)道，DON可影響雛雞腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)的分泌，同時(shí)改變神經(jīng)細(xì)胞中鈣離子(Ca2+)和組織中鈣調(diào)蛋白(CaM)含量及組織中CaMmRNA相對(duì)表達(dá)量，表明DON體內(nèi)暴露可對(duì)雛雞產(chǎn)生一定的神經(jīng)毒性。

研究發(fā)現(xiàn)，DON對(duì)胃腸道黏膜細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等均具有一定的損傷作用[1,10]。目前DON對(duì)動(dòng)物體內(nèi)和體外毒性作用的研究較多，而關(guān)于DON對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的體外研究尚未見(jiàn)報(bào)道。由于豬是對(duì)DON最敏感的試驗(yàn)動(dòng)物，而海馬神經(jīng)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最容易受外界因素影響而受損的區(qū)域，因此，本試驗(yàn)以仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞(piglet hippocampal nerve cells，PHNCs)為對(duì)象，研究DON染毒后對(duì)細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化及鈣穩(wěn)態(tài)的影響，以探討DON誘導(dǎo)的仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，為進(jìn)一步闡明DON的毒性機(jī)理提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞購(gòu)自賽齊生物有限公司；DON標(biāo)準(zhǔn)品(濃度大于99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone有限公司；胎牛血清、二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Clark有限公司；胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；5-HT、DA、乙酰膽堿(ACH)、γ-氨基丁酸(GABA)、NE、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Ca2+、CaM試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。

CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；微量移液器購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司；Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀購(gòu)自上海賽默飛世爾儀器有限公司；TGL-18R臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝科器研究所；Arktik多功能PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)和分組

將1 mg DON用無(wú)菌水配制成1 mg/mL DON基礎(chǔ)工作液，將其加入到DMEM高糖培養(yǎng)基中，配制DON質(zhì)量濃度分別為0、125、250、500、1 000 和2 000 ng/mL的工作液。于25 cm2正方細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)用DMEM高糖培養(yǎng)基(添加體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和適量抗生素)培養(yǎng)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，接種于6孔板內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)24 h，然后再用配制好的不同質(zhì)量濃度的DON處理細(xì)胞24 h后，收集處理后的細(xì)胞用于神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化及鈣穩(wěn)態(tài)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)的檢測(cè)

仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞染毒培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。之后向每個(gè)樣品中加入500 μL含0.1% Triton X-100的0.1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4)，在冰水浴中進(jìn)行超聲裂解。將細(xì)胞裂解液以l 000 r/min離心10 min，收取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中操作步驟進(jìn)行測(cè)定，用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm的吸光度(OD)值，利用測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、ACH、GABA、NE含量，脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)CAT、GSH-Px、SOD活性和T-AOC及NO、MDA含量。

1.4 鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞中Ca2+、CaM含量檢測(cè)

仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞染毒培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌并懸浮細(xì)胞，在冰水浴中進(jìn)行超聲裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液以3 000 r/min離心3 min，收取上清液，部分保存于-20 ℃冰箱，部分進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，之后按照Ca2+檢測(cè)試劑盒(甲基麝香草酚藍(lán)微板法)和豬CaM檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)說(shuō)明書(shū)中操作步驟進(jìn)行測(cè)定，用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm的OD值，計(jì)算細(xì)胞中Ca2+和CaM含量。

1.4.2 細(xì)胞中CaMmRNA表達(dá)量檢測(cè)

將接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度的DON染毒處理24 h后，吸棄培養(yǎng)板中的液體，向每孔中加入1 mL Trizol裂解液，用無(wú)RNase槍頭反復(fù)吹打，提取RNA；RNA使用StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix在42 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，85 ℃ 5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，獲得所需cDNA。

根據(jù)GenBank中發(fā)布的豬CaM(NM_001244209.1)和18S RNA(NR_046261.1)全基因序列，運(yùn)用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性上、下游引物，并利用GenBank BLAST進(jìn)行同源性檢索，之后由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。引物序列及參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 CaM目的基因和18S RNA內(nèi)參基因引物參數(shù)

參照StepOneTMReal-time PCR System和BIOMIGA SYBR qPCR Mix配制PCR反應(yīng)體系，然后按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。熔解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，每10 s以0.5 ℃的速度由55 ℃升溫至98 ℃。試驗(yàn)組的目的基因CaM和內(nèi)參基因18S RNA均在同一參數(shù)下進(jìn)行3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。以無(wú)DON處理的仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞為內(nèi)參(設(shè)定其表達(dá)水平為1)，采用2-△△CT法計(jì)算試驗(yàn)組仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞CaMmRNA相對(duì)表達(dá)量，其中△△Ct的計(jì)算公式為:

△△Ct=(Ct試驗(yàn)組CAM基因-Ct試驗(yàn)組18S RNA基因)-

(Ct對(duì)照組CAM基因-Ct對(duì)照組18S RNA基因)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。運(yùn)用GraphPad Prism 5.0數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行柱狀圖的繪制。

2 結(jié) 果

2.1 DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)的影響

不同濃度DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)的影響見(jiàn)表2。由表可知，隨DON濃度的增加，5-HT、DA、ACH、GABA含量均呈升高趨勢(shì)，而NE含量呈降低趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，當(dāng)DON濃度為1 000 ng/mL時(shí)，5-HT、DA、ACH含量顯著升高(P<0.05)，GABA含量極顯著升高(P<0.01)，而NE含量顯著降低(P<0.05)；當(dāng)DON濃度為2 000 ng/mL時(shí)，5-HT、DA、ACH含量極顯著升高(P<0.01)。

2.2 DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)的影響

不同濃度DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)的影響見(jiàn)表3。由表可知，隨DON濃度的增加，CAT、GSH-Px、SOD活性，T-AOC和NO含量呈降低趨勢(shì)，而MDA含量呈升高趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，當(dāng)DON濃度為250 ng/mL時(shí)，SOD活性和T-AOC極顯著降低(P<0.01)；當(dāng)DON濃度為1 000 ng/mL時(shí)，GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，NO含量極顯著降低(P<0.01)，而MDA含量極顯著升高(P<0.01)；當(dāng)DON濃度為2 000 ng/mL時(shí)，CAT活性顯著降低(P<0.05)，GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)。

2.3 DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中Ca2+和CaM含量的影響

不同濃度DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中Ca2+和CaM含量的影響見(jiàn)圖1。由圖可知，隨DON濃度的增加，Ca2+和CaM含量呈升高趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，當(dāng)DON濃度為125 ng/mL時(shí)，Ca2+含量有升高趨勢(shì)(P>0.05)，CaM含量極顯著升高(P<0.01)；當(dāng)DON濃度為250 ng/mL及以上時(shí)，Ca2+含量極顯著升高(P<0.01)。

表2 DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)的影響

同列數(shù)據(jù)無(wú)肩標(biāo)表示與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values with no superscripts mean no significant difference compared with control group (P>0.05), while with * mean significant difference compared with control group (P<0.05), and with ** mean significant difference compared with control group (P<0.01). The same as below.

表3 DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)的影響

2.4 DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中CaM mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

不同濃度DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中CaMmRNA相對(duì)表達(dá)量的影響見(jiàn)圖2。由圖可知，與對(duì)照組相比，當(dāng)DON濃度為125 ng/mL時(shí)，CaMmRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)；當(dāng)DON濃度為250 ng/mL及以上時(shí)，CaMmRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明DON濃度的增加會(huì)促進(jìn)細(xì)胞中CaMmRNA的表達(dá)。

3 討 論

DON是一種B型單端孢霉烯族類毒素，主要由鐮刀菌次生代謝產(chǎn)生，廣泛污染植物源性產(chǎn)物，如農(nóng)產(chǎn)品和飼料[11-12]。研究證明，DON對(duì)原核細(xì)胞和真核細(xì)胞都有顯著的毒性作用[13-14]。國(guó)內(nèi)外已有很多關(guān)于DON對(duì)動(dòng)物腦、胃腸道、生殖系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)的研究，而對(duì)豬神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的研究仍不深入，本試驗(yàn)選用仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞作為研究對(duì)象，來(lái)探討DON染毒后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化及鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)指標(biāo)的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，DON能夠通過(guò)血腦屏障到達(dá)腦部，通過(guò)刺激腦部不同區(qū)域?qū)е履X組織異常。較低慢性劑量DON會(huì)引起豬厭食，較高急性劑量DON會(huì)引起豬嘔吐[15]。DON能影響大腦神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，研究表明，位于腦和胃腸道中的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT可能參與調(diào)節(jié)DON誘導(dǎo)的某些效應(yīng)[16]。Swamy等[17-18]研究報(bào)道，DON會(huì)引起斷奶仔豬腦橋NE含量降低，下丘腦和腦橋5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)含量升高；腦部5-HT含量升高，與NE含量呈相反趨勢(shì)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同濃度DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞攻毒24 h后，細(xì)胞中5-HT、DA、ACH、GABA含量隨DON濃度的增加呈升高趨勢(shì)，而NE含量呈降低趨勢(shì)，這與以上報(bào)道相一致。

A：DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中Ca2+含量的影響；B：DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中CaM含量的影響。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

A: Effects of DON on the content of Ca2+in PHNCs; B: Effects of DON on the content of CaM in PHNCs. Data column with * mean significant difference compared with control group (P<0.05), and with ** mean significant difference compared with control group (P<0.01). The same as below.

圖1DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中Ca2+和CaM含量的影響

Fig.1 Effects of DON on the contents of Ca2+and CaM in PHNCs

圖2 DON對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中 CaM mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of DON on the relative expression level of CaM mRNA in PHNCs

抗氧化系統(tǒng)在動(dòng)物機(jī)體中占很重要的地位[19]。已有研究證明，對(duì)小鼠進(jìn)行DON攻毒，發(fā)現(xiàn)DON會(huì)降低小鼠腦抗氧化系統(tǒng)活性，并遭受氧化應(yīng)激[20]。Kanbur等[21]研究表明，聯(lián)合使用玉米赤霉烯酮(ZEA)和DON，可使小鼠產(chǎn)生自由基，并影響機(jī)體的抗氧化功能。Ren等[22]對(duì)小鼠進(jìn)行DON攻毒，發(fā)現(xiàn)攻毒組的腦組織MDA含量升高，腦組織SOD、GSH-Px活性降低，表明小鼠腦功能受DON的影響。耿芳芳等[23]對(duì)雛雞進(jìn)行DON攻毒，發(fā)現(xiàn)腦組織CAT、SOD、GSH-Px活性，T-AOC及NO含量顯著降低，而MDA含量顯著升高。本試驗(yàn)研究證明，DON暴露降低仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞CAT、GSH-Px、SOD活性，T-AOC和NO含量，升高M(jìn)DA含量，這與上述研究結(jié)果相符。

鈣穩(wěn)態(tài)是指機(jī)體正常代謝過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度與細(xì)胞外Ca2+濃度之間較恒定的梯度差，是維持細(xì)胞完整性和功能的主要因素[24]。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常增加的Ca2+作為第二信使，通過(guò)多途徑鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起涉及蛋白質(zhì)修飾的短時(shí)程反應(yīng)和改變基因表達(dá)的長(zhǎng)時(shí)程適應(yīng)性反應(yīng)[25]。胞質(zhì)內(nèi)Ca2+最主要的結(jié)合蛋白是CaM。Ca2+-CaM復(fù)合物可以調(diào)節(jié)鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶、蛋白磷酸酶、腺苷酸環(huán)化酶、一氧化氮合酶等酶的活性，進(jìn)而改變突觸蛋白的活性，或通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制激活相應(yīng)的基因表達(dá)，參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)反應(yīng)等病理過(guò)程[26-27]。任志華等[28]研究表明，DON暴露能夠增加雞脾臟淋巴細(xì)胞中Ca2+含量和CaMmRNA表達(dá)量，且均顯著或極顯著高于對(duì)照組，表明DON能引起雞淋巴細(xì)胞中鈣穩(wěn)態(tài)失衡，這與本試驗(yàn)結(jié)果是一致的，表明DON能夠刺激仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞，引起鈣穩(wěn)態(tài)失衡。

4 結(jié) 論

綜上所述，通過(guò)體外暴露試驗(yàn)表明，DON可促進(jìn)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、ACH和GABA的分泌，抑制NE的分泌；升高細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)MDA含量，降低CAT、GSH-Px、SOD活性，T-AOC和NO含量；同時(shí)增加神經(jīng)細(xì)胞中Ca2+和CaM含量以及CaMmRNA基因相對(duì)表達(dá)量，并呈劑量依賴關(guān)系。上述結(jié)果表明DON暴露可對(duì)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生一定的神經(jīng)毒性。