張小麗，涂許煌，謝國(guó)斌，蔣福全，張曉坤

(廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建廈門361102)

核受體(nuclear receptors)是廣泛分布在真核生物體內(nèi)的一大類蛋白轉(zhuǎn)錄因子超家族[1].根據(jù)其天然配體的不同，核受體主要分為三大類：類固醇激素受體、非類固醇激素受體和孤兒核受體[2].視黃醇X受體(RXR)是非類固醇激素受體家族的一員，屬于配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子.RXR在核受體中具有重要且獨(dú)特的作用，許多其他核受體通過(guò)與RXR形成二聚體來(lái)發(fā)揮生理功能[3].RXR在機(jī)體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)作用，與配體結(jié)合后被激活、識(shí)別并與DNA上特定的應(yīng)答元件結(jié)合，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝、免疫、細(xì)胞增殖、分化等多種生理病理學(xué)過(guò)程[4]；其表達(dá)、定位或功能異常均會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的人類疾病，如生殖系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等[5]，而RXR的小分子配體能夠通過(guò)調(diào)控其功能而治療疾病[6].因此，RXR是藥物開發(fā)的重要靶點(diǎn).

生物體內(nèi)細(xì)胞周期分為G0/G1、S、G2和M期，其調(diào)控是決定細(xì)胞命運(yùn)如增殖、生長(zhǎng)、分化等一系列生物學(xué)過(guò)程的基本機(jī)制.細(xì)胞周期受到許多監(jiān)管機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控，有多個(gè)基因和蛋白參與，形成復(fù)雜的正、負(fù)反饋調(diào)控的分子信號(hào)系統(tǒng)，周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)及其負(fù)調(diào)控因子在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7].腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞周期的異常調(diào)控有關(guān)[8].很多臨床常用的抗腫瘤藥物如氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、依托泊苷、長(zhǎng)春新堿等，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9].許多新型靶向抗腫瘤藥物也是作用于腫瘤細(xì)胞增殖周期，通過(guò)靶向細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[10-11].因此，細(xì)胞周期阻滯類化合物在抗腫瘤藥物開發(fā)中具有重要意義.

已有研究發(fā)現(xiàn)RXRα可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖[12].本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道了一種RXRα的小分子配體XS-23，該化合物可結(jié)合于RXRα表面的共調(diào)節(jié)因子結(jié)合位點(diǎn)(圖1)，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞中tRXRα(RXRα的N端截短片段)/PI3K/Akt 生存通路的激活，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[13].為進(jìn)一步開發(fā)XS-23，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)XS-23進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化，合成了一系列衍生物，初期檢測(cè)衍生物的生物活性時(shí)發(fā)現(xiàn)部分衍生物能夠明顯影響細(xì)胞周期，這可能是RXRα新的作用機(jī)制.本研究以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為模型，對(duì)XS-23部分衍生物(圖2)進(jìn)行細(xì)胞周期活性篩選，以期從中篩選出作用于細(xì)胞周期進(jìn)而誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的化合物.

圖2 XS-23衍生物的結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of XS-23 derivatives

圖1 XS-23與RXRα結(jié)合模式的分子對(duì)接Fig.1 Proposed binding mode of XS-23 with RXRα by molecular docking

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì)胞株

人宮頸癌HeLa細(xì)胞來(lái)源于ATCC(American Type Culture Collection).

1.1.2 藥品與試劑

供篩選的化合物(純度>98%)由廈門大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成提供；聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、細(xì)胞M期周期蛋白Cyclin B1(D5C10)、p21 WAF1/CIP1 (12D1)抗體購(gòu)自CST公司；β-actin抗體購(gòu)自Sigma公司；RXRα(D-20)抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗購(gòu)自Millipore公司；脂質(zhì)體2000購(gòu)自Thermo公司；MEM/EBSS培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；含100 U/mL鏈霉素和青霉素的雙抗母液購(gòu)自Hyclone公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)底物購(gòu)自APG Bio公司；BCA蛋白分析試劑盒購(gòu)自Pierce公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)購(gòu)自Roche公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD Biosciences公司.

1.1.3 儀器設(shè)備

3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；5424型低溫離心機(jī)、5424R型常溫離心機(jī)、A00-1-1102型流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman公司；MK2000-2型干式恒溫器購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司；PowerPac200電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司.

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清，含100 U/L鏈霉素和青霉素的MEM/EBSS培養(yǎng)基于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)滿盤的70%左右時(shí)，轉(zhuǎn)染前用不含血清、不含雙抗的新鮮MEM/EBSS培養(yǎng)基為細(xì)胞換液，在2 mL離心管中分別用適量的培養(yǎng)基稀釋雙鏈siRNA、siControl(20 μmol/L)和脂質(zhì)體2000，5 min后混合siRNA和脂質(zhì)體溶液(siRNA和脂質(zhì)體2000的體積比為2∶1)，室溫放置20 min，使siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成，混勻后逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)液，4 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，干擾48～72 h后收集樣品.

1.2.3 蛋白免疫印跡(Western blotting，WB)分析

化合物處理后收集的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，加蛋白裂解液(50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸、1%(體積分?jǐn)?shù))NP-40、0.005 g/mL脫氧膽酸鈉、0.001 g/mL十二烷基磺酸鈉(SDS)，含蛋白酶抑制劑混合物和磷酸化酶抑制劑)，收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，冰上裂解30 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清；用酶標(biāo)儀于560 nm下測(cè)定蛋白濃度后，吸取上清加入5×SDS loading buffer，之后置于干式恒溫器中，100 ℃沸水浴5 min，常溫10 000 r/min離心30 s后上樣，或置于-20 ℃凍存?zhèn)溆?用12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的SDS變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白(分離PARP及其切割蛋白用8%)，90 V轉(zhuǎn)膜1.5 h；用TBST(10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，0.05%(體積 分?jǐn)?shù))Tween 20)配制5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶，封閉1 h；一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜(大于8 h)，用TBST洗3次，每次10 min；二抗室溫孵育1 h，用TBST洗3次，每次10 min；加ECL底物，暗室中膠片曝光、顯色.

1.2.4 細(xì)胞周期分析

胰酶消化后收集細(xì)胞，2 000 r/min離心3 min，棄去培養(yǎng)液；PBS洗2次，2 000 r/min離心3 min，棄去PBS，加入70%(體積分?jǐn)?shù))冷乙醇4 ℃固定過(guò)夜；2 000 r/min 離心5 min，棄去固定液，用PBS洗1次，2 000 r/min 離心5 min，棄去PBS，加入400～500 μL DAPI染色液(1 μg/mL)，常溫染色10 min；200目以上的篩網(wǎng)過(guò)濾，轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管，用流式細(xì)胞儀PB450通道收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞周期.

1.2.5 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

胰酶消化后收集細(xì)胞，4 ℃、2 000 r/min離心3 min，棄去培養(yǎng)液；用預(yù)冷的PBS洗2次，2 000 r/min離心3 min，棄去PBS；用1×binding buffer 500 μL重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻，室溫(25 ℃)下避光孵育10 min；再加5 μL PI，混勻，室溫下避光孵育5 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)，1 h內(nèi)完成.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用t-檢驗(yàn)，p<0.05為差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物活性篩選

對(duì)XS-23衍生物(01～08)的活性進(jìn)行初步篩選.用10 μmol/L化合物分別處理細(xì)胞6 h，通過(guò)WB檢測(cè)HeLa細(xì)胞中p21 WAF1/CIP1(細(xì)胞周期G1期檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白/CDK抑制蛋白，下文簡(jiǎn)稱p21)和Cyclin B1的表達(dá)水平，分析化合物對(duì)細(xì)胞周期的影響.結(jié)果顯示，與對(duì)照二甲基亞砜(DMSO)相比，化合物05和06可以引起p21表達(dá)上調(diào)和Cyclin B1表達(dá)下調(diào)，而其余化合物無(wú)明顯影響(圖3)，說(shuō)明化合物05和06可能具有阻滯腫瘤細(xì)胞周期的活性.

圖3 XS -23衍生物的初步篩選Fig.3 Preliminary screening of XS -23 derivatives

2.2 化合物05和06導(dǎo)致人宮頸癌HeLa細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期

為了進(jìn)一步檢測(cè)化合物05和06對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化.結(jié)果顯示：與DMSO相比，用化合物05和06(10 μmol/L，6 h)處理后G0/G1期細(xì)胞比例顯著上升(p<0.05)，同時(shí)G2/M期細(xì)胞比例顯著下降(p<0.05)(表1，圖4)，說(shuō)明化合物05和06可以造成HeLa細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，且效果明顯.

圖4 化合物05和06對(duì)HeLa細(xì)胞周期的阻滯作用Fig.4 Cell cycle arresting effect on HeLa cells by compounds 05 and 06

處理G0/G1SG2/MDMSO69.37±0.458.33±0.1422.04±0.460582.69±0.32*7.89±0.499.30±0.46*0681.02±0.80*8.19±0.4810.38±0.32*

注：*與對(duì)照(DMSO)比較，p<0.05，下同.

2.3 化合物05和06對(duì)細(xì)胞周期阻滯作用的RXRα依賴性

如圖5所示：化合物05和06作用于HeLa細(xì)胞后，WB檢測(cè)結(jié)果顯示p21表達(dá)水平顯著上調(diào)(p<0.05)；而用siRNA瞬時(shí)干擾RXRα的表達(dá)后，化合物05和06引起p21表達(dá)水平上調(diào)的作用減弱，與DMSO相比無(wú)顯著差異(p>0.05)，說(shuō)明化合物05和06對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用在一定程度上依賴于RXRα.

2.4 化合物05和06誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步探討化合物05和06是否具有誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI檢測(cè)凋亡細(xì)胞，并應(yīng)用WB檢測(cè)PARP蛋白切割情況(PARP切割蛋白出現(xiàn)則表示細(xì)胞開始凋亡).不同濃度(10和20 μmol/L)的化合物作用于HeLa細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：化合物05和06均可導(dǎo)致HeLa細(xì)胞凋亡，且隨化合物濃度增加，凋亡細(xì)胞數(shù)目逐漸升高(圖6)；10 μmol/L化合物05、20 μmol/L化合物05、10 μmol/L化合物06和20 μmol/L化合物06處理下，細(xì)胞凋亡率依次為(16.59±1.84)%，(21.20±2.06)%，(13.31±0.89)%和(16.73±0.69)%，與DMSO組(3.15±0.31)%相比均有顯著性差異(p<0.05).WB檢測(cè)結(jié)果顯示，化合物05和06均可造成HeLa細(xì)胞中PARP蛋白切割，且切割效率存在濃度依賴性(圖7).上述結(jié)果說(shuō)明化合物05和06具有誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用.

2.5 化合物05和06誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡作用的RXRα依賴性

siRNA瞬時(shí)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照(DMSO)相比，干擾RXRα表達(dá)后，化合物05和06引起的PARP切割蛋白水平均有所下降(圖8)，說(shuō)明化合物05和06誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的作用在一定程度上依賴于RXRα.

2.6 計(jì)算機(jī)模擬化合物05和06與RXRα的可能結(jié)合位點(diǎn)

圖5 化合物05和06的細(xì)胞周期阻滯作用對(duì)RXRα的依賴性Fig.5 RXRα-dependent cell cycle arresting effect of compounds 05 and 06

圖6 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)凋亡細(xì)胞Fig.6 The detection of apoptosis by Annexin V-FITC/PI

圖7 WB檢測(cè)PARP切割蛋白Fig.7 Detection of cleaved-PARP by WB

圖8 化合物05和06誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡作用對(duì)RXRα的依賴性Fig.8 RXRα-dependent apoptosis effect of compounds 05 and 06

XS-23結(jié)合于RXRα表面的共調(diào)節(jié)因子結(jié)合位點(diǎn)，而非傳統(tǒng)配體所結(jié)合的配體結(jié)合口袋(ligand binding pocket， LBP)，其中位于RXRα配體結(jié)合區(qū)域表面的V298位點(diǎn)對(duì)XS-23的結(jié)合至關(guān)重要[13].為驗(yàn)證化合物05和06是否具有與XS-23相似的RXRα結(jié)合模式，使用計(jì)算機(jī)模擬對(duì)化合物05和06與RXRα結(jié)構(gòu)(PDB：3FUG)進(jìn)行分子對(duì)接.結(jié)果顯示：化合物05和06均可能與RXRα蛋白的helix12、helix3、helix4形成的表面區(qū)域結(jié)合；其中，位點(diǎn)E453和V298對(duì)2個(gè)化合物與RXRα的結(jié)合均至關(guān)重要；此外，L301對(duì)化合物05與RXRα的結(jié)合也很重要(圖9).計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果說(shuō)明，化合物05和06可能具有與XS-23相似的RXRα結(jié)合模式，但具體的結(jié)合位點(diǎn)可能存在差異.

3 討 論

圖9 計(jì)算機(jī)模擬化合物05 (a)和06 (b)與RXRα表面的結(jié)合位點(diǎn)Fig.9 Compounds 05 (a) and 06 (b) binding sites to RXRα surface by computer modeling

宮頸癌是威脅女性健康最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一.在我國(guó)，宮頸癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第二位，是15～44歲女性中第三大高發(fā)癌癥[14].宮頸癌也是世界范圍內(nèi)的女性高發(fā)惡性腫瘤，死亡率在所有癌癥中居第四位[15].目前，治療宮頸癌的主要手段是手術(shù)和放療.化學(xué)藥物主要使用順鉑，聯(lián)合放療用于晚期宮頸癌的治療，但多伴有較大的毒副作用，臨床上尚缺乏其他安全有效的治療宮頸癌的化學(xué)藥物[16].因此，研發(fā)治療宮頸癌的安全有效的新型藥物是近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外科研機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域之一.

抗腫瘤藥物開發(fā)的指導(dǎo)思想之一是直接殺傷癌細(xì)胞或是抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而細(xì)胞增殖周期與細(xì)胞的生長(zhǎng)直接相關(guān).p21是CIP家族的一員，屬于抑癌因子p53的下游CDK的負(fù)調(diào)節(jié)因子，與CDK復(fù)合物結(jié)合并抑制CDK復(fù)合物的功能，阻滯細(xì)胞周期，是細(xì)胞G0/G1期檢驗(yàn)點(diǎn)的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子[17].有研究顯示p21可通過(guò)p53非依賴途徑發(fā)揮作用，而RXRα參與調(diào)控p21的表達(dá)[18].在本研究對(duì)RXRα的小分子配體XS-23衍生物的篩選中發(fā)現(xiàn)，化合物05和06能夠上調(diào)HeLa細(xì)胞中p21的表達(dá)水平，阻滯HeLa細(xì)胞周期于G0/G1期，最終誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，且具有一定的RXRα依賴性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物05和06可能通過(guò)靶向RXRα調(diào)控 p21 的功能進(jìn)而影響細(xì)胞周期.此外，分子對(duì)接模擬化合物05和06與RXRα的結(jié)合可看出化合物05和06可能具有與XS-23相似的RXRα結(jié)合模式，即與RXRα表面結(jié)合，但具體的結(jié)合位點(diǎn)可能不同，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

近年來(lái)，靶點(diǎn)藥物開發(fā)成為各國(guó)藥企開發(fā)創(chuàng)新藥物的重點(diǎn).靶向細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白以及選擇性地阻斷腫瘤細(xì)胞增殖周期是近年來(lái)靶向抗腫瘤藥開發(fā)的熱點(diǎn)之一[19].在精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，腫瘤的新藥研發(fā)也取得了重大進(jìn)展與突破，由傳統(tǒng)的大量化合物的盲目篩選轉(zhuǎn)為基于潛在有效成分或化學(xué)基團(tuán)的細(xì)胞分子篩選：首先篩選找到有活性的化合物，再有針對(duì)性地進(jìn)行優(yōu)化，縮短了篩選周期.本研究在前期已發(fā)現(xiàn)的能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的RXRα小分子配體XS-23基礎(chǔ)上，基于結(jié)構(gòu)多樣性對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)能夠阻滯細(xì)胞周期誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的XS-23衍生物，為該類周期阻滯類化合物的進(jìn)一步優(yōu)化提供了參考依據(jù)，也為進(jìn)一步研究RXRα在細(xì)胞周期中的功能以及開發(fā)新型靶點(diǎn)抗腫瘤藥物提供了方向和思路.