賀王偉，張銀芬，朱麗媛，黃 宇，謝 強(qiáng)

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建 廈門 361003)

目前急性心肌梗死(AMI)是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致心源性死亡的主要原因[1]，而AMI后心室重構(gòu)是導(dǎo)致心衰的主要致病因素，對AMI后心室重構(gòu)的預(yù)防及治療是當(dāng)今心血管病學(xué)研究面臨的主要挑戰(zhàn)[2]．神經(jīng)體液因素一直被認(rèn)為是AMI后導(dǎo)致心室重構(gòu)的重要機(jī)制，但是臨床上即便廣泛使用了“金標(biāo)準(zhǔn)”的拮抗神經(jīng)體液因子的藥物，如β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ACEI/ARB)以及醛固酮受體拮抗劑，心室重構(gòu)仍然有很高的發(fā)生率，并不能完全阻止心室重構(gòu)的進(jìn)程[3]．也有學(xué)者提出炎癥因子可能參與了AMI后心室重構(gòu)的過程，尤其是M1與M2型巨噬細(xì)胞之間的平衡影響著心室重構(gòu)的進(jìn)程，決定著AMI的預(yù)后[4]．

最近有研究報道許多miRNAs也參與到AMI后心室重構(gòu)的這一過程中[5]．研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155(miR-155)通過靶向調(diào)控白介素13受體α1(IL13Rα1)，阻滯M1型巨噬細(xì)胞向M2型分化，在M1和M2型的平衡維持中發(fā)揮著舉足輕重的作用，而過表達(dá)miR-155基因可以促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞的大量生成，從而極大地加劇炎癥反應(yīng)[6]．在這些炎癥因子中最具代表性的為促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和抗炎因子IL-10，TNF-α/IL-10比值變化對AMI后心室重構(gòu)的影響具有重要意義[7]，但是兩者的表達(dá)是否受miR-155調(diào)控目前還未見報道．目前關(guān)于miR-155的研究主要集中在免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病及腫瘤等方面，越來越多的證據(jù)表明miR-155在炎癥與自身免疫紊亂、腫瘤等疾病中起著非常重要的橋梁作用[8-9]．已有研究證實miR-155可以直接靶向調(diào)控細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)、含肌醇磷酸激酶1的原癌基因蛋白-c(Src)同源體2(Src homology 2-containing inositol phosphatase-1，SHIP-1)等的編碼基因，并促進(jìn)炎癥因子如IL-1β、干擾素-γ(IFN-γ)等的釋放[10]．

本研究通過體內(nèi)實驗研究miR-155對AMI時心臟功能及組織形態(tài)的影響，進(jìn)而通過體外實驗探討miR-155的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制．

1 材料和方法

1.1 動物實驗

1.1.1 小鼠來源及骨髓移植

所有的小鼠實驗均遵守相關(guān)的操作指南[11].從武漢大學(xué)模式動物中心購買8～10周齡，體質(zhì)量20～22 g，雄性，miR-155基因過表達(dá)(miR-155+/+)、miR-155基因敲除(miR-155-/-)及野生型(WT)C57BL/6小鼠．小鼠骨髓移植：每天給予6 J/kg吸收劑量的射線連續(xù)2 d照射WT小鼠，然后從WT、miR-155+/+、miR-155-/-的小鼠股骨和脛骨中分別獲得約2×107個髓細(xì)胞，經(jīng)靜脈注入射線照射后的WT小鼠重建造血系統(tǒng)，繼續(xù)飼養(yǎng)8周后分組建模．

1.1.2 分組及AMI模型建立

共分為6組，分別為WT組、miR-155+/+組、miR-155-/-組、WT AMI組、miR-155+/+ AMI組和miR-155-/- AMI組，每組各8只．經(jīng)腹腔注射60 μg/g戊巴比妥鈉麻醉后，將小鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，進(jìn)行氣管插管，并給予小動物呼吸機(jī)支持，結(jié)扎冠狀動脈左前降支后關(guān)胸，假手術(shù)組(WT組、miR-155+/+組和miR-155-/-組)僅開胸掛線不結(jié)扎[12]．于1,7 和14 d后分別進(jìn)行心臟彩超檢查，抽血進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢查后予以安樂死，迅速開胸取出心臟，鋅-甲醛溶液固定，石蠟包埋后進(jìn)行組織學(xué)檢查，或者迅速冰凍后儲藏在-80 ℃液氮中用于RNA抽提．

1.1.3 組織學(xué)分析及免疫組化檢查

小鼠心臟用鋅-甲醛溶液固定后進(jìn)行石蠟包埋，并將其橫切成3 μm厚度，分別用抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體、大鼠抗小鼠巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記CD68抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、蘇木精伊紅(HE)染色及Masson染色檢查[13]．

1.1.4 心臟彩超檢測心功能

在實驗前及AMI后1,7和14 d分別進(jìn)行心臟彩超檢查．采用8 MHz探頭，短軸M型超聲檢查心室收縮及舒張功能，分別檢測左室舒張末期容積、左室收縮末期容積．射血分?jǐn)?shù)(LVEF)= (左室舒張末期容積-左室收縮末期容積) /左室舒張末期容積×100%．

1.1.5 炎癥因子檢測

TNF-α和IL-10在血清及心肌組織中的表達(dá)采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELSIA)檢測．在不同時間節(jié)點采血后取血清樣品進(jìn)行檢測；取各組-80 ℃凍存心肌梗死周圍組織，每份約100 mg，剪碎，加入2 mL生理鹽水于玻璃勻漿器制備組織勻漿，加0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)至5 mL，高速低溫(12 000 r/min，3 ℃)離心10 min后取上清液檢測．具體實驗步驟參照R&D Systems試劑盒說明書操作．

1.2 體外實驗

1.2.1 分離培養(yǎng)巨噬細(xì)胞

分別從WT、miR-155+/+、miR-155-/-小鼠股骨及脛骨分離骨髓細(xì)胞．用含10%(體積分?jǐn)?shù))，熱滅活胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)及L-谷氨酰胺(2 mmol/L)的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并補(bǔ)充15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))L929處理介質(zhì)(LCM)培養(yǎng)8～9 d以產(chǎn)生骨髓來源的巨噬細(xì)胞．WT巨噬細(xì)胞、miR-155+/+巨噬細(xì)胞和miR-155-/-巨噬細(xì)胞分別給予1 μg/mL脂多糖(LPS)刺激6, 12, 24 h．

1.2.2 炎癥因子及蛋白質(zhì)檢測

通過ELISA檢測各組巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-10水平；采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法分別檢測SOCS1的mRNA及蛋白水平．

1.2.3 靶基因驗證

按1.2.1小節(jié)方法將分離培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分為WT巨噬細(xì)胞和miR-155-/-巨噬細(xì)胞兩組，然后每組分別用腺病毒包裝si-SOCS1轉(zhuǎn)染以沉默SOCS1基因，采用空病毒組作為組內(nèi)對照．給予1 μg/mL LPS刺激6, 12, 24 h，分別用1.2.2方法檢測TNF-α和IL-10表達(dá)水平及SOCS1的mRNA和蛋白質(zhì)水平．

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22軟件行統(tǒng)計學(xué)分析．?dāng)?shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t-檢驗，p<0.05表示有顯著性差異．

2 結(jié)果與分析

2.1 AMI后miR-155的表達(dá)變化及其對炎癥因子釋放的影響

通過qRT-PCR分別檢測小鼠AMI后1, 7 和14 d體外分離的心肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示：在心肌細(xì)胞中miR-155的表達(dá)未見明顯變化(圖1(a))，而巨噬細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平卻在AMI后1 d內(nèi)顯著升高，之后維持在一定的水平(圖1(b))．這說明心肌缺血是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平升高的因素之一，這與心肌肥厚重構(gòu)過程中巨噬細(xì)胞的反應(yīng)相似[14]．同時，通過ELISA方法在3個時間節(jié)點上分別檢測血漿和心肌組織中TNF-α和IL-10的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：miR-155+/+組相對于WT組和miR-155-/-組的TNF-α表達(dá)水平顯著升高，在AMI后1 d達(dá)到高峰且維持時間超過7 d，在14 d時略有下降；而miR-155-/-組的TNF-α始終維持在較低的表達(dá)水平，相對于同一時期的WT組均顯著下降(圖1(c))．IL-10的表達(dá)則相反，miR-155+/+組一直維持在較低水平，在不同時期均顯著低于WT組；而在miR-155-/-組中IL-10始終維持在較高表達(dá)水平，在不同時期均顯著高于WT組(圖1(d))．在AMI模型的心肌組織中得到了類似的結(jié)果：miR-155+/+組心肌組織中3個時間節(jié)點的TNF-α表達(dá)水平均較同一時期的WT組顯著升高，在1 d時即達(dá)到高峰，后維持在較高的水平；miR-155-/-組心肌組織中1 d時TNF-α表達(dá)水平均較同一時期的WT組顯著降低，之后維持在較低水平，波動不明顯(圖1(e))．IL-10在心肌組織中的表達(dá)水平與在血漿中的相似，miR-155+/+組均顯著低于同一時期的WT組，并隨時間呈逐漸降低的趨勢；miR-155-/-組IL-10表達(dá)水平則呈逐漸升高的趨勢，均顯著高于同一時期的WT組(圖1(f))．

(a)qRT-PCR檢測AMI模型心肌細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平；(b)qRT-PCR檢測AMI模型巨噬細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平；(c)和(d)ELISA檢測AMI模型血漿中TNF-α和IL-10的表達(dá)水平；(e)和(f)ELISA檢測AMI模型心肌組織中TNF-α和IL-10的表達(dá)水平．與WT組相比，**p<0.01, *p<0.05(下同)．圖1 AMI時miR-155表達(dá)水平變化及其對炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig.1 The change of miR-155 expression level and its effect on the expression of inflammatory cytokines in AMI

這些結(jié)果表明，心肌缺血可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中miR-155 表達(dá)水平的升高，并影響血漿中炎癥因子TNF-α和IL-10的釋放．

2.2 miR-155對AMI后心室重構(gòu)的影響

為了分析miR-155對AMI后心室重構(gòu)的影響，對心肌梗死周圍組織分別進(jìn)行了HE染色、免疫組織化學(xué)染色及Masson染色．在AMI后14 d時，心肌細(xì)胞的HE染色結(jié)果顯示miR-155+/+組心肌細(xì)胞最大，WT組居中，miR-155-/-組最小(圖2(a))；用Image J軟件對心肌細(xì)胞大小進(jìn)行定量分析，miR-155+/+組心肌細(xì)胞較WT組顯著增大，miR-155-/-組則較WT組顯著減小(圖2(d))．應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的CD68分子，觀察各組巨噬細(xì)胞浸潤情況，結(jié)果如圖2(b)所示，在AMI后14 d，miR-155 +/+組巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量顯著高于WT組；集成光學(xué)密度(IOD)定量分析也表明，miR-155+/+組巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量較WT組顯著增多，miR-155-/-組則較WT組顯著減少(圖2(e))．此外，通過Masson染色觀察比較心肌纖維化程度，結(jié)果顯示miR-155+/+組心肌纖維化程度最強(qiáng)，而miR-155-/-組心肌纖維化程度最輕(圖2(c))，通過Image J軟件定量分析膠原蛋白表達(dá)水平，結(jié)果也顯示miR-155+/+組心肌纖維化程度較WT組顯著增強(qiáng)，miR-155-/-組則較WT組顯著減弱(圖2(f))．這些結(jié)果表明miR-155可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向心肌細(xì)胞浸潤，增強(qiáng)心肌細(xì)胞的纖維化和梗死程度，促進(jìn)心室負(fù)性重構(gòu)的發(fā)生．

(a)HE染色檢測心肌細(xì)胞大?。?b)免疫組織化學(xué)染色檢測心肌AMI模型中巨噬細(xì)胞表面CD68分子的表達(dá)；(c)Masson染色檢測AMI模型心肌纖維化程度；(d)Image J軟件分析心肌細(xì)胞大小(以心肌細(xì)胞周長表示)；(e)CD68分子表達(dá)IOD值；(f)Image J軟件定量分析膠原蛋白表達(dá)水平．標(biāo)尺為100 μm.圖2 miR-155對AMI后心室重構(gòu)的影響Fig.2 Effects of miR-155 on the ventricular remodeling after AMI

2.3 miR-155對心臟功能的影響

通過心臟彩超檢測miR-155對心臟功能的影響，分別在miR-155+/+組、miR-155-/-組和WT組小鼠AMI后1, 7和14 d觀察其心臟功能的改變．結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMI后1 d時，3組小鼠心臟收縮功能未見明顯差異，7 d時miR-155+/+組的小鼠心臟收縮功能顯著下降，到14 d時更明顯(圖3)．

2.4 體外細(xì)胞學(xué)實驗驗證

分別分離miR-155+/+、miR-155-/-及WT巨噬細(xì)胞進(jìn)行鑒定，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞表面CD68分子的表達(dá)，結(jié)果顯示3組分離培養(yǎng)獲得的巨噬細(xì)胞質(zhì)量及數(shù)量上無明顯差異(圖4(a))．然后進(jìn)行培養(yǎng)并給予LPS刺激，利用Western blot方法檢測間皮標(biāo)志物vimentin的表達(dá)變化，同時利用免疫組織化學(xué)染色方法觀察α-SMA的染色情況，再分不同時間節(jié)點用ELISA方法檢測TNF-α和IL-10的表達(dá)水平．結(jié)果顯示：miR-155+/+組vimentin表達(dá)水平較WT組顯著升高，miR-155-/-組較WT組顯著降低(圖4(b)和(d))，α-SMA表現(xiàn)出相同的變化趨勢(圖4(c)和(e))；同時，miR-155+/+巨噬細(xì)胞中TNF-α表達(dá)水平較WT組顯著升高，IL-10表達(dá)水平較WT組顯著降低，miR-155-/-組則剛好相反(圖4(f)和(g))．IL-10與TNF-α是作用相互拮抗的一對炎癥因子，TNF-α/IL-10的比值代表了機(jī)體內(nèi)的促炎與抗炎因子之間的平衡，可見miR-155在控制AMI后炎癥反應(yīng)程度方面具有重要作用．

2.5 靶基因SOCS1的驗證

在WT巨噬細(xì)胞中分別過表達(dá)和敲降miR-155基因后檢測SOCS1的mRNA和蛋白表達(dá)水平．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是mRNA還是蛋白水平上，miR-155均能負(fù)向調(diào)控SOCS1的表達(dá)(圖5(a)～(c))，這與已有研究結(jié)果[10]是一致的．進(jìn)而在WT巨噬細(xì)胞中利用病毒包裝技術(shù)敲降SOCS1基因(si-SOCS1)，結(jié)果顯示，空病毒(control)組和si-SOCS1組相比，si-SOCS1組TNF-α表達(dá)水平略有增加，而IL-10表達(dá)水平顯著下降(圖5(d)和(e))，從而從分子生物學(xué)功能上證明了SOCS1是miR-155的靶基因．

3 討 論

AMI后，心肌組織釋放大量的熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)、高遷移率族蛋白B1(high mo-bility group protein B1，HMGB1)、活性氧等內(nèi)源性因子，能夠趨化、募集、激活單核巨噬細(xì)胞．在AMI早期主要以M1型巨噬細(xì)胞為主，引起瀑布級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致早期心肌細(xì)胞及間質(zhì)的損傷[15]．在AMI后期主要以M2型巨噬細(xì)胞為主，終止炎癥反應(yīng)并修復(fù)心肌組織，在晚期心室重構(gòu)過程中發(fā)揮著促進(jìn)血管新生及纖維增生等作用．M1和M2型巨噬細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的作用下維持著一種微妙的平衡，而IL-13在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[16]．miR-155能夠靶向調(diào)控人類巨噬細(xì)胞上的IL13Rα1而阻止M1型巨噬細(xì)胞向M2型分化[6]．

本研究發(fā)現(xiàn)骨髓移植了過表達(dá)miR-155基因的單核細(xì)胞的小鼠，在發(fā)生AMI后1, 7和14 d時各組心肌組織中的巨噬細(xì)胞浸潤均明顯增加，這可能與miR-155調(diào)控炎癥趨化因子MCP-1的表達(dá)有關(guān)．然而，miR-155+/+組的炎癥因子表達(dá)與其他2組存在差別，尤其是TNF-α，在AMI后1 d達(dá)到頂峰，且顯著高于WT組和miR-155-/-組；而IL-10在miR-155+/+組中一直維持在較低水平，miR-155-/-組中卻維持在較高水平，與TNF-α的變化趨勢剛好相反，充分表明miR-155在平衡促炎因子與抗炎因子中具有非常突出的作用．體內(nèi)實驗也證實miR-155+/+組AMI后14 d時心肌梗死組織面積最大，心肌細(xì)胞增大最明顯，心肌纖維化程度明顯加劇，并且心臟收縮功能明顯受抑制，LVEF值顯著減?。?/p>

(a)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定巨噬細(xì)胞；(b)Western blot檢測巨噬細(xì)胞間皮標(biāo)志物vimentin的表達(dá)；(c)免疫組織化學(xué)法檢測α-SMA的表達(dá)；(d)和(e)vimentin和α-SMA表達(dá)水平的定量分析；(f)和(g)ELISA檢測TNF-α和IL-10在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平．圖4 miR-155對體外巨噬細(xì)胞的作用及對炎癥因子表達(dá)的影響Fig.4 Effects of miR-155 on macrophages in vitro and the expression of inflammatory cytokines

SOCS又被稱為細(xì)胞因子信號抑制物[17]，能夠通過多種負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制抑制細(xì)胞因子的過度活化，其家族含有8個成員．其中SOCS1在炎癥因子的調(diào)控中具有重要的作用，尤其能夠避免促炎因子的過度活化[18]．SOCS1的表達(dá)水平?jīng)Q定了炎癥反應(yīng)的程度，其表達(dá)水平越低，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重．本研究采用反義寡核苷酸方法特異性阻斷miR-155分子，使之在巨噬細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，在LPS刺激后通過qRT-PCR方法檢測SOCS1的mRNA表達(dá)水平，并且通過Western blot方法檢測SOCS1的蛋白表達(dá)水平，均發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)水平與SOCS1表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)．另外，在WT巨噬細(xì)胞中利用病毒包裝技術(shù)敲降SOCS1基因后，通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)敲降SOCS1基因后TNF-α的表達(dá)水平較對照組顯著升高，而IL-10卻顯著降低．這些結(jié)果表明miR-155可能通過作用于SOCS1基因而扮演著“分子開關(guān)”的作用，最終影響了促炎因子與抗炎因子之間的平衡，調(diào)控AMI后心室重構(gòu)的進(jìn)程．

(a)qRT-PCR檢測過表達(dá)或敲降miR-155基因后SOCS1的mRNA表達(dá)水平；(b)Western blot檢測過表達(dá)或敲降miR-155基因后SOCS1的蛋白表達(dá)水平；(c)SOCS1蛋白表達(dá)水平的定量分析；(d)和(e)ELISA檢測病毒包裝技術(shù)敲降SOCS1基因后炎癥因子TNF-α和IL-10的表達(dá)水平．ASO.反義核酸；ASO-NC.反義核酸空白對照．圖5 靶基因SOCS1驗證及其對炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig.5 Verification of the target gene SOCS1 and its effect on the expression of inflammatory factors

綜上，本研究證明了巨噬細(xì)胞中的miR-155通過作用于靶基因SOCS1促進(jìn)TNF-α表達(dá)而抑制IL-10 表達(dá)，在調(diào)控TNF-α/IL-10的比值方面具有重要意義．miR-155促進(jìn)心室不良重構(gòu)主要是通過介導(dǎo)促炎與抗炎介質(zhì)的不平衡而引起的，而抑制巨噬細(xì)胞中miR-155的表達(dá)上調(diào)能夠改善心室重構(gòu)，提高心臟功能，為干預(yù)AMI后心室重構(gòu)提供了有效的靶點．因此，通過干預(yù)AMI后炎癥細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平使炎癥反應(yīng)維持在適當(dāng)程度，將有望成為一種全新的治療心室重構(gòu)的手段．