呂波，朱新鋒，蔡常春，鄭小林

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 武漢 430014）

胰腺癌是起源于胰腺導管上皮的腫瘤，惡性程度較高，5年生存率不到8%[1]。內質網(wǎng)氧化還原蛋白（endoplasmic reticulum oxidoreductin-1-like protein，ERO1L）是一種內質網(wǎng)腔內的糖蛋白，具有氧化酶活性[2-3]。在低氧條件下可誘導其表達[4]。研究[4]顯示，ERO1L可調控低氧誘導的氧化蛋白的折疊。ERO1L參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-7]。ERO1L能促進乳腺癌的生長，加速乳腺癌肺轉移，高表達ERO1L的乳腺癌患者預后極差[5]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，ERO1L在胃癌組織中高表達，與胃癌患者預后差相關。這些研究結果提示，ERO1L作為一個癌基因可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要功能，然而ERO1L在胰腺癌中的表達情況及與臨床病理因素間的關系尚不清楚。本研究通過檢測ERO1L基因在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達，分析ERO1L基因表達與胰腺癌患者臨床病理因素和預后的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集2013年1月—2015年12月在我院行胰腺癌切除手術的患者標本85例，其中行55例行胰十二指腸切除術、30例行胰體尾切除術；68例病理類型為胰腺導管腺癌，14例為黏液癌，2例為腺鱗癌，1例為小細胞癌。另收集12例癌旁組織作為對照。所有病例標本均保存于-80 ℃冰箱。納入標準：⑴ 術前未經過放化療治療，所有標本均具有完整臨床和隨訪資料；⑵ 所有病理樣本均由病理確診，診斷為胰腺癌；⑶ 均行手術治療。剔除標準：⑴ 隨訪資料或臨床資料不全者；⑵ 術前已行放化療者；⑶ 伴隨其他腫瘤者。剔除3例失訪病例，共94例（腫瘤82例，正常組織12例）樣本采用液氮研磨法提取中RNA，經實時熒光定量定量RCR（qRT-PCR）法分別檢測胰腺癌組織與癌旁組織中ERO1L mRNA表達量。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑TRIzol Universal購自天根生化科技（北京）有限公司。反轉錄試劑盒PrimeScript? RT Master Mix、熒光定量檢測試劑盒TB Green? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus),Bulk均購自Takara公司；ERO1L和GAPDH基因引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 ERO1L mRNA檢測及分組

采用q R T-P C R法。采用液氮研磨提取總RNA，將組織重液氮去除后迅速于預冷研缽研碎，加入1 mL TRIzol Universal提取試劑。取1 μg總mRNA反轉成cDNA。ERO1L上游引物：5'-CCA TTA GTG CTG CCA ACC AGT A-3'，下游引物：5'-ATC TGC ATC AGC ATC ACG GTC-3'；GAPDH上游引物：5'-GGT GTG GCA TCA GGA TTC AAG-3'，下游引物5'-TTT CAT ACC GAT TGC TGT TGG A-3'，按說明書進行qRT-PCR擴增反應。以GAPDH基因為內參，歸一化計算ERO1L mRNA在組織中的相對表達量。將所有胰腺癌組織中的ERO1L表達量取平均值，小于均值定義為ERO1L低表達組，共35例；大于平均值定義為ERO1L高表達組，共47例。統(tǒng)計分析ERO1L表達水平與胰腺癌患者臨床病理因素及預后間的關系。

1.4 隨訪

所有患者經門診或電話隨訪，每半年隨訪1次，隨訪內容包括患者的一般情況、復發(fā)、轉移及死亡情況。共隨訪85例患者，其中3例失訪，失訪率3.52%，共計82例入組研究。隨訪截止時間為2018年5月，平均隨訪時間（60.4±8.2）個月。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，統(tǒng)計處理采用獨立t檢驗對組間進行比較；計數(shù)資料采用χ2檢驗?；颊呱嫫诤蜔o瘤生存期采用Kaplan-Meier分析，單因素和多因素分析采用Cox回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ERO1L mRNA在胰腺癌組織中的表達

qRT-PCR檢測82例胰腺癌組織及12例癌旁組織中ERO1L mRNA的表達結果顯示，ERO1L mRNA在胰腺癌組織中的表達量高于癌旁組織[（2.63±0.23）vs.（1.12±0.21），P＜0.01]（圖1）。

圖1 qRT-PCR檢測胰腺癌及癌旁組織ERO1L mRNA表達水平Figure 1 ERO1L mRNA expression levels in pancreatic cancer tissue and adjacent normal pancreatic tissue determined by qRT-PCR

2.2 ERO1L mRNA表達與胰腺癌患者臨床病理因素的關系

統(tǒng)計分析結果顯示，ERO1L mRNA表達與患者性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤部位無關（均P＞0.05），與腫瘤分化程度、臨床分期、遠處轉移及淋巴結轉移有關（均P＜0.05）（表1）。

表1 ERO1L mRNA表達與胰腺癌患者臨床病理因素的關系[n（%）]Table 1 Relations of ERO1L mRNA expression with clinicopathologic factors in pancreatic cancer patients[n (%)]

2.3 ERO1L mRNA表達水平與胰腺癌患者預后的關系

ERO1L高表達組1年無瘤生存率為50.3%，ERO1L低表達組為71.4%，ERO1L高表達組1年無瘤生存率低于ERO1L低表達組（P＜0.01）；ERO1L高表達組3年無瘤生存率為3.2%，ERO1L低表達組3年無瘤生存率為21.8%，ERO1L高表達組3年無瘤生存率低于ERO1L低表達組（P＜0.01）（圖2 A）。E R O 1 L高表達組1年總生存率為57.3%，ERO1L低表達組1年總生存率為86.9%，E R O 1 L高表達組1年總生存率低于E R O 1 L低表達組（P＜0.01）；ERO1L高表達組3年總生存率為21.6%，ERO1L低表達組3年總生存率為57.1%，ERO1L高表達組3年總生存率低于ERO1L低表達組（P＜0.01）（圖2B）。

圖2 ERO1L高表達與低表達胰腺癌患者的生存曲線 A：無瘤生存曲線；B：總生存曲線Figure 2 Survival curves of pancreatic cancer patients with high or low ERO1L A: Disease-free survival curves; B: Overall survival curves

2.4 ERO1L mRNA表達為影響胰腺癌患者無瘤生存及總生存的危險因素

單因素和多因素風險回歸分析顯示，除遠處轉移為胰腺癌患者無瘤生存期（P=0.019）和總生存期（P=0.025）的獨立危險因素外，ERO1L表達也為判斷胰腺癌患者無瘤生存期（P=0.029）和總生存期（P=0.021）的獨立危險因素（表2-3）。

表2 單因素及多因素分析胰腺癌患者無瘤生存期相關的危險因子Table 2 Univariate and multivariate analyses of risk factors for tumor-free survival time in patients with pancreatic cancer

表3 單因素及多因素分析胰腺癌患者總生存期危險因子Table 3 Univariate and multivariate analyses of risk factors for overall survival time in patients with pancreatic cancer

3 討 論

胰腺癌是一種高致死性腫瘤，預后極差[8-10]，流行病學研究[11-12]表明，到2030年胰腺癌將超過乳腺癌、前列腺癌和結腸癌，成為第二大致死性腫瘤。研究胰腺癌的發(fā)病機制，尋找診斷治療胰腺癌的靶標仍是該領域研究的重點。

ERO1L基因定位于人的第14號染色體，其轉錄翻譯后主要定位在內質網(wǎng)腔中，具有氧化還原酶活性，調控由缺氧誘導的蛋白質折疊[13]。ERO1L催化蛋白質二硫鍵的形成并參與由內質網(wǎng)應激導致的細胞凋亡、炎癥及轉移過程[14-17]。Kukita等[18]發(fā)現(xiàn)ERO1L可通過氧化折疊調控I型MHC分子的表達。Hsu等[19]通過蛋白組學發(fā)現(xiàn)ERO1L高表達于肺癌組織中，并與肺癌患者的淋巴結轉移和預后差相關。本研究發(fā)現(xiàn)，ERO1L mRNA在胰腺癌組織中的表達顯著高于的癌旁組織，結合臨床病理因素分析發(fā)現(xiàn)，ERO1L mRNA高表達的胰腺癌患者與惡性的臨床病理因素相關，且ERO1L mRNA高表達的胰腺癌患者其無瘤生存率和總生存時間均顯著低于低表達組患者，這與其他腫瘤中的研究結果一致。關于ERO1L在人類腫瘤中的作用機制報道相對較少，Tsutomu等[20]的發(fā)現(xiàn)，ERO1L可促進乳腺癌細胞在小鼠體內生長及血管生成，機制研究發(fā)現(xiàn)，ERO1L通過影響血管內皮生長因子氧化蛋白折疊進而調控血管內皮生長因子的mRNA表達。在小鼠乳腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，過表達ERO1L可抑制免疫T細胞抗腫瘤活性[21]。在胰腺癌[22]的功能研究中，發(fā)現(xiàn)ERO1L作為一個癌基因通過激活Wnt/catenin信號通路促進胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力，但并沒有通過臨床病例標本研究ERO1L基因表達水平與胰腺癌患者臨床病理參數(shù)及預后的關系。

在本研究中，ERO1L mRNA在胰腺癌組織中的表達量與患者臨床病理因素，如患者臨床分期、遠處轉移及淋巴結轉移均顯著相關，這些惡性病理特征正是腫瘤難以治愈，術后易復發(fā)、致死率高的主要原因。ERO1L mRNA低表達組患者術后復發(fā)幾率較小，總生存時間顯著長于ERO1L mRNA高表達組患者。ERO1L高表達組1、3年無瘤生存率低于ERO1L低表達組。單因素和多因素分析示ERO1L mRNA高表達可作為判斷胰腺癌患者預后不良的獨立危險因子，這與ERO1L在其他腫瘤中的報道一致。以上結果提示ERO1L在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其表達水平可作為判斷胰腺癌患者預后的重要指標。

本研究也存在一定的不足之處，比如研究僅限于ERO1L基因與胰腺癌患者臨床病理特征的關系研究，然而該基因是如何影響患者預后的機制尚不清楚，根據(jù)本研究結果，如ERO1L基因高表達的胰腺癌患者更易出現(xiàn)淋巴結轉移和遠處轉移等特點，筆者推測ERO1L可能參與了胰腺癌細胞侵襲轉移能力，具體的機制還有待后續(xù)基礎實驗來揭示。

綜上，ERO1L mRNA在胰腺癌組織中高表達，ERO1L mRNA高表達與胰腺癌惡性臨床病理因素及預后差相關。檢測ERO1L基因的表達水平可作為判斷胰腺癌患者不良預后的重要指標，進一步深入研究ERO1L在胰腺癌中的作用機制將有待助于指導胰腺癌治療及開發(fā)新的治療靶點。