郝玉琴，劉俠，康淑霞，張鑫，張坤，朱永蒙

[1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（包鋼醫(yī)院）皮膚科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（包鋼醫(yī)院）生殖中心，內(nèi)蒙古 包頭 014010]

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）為皮膚科常見惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年上升[1]，傳統(tǒng)治療SCC的方法包括手術(shù)切除、放療、光動(dòng)力治療、激光、冷凍等，然而這些方法對于發(fā)生在暴露部位、特殊部位以及較大的腫瘤療效欠佳。靶向Survivin-shRNA有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。NF-κB對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重大意義，其傳導(dǎo)通路可通過調(diào)控Bax、Survivin等多種下游凋亡基因，從而控制腫瘤細(xì)胞的凋亡[2-3]。生存素（Survivin）是近年發(fā)現(xiàn)的最新凋亡抑制因子，本研究通過觀察SurvivinshRNA對人SCC A431細(xì)胞株裸鼠移植瘤生長情況的影響，探討NF-κB信號(hào)通路在Survivin-shRNA誘導(dǎo)SCC移植瘤凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與動(dòng)物

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞由長沙贏潤生物技術(shù)有限公司提供，Hela細(xì)胞由長沙贏潤生物技術(shù)有限公司代購，rAd-EGFP、shRNA表達(dá)載體pYr-1.1由長沙贏潤生物技術(shù)有限公司提供，rAd-SurvivinshRNA腺病毒由長沙贏潤生物技術(shù)有限公司構(gòu)建，包裝細(xì)胞HEK 293購自美國ATCC公司，DMEM（高糖型）培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、抗生素購自美國Invitrogen公司，凱基Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購自深圳晶美生物有限公司，β-acting購自美國Abgent公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。SPF級(jí)BALB/c-nu裸鼠，6～8周齡，18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格許可證編號(hào)為：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A431細(xì)胞培養(yǎng)在含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素各100 u/ml的高糖DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長處于對數(shù)生長期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，血細(xì)胞平板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107個(gè)/ml，4 ml，備用。

1.2.2 構(gòu)建Survivin-shRNA腺病毒載體，篩選最佳干擾序列 根據(jù)shRNA靶位點(diǎn)的選擇原則，從贏潤shRNA數(shù)據(jù)庫中擇優(yōu)選取3條Survivin shRNA序列作為待篩靶序列，以便開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。靶序列1：GAGGCTGGCTTCATCCACTGC，靶序列2：GAGCCAA GAACAAAATTGC，靶序列3：GAAAGTGCGCCGTGCC AT。以上述靶序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)Survivin-shRNA引物：正向Survivin-sh1：5'-CACCGAGGCTGGCTTCAT CCACTGCCTCGAGGCAGTGGATGAAGCCAGCCTCTTT TTTG-3'，反向 Survivin-sh1：5'-AGCTCAAAAAAGAG GCTGGCTTCATCCACTGCCTCGAGGCAGTGGATGAAG CCAGCCTC-3'；正向 Survivin-sh2：5'-CACCGAGCCAA GAACAAAATTGCTTCAAGAGAGCAATTTTGTTCTTGG CTCTTTTTTG-3'，反向 Survivin-sh2：5'-AGCTCAAAAA AGAGCCAAGAACAAAATTGCTCTCTTGAAGCAATTTT GTTCTTGGCTC-3'；正向Survivin-sh3：5'-CACCGAA AGTGCGCCGTGCCATCTTCAAGAGAGATGGCACGGC GCACTTTCTTTTTTG-3'，反向 Survivin-sh3：5'-AGCTC AAAAAAGAAAGTGCGCCGTGCCATCTCTCTTGAAGA TGGCACGGCGCACTTTC-3'。shRNA表達(dá)載體構(gòu)建合成上述引物，用退火B(yǎng)uffer分別溶解引物，然后置于沸水中，自然退火。（退火B(yǎng)uffer的配方為：10 mmol Tris-HCl pH8.0、50 mmol NaCl、1 mmol EDTA）。pYr-1.1原載體上有1個(gè)SacⅠ酶切位點(diǎn)（GAGCTC），當(dāng)外源的shRNA片段成功插入，則會(huì)帶入1個(gè)新的SacⅠ酶切位點(diǎn)，2個(gè)SacⅠ之間的片段長度約為930 bp。因此，pYr-1.1-Survivin-shRNA可以用SacⅠ來進(jìn)行酶切鑒定。將培養(yǎng)好的Hela細(xì)胞分為5組：①KB組：空白細(xì)胞組；②NC組：轉(zhuǎn)染pYr-1.1-NC質(zhì)粒的Hela細(xì)胞；③Survivin-1組：轉(zhuǎn)染pYr-1.1-Survivin-sh1質(zhì)粒的Hela細(xì)胞；④Survivin-2組：轉(zhuǎn)染pYr-1.1-Survivin-sh2質(zhì)粒的Hela細(xì)胞；⑤Survivin-3組：轉(zhuǎn)染pYr-1.1-Survivin-sh3質(zhì)粒的Hela細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后的48 h收集細(xì)胞用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）和Western blot檢測。

1.2.3 復(fù)制A431裸鼠移植瘤模型 將培養(yǎng)好的A431細(xì)胞混懸液以1 ml注射器分別抽取細(xì)胞懸液，接種于SPF級(jí)BALB/c-nu裸鼠，每只裸鼠接種0.2 ml，接種細(xì)胞量約為1×107個(gè)，接種部位為裸鼠右側(cè)腋窩皮下，接種前用碘伏消毒皮膚，觀察裸鼠生活狀況。接種后第12天，選擇腫瘤體積為100～200 mm3左右的裸鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將20只成瘤后的裸鼠隨機(jī)分為空白對照組、陰性對照組、Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染組及Res陽性對照組，每組5只，瘤內(nèi)注射相應(yīng)試劑0.15 ml，1次/2 d，共6次。瘤鼠藥物處理后，每4 d記錄腫瘤生長情況，并于開始藥物處理后的第20天頸椎脫臼法處死所有裸鼠，取瘤組織行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。①空白對照組：單純注射無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液；②陰性對照組：rAd-EGFP；③SurvivinshRNA轉(zhuǎn)染組：rAd-Survivin-shRNA；④Res陽性對照組：注射50 mg/kg Res。

1.2.5 瘤體積、瘤重測量及抑瘤率計(jì)算 用數(shù)字游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積。BALB/c-nu裸鼠腋下皮下接種人A431細(xì)胞后，第8天開始觀察到腫瘤生長，隨后各組腫瘤逐天增長，第12天體積基本達(dá)到100 mm3以上，根據(jù)瘤體積及接種時(shí)間繪制腫瘤生長曲線。藥物處理后20 d，分離被處死的裸鼠腫瘤，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。瘤重抑瘤率%=（陰性對照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重）/陰性對照組瘤重×100%；瘤體積抑瘤率%=（陰性對照組瘤體積-實(shí)驗(yàn)組瘤體積）/陰性對照組瘤體積×100%。瘤體積使用如下公式計(jì)算：V=L×S2/2，V為腫瘤體積（mm3），L為腫瘤長徑（mm），S為腫瘤短徑（mm）。形狀不規(guī)則腫瘤：L按最長直徑計(jì)，S按與最長直徑垂直的短徑中間值計(jì)。

1.2.6 HE染色 將裸鼠成瘤組織經(jīng)脫蠟、水化后，用蘇木精伊紅常規(guī)染色，滴加中性樹膠，蓋片封片，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.7 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況 熒光素（Fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA的3'-OH末端，可用熒光顯微鏡檢測。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能被標(biāo)記。TUNEL結(jié)果判讀：凋亡細(xì)胞核呈綠色，每張切片在高倍鏡（400倍）下選取其中5個(gè)視野，在每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，取5個(gè)視野（＞500個(gè)細(xì)胞），檢測陽性表達(dá)率（陽性核占視野中總細(xì)胞核百分比）作為細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index, AI）。

1.2.8 Western blot法測定Survivin、P53、IKB、P65、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平 倒盡培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，再往培養(yǎng)瓶中加入適量的生理鹽水，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶洗滌細(xì)胞，棄去洗液，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積Solution A加1體積Solution B（50∶1）配置適量BCA工作液，經(jīng)SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜，將膜移至含有5%脫脂牛奶（用TBST溶解牛奶）封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h，將底物A和B在EP管中等體積混合，1 min后，將膜蛋白面朝上放在雜交袋中，再將混合好的A、B底物滴加在膜上，去盡殘液，包好，放入X射線片夾中，將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酶切鑒定、測序及最佳干擾序列篩選結(jié)果

pYr-1.1-Survivin-shRNASacⅠ酶切鑒定結(jié)果見圖1。由酶切結(jié)果可知，此pYr-1.1-Survivin-sh1、pYr-1.1-survivin-sh2、pYr-1.1-Survivin-sh3克隆是正確的。將上述pYr-1.1-Survivin-sh1、pYr-1.1-Survivinsh2、pYr-1.1-Survivin-sh3克隆送去測序。測序引物為：hU6-5' Sequencing primer：5'-GACTATCATAT GCTTACCGT-3'。

圖1 pYr-1.1-Survivin-shRNA酶切鑒定圖

pYr-1.1-Survivin-sh1測序結(jié)果見圖2。Sequence 0：欲獲得Survivin-shRNA-1序列，Sequence 1：pYr-1.1-Survivin-sh1.ab1測序序列，比對軟件：DNAssist。

pYr-1.1-Survivin-sh2測序結(jié)果見圖3。Sequence 2：欲獲得Survivin-shRNA-2序列，Sequence 3：pYr-1.1-survivin -sh2.ab1測序序列，比對軟件：DNAssist。

pYr-1.1-Survivin-sh3測序結(jié)果見圖4。Sequence 7：欲獲得survivin-shRNA-3序列，Sequence 9：pYr-1.1-Survivin-sh3.ab1測序序列，比對軟件：DNAssist。

圖2 pYr-1.1-Survivin-sh1測序結(jié)果

圖3 pYr-1.1-Survivin-sh2測序結(jié)果

圖4 pYr-1.1-Survivin-sh3測序結(jié)果

由以上結(jié)果可知，pYr-1.1-Survivin-sh1、pYr-1.1-Survivin-sh2、pYr-1.1-survivin-sh3構(gòu)建成功。經(jīng)qRT-PCR和Western-blot檢測，Survivin-sh2干擾效果最明顯，選為最佳干擾序列。qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中Survivin mRNA表達(dá)情況，見圖5。Western blot檢測各組細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)情況，見圖6。

2.2 各組腫瘤生長曲線、移植瘤體積、瘤重、及抑瘤率比較

圖5 各組細(xì)胞mRNA表達(dá)

圖6 各組細(xì)胞Survivin的蛋白表達(dá)

圖7 各組裸鼠移植瘤生長曲線圖

各組動(dòng)物至實(shí)驗(yàn)結(jié)束無一只死亡，均全部進(jìn)入指標(biāo)檢測。從各組腫瘤生長曲線（見圖7）可以看出，與空白對照組及陰性對照組比較，Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染組及Res陽性對照組在相應(yīng)干預(yù)后移植瘤生長均有不同程度的抑制。干預(yù)結(jié)束時(shí)，Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染組及Res陽性對照組與空白對照組及陰性對照組的瘤體積、瘤重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染組及Res陽性對照組均有較高抑瘤率，其瘤體積抑瘤率分別為45.39%和56.55%，瘤重抑瘤率分別為41.25%和56.25%。見表1。

2.3 各組移植瘤組織HE染色結(jié)果

光鏡下觀察HE染色切片可見各組移植瘤組織內(nèi)有壞死，壞死灶與瘤組織界限較清晰。其中空白對照組及陰性對照組每張切片僅有少許壞死，大部分為腫瘤組織，腫瘤細(xì)胞密集成群、生長旺盛、細(xì)胞多為多邊形，核大深染；Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染組及Res陽性對照組壞死細(xì)胞較多，腫瘤組織較少，腫瘤細(xì)胞分布稀疏，有變性的液化壞死灶，癌細(xì)胞皺縮變圓，胞核固縮。見圖8。

2.4 各組移植瘤組織TUNEL檢測結(jié)果

TUNEL檢測細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率水平，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.177，P=0.000），各組細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率有差異；與Res陽性對照組比較，Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.569，P=0.169）；與空白對照組及陰性對照組比較，Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.769和6.289，P=0.001和0.000）。熒光顯微鏡下凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)見圖9。

表1 各組瘤體積及瘤重抑瘤率比較結(jié)果 （±s）

表1 各組瘤體積及瘤重抑瘤率比較結(jié)果 （±s）

注：1）與陰性對照組比較，P＜0.05；2）與空白對照組比較，P＜0.05

瘤率/% 瘤重/g 瘤重抑瘤率/%空白對照組 1668.98±242.56 - 1.06±0.23 -陰性對照組 1792.36±55.10 - 1.60±0.29 -組別 瘤體積/mm3瘤體積抑SurvivinshRNA轉(zhuǎn)染組 978.86±150.611） 45.39 0.94±0.321）2） 41.25 Res陽性對照組 778.73±131.801）2） 56.55 0.7±0.231）2） 56.25 F值 49.273 - 9.791 -P值 0.000 - 0.010 -

圖8 各組移植瘤組織學(xué)改變 （顯微鏡×200）

圖9 各組凋亡細(xì)胞陽性表達(dá) （熒光顯微鏡×400）

2.5 各組凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)

Western blot法檢測各組Survivin、P65、P53、IκB、Caspase-3蛋白表達(dá)，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各組 Survivin、P65、P53、IκB、Caspase-3蛋白表達(dá)有差異。與Res陽性對照組比較，Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染組Survivin、P65、IκB的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.045、1.451和0.369，P=0.965、0.185 和 0.722）；P53、Caspase-3蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.476和3.041，P=0.020和0.023）。與空白對照組及陰性對照組比較，Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染組Survivin、P65蛋 白的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tSurvivin=16.974和 19.594，tP65=9.808和 8.385， 均P=0.000），P53、IκB、Caspase-3蛋白表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tP53=14.645 和 15.236，均PP53=0.000；tIκB=2.795和 2.807，均PIκB=0.023 ；tCaspase-3=6.206 和 6.731， 均PCaspase-3=0.000）（見表2）。各組凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)檢測結(jié)果見圖10。

表2 各組凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)比較 （±s）

表2 各組凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)比較 （±s）

注：1）與陰性對照組比較，P ＜0.05；2）與空白對照組比較，P ＜0.05

組別 Survivin P65 P53 IκB Caspase-3空白對照組 0.95±0.06 0.92±0.09 0.34±0.07 0.45±0.22 0.41±0.08陰性對照組 0.99±0.05 0.97±0.93 0.36±0.06 0.43±0.23 0.39±0.12 Survivin-shRNA 轉(zhuǎn)染組 0.25±0.071）2） 0.34±0.101）2） 0.94±0.061）2） 0.86±0.241）2） 0.81±0.121）2）Res陽性對照組 0.25±0.071）2） 0.72±0.031）2） 1.25±0.021）2） 0.92±0.301）2） 1.18±0.241）2）F值 218.075 72.588 75.904 5.362 33.298 P值 0.000 0.000 0.000 0.010 0.000

圖10 各組凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)

3 討論

Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族中分子量最小且作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，不同于IAP家族的其他成員，Survivin在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，而在分化成熟的組織中不表達(dá)或低表達(dá)，這一特性使它成為研究腫瘤標(biāo)記和抗腫瘤治療的標(biāo)志性蛋白[4]。

腫瘤是多種基因相互作用調(diào)控的結(jié)果，RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術(shù)是通過小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）引起目的信使RNA（messenger RNA, mRNA）特異性降解，從而使基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)可以同時(shí)沉默多個(gè)腫瘤相關(guān)基因，因此成為目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。載體介導(dǎo)shRNA表達(dá)技術(shù)能長期和穩(wěn)定地抑制目的基因的表達(dá)，可用于構(gòu)建理想的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型，因此，shRNA表達(dá)載體技術(shù)已成為腫瘤基因治療的強(qiáng)大工具[5]。

P53是一種核轉(zhuǎn)錄因子，可通過一系列的應(yīng)激因素如DNA損傷、低氧和癌基因活化后可被激活。P53的關(guān)鍵作用之一就是通過參與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控來維持遺傳的穩(wěn)定性；同時(shí)作為腫瘤抑制基因，P53在腫瘤發(fā)生的預(yù)防中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其對Survivin的調(diào)節(jié)也有細(xì)胞周期依賴性。Survivin作為在G2/M期特異性表達(dá)的凋亡抑制蛋白參與細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控，P53作為凋亡活化基因通過在細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)抑制Survivin的活性而發(fā)揮其生物學(xué)功能，而Survivin又可以在轉(zhuǎn)錄后水平對P53進(jìn)行調(diào)節(jié)。二者通過調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡來參與腫瘤發(fā)生的調(diào)控[6-7]。

核因子κB（NF-κB）是一個(gè)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中存在的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它參與多種細(xì)胞生物反應(yīng)，其活化后可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。NF-κB家族包括5個(gè)成員：NF-κB1（P50及其前體 P105）、NF-κB2（P52及 其 前 體 P100）、RelA（P65）、RelB、c-Rel，形成不同的同源和異源二聚體。不同的信號(hào)通路導(dǎo)致不同的二聚體NF-κB的激活，導(dǎo)致不同的生物學(xué)結(jié)果[8]。其中RelA（P65）主要參與細(xì)胞增殖和有效的免疫應(yīng)答。IκB（inhibitor of NF-κB）是NF-κB的抑制蛋白，在未受刺激的細(xì)胞中，NF-κB與IκB的結(jié)合被隔離在細(xì)胞質(zhì)外，防止NF-κB與DNA結(jié)合，從而抑制NF-κB的生物學(xué)功能。NF-κB信號(hào)的激活是由細(xì)胞外刺激啟動(dòng)的，這些刺激被受體識(shí)別并傳遞到細(xì)胞中，將導(dǎo)致IκB激酶（IKK）激活，使IκB磷酸化并泛素化，最后IκB降解，釋放的NF-κB蛋白被運(yùn)入細(xì)胞核，結(jié)合到相應(yīng)的靶序列上激活基因并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[9]。在B細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)直腸癌和T細(xì)胞白血病中，已報(bào)道了NF-κB與Survivin基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄[10]。

CUI等[11]研究表明，在膀胱癌中，NF-κB可以促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，并且活化的NF-κB信號(hào)通路有助于Survivin表達(dá)上調(diào)，并通過上調(diào)Survivin的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，從而增加細(xì)胞的增殖。ZENG等[10]在食道癌的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Survivin的表達(dá)可以增加P65的上游基因IKK在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)增高，并可以促進(jìn)P65的蛋白表達(dá)增加，反之則抑制P65的蛋白表達(dá)，Survivin可以與IKK的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。過表達(dá)的Survivin可以激活P65的活性，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。鮑聚喜等[12]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中，靶向沉默P65基因，可以降低Survivin基因的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靶向Survivin-shRNA可以抑制裸鼠移植瘤瘤體積及瘤重的生長；在顯微鏡下Survivin-shRNA組移植瘤組織細(xì)胞較少，分布稀疏，有變性的液化壞死灶，癌細(xì)胞皺縮變圓，胞核固縮；通過TUNEL檢測Survivin-shRNA組細(xì)胞凋亡率增高。靶向Survivin-shRNA可以抑制SCC裸鼠移植瘤的生長，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，再次證明靶向SurvivinshRNA對腫瘤的抑制作用。通過Western blot法檢測Survivin、P53、IκB、P65、Caspase-3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，Survivin-shRNA組P53、IκB、Caspase-3蛋白的表達(dá)增加，而Survivin、P65蛋白的表達(dá)降低，這與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果是一致的[10]。因此推測，SurvivinshRNA抑制SCC裸鼠移植瘤生長的機(jī)制之一，可能是靶向Survivin-shRNA抑制Survivin表達(dá)，從而抑制P65的上游基因IKK表達(dá)，促使IκB與P65的結(jié)合，抑制了P65的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致SCC移植瘤的生長受到抑制。其次靶向SurvivinshRNA使Survivin的表達(dá)降低，激活Caspase-3，從而促使細(xì)胞凋亡，而形成的凋亡蛋白又進(jìn)一步激活P53，從而進(jìn)一步擴(kuò)大凋亡效應(yīng)。

綜上所述，靶向Survivin-shRNA對A431 SCC抑制作用機(jī)制之一，可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。