王若石，蔡鈞

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 急診創(chuàng)傷外科，湖北 武漢 430030）

肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，目前居我國惡性腫瘤發(fā)病率的第一位[1]，肺癌的治療主要包括手術(shù)、放療、化療及分子靶向治療。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）常用的化療藥是順鉑（Cisplatin, DDP），一種細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒藥物，主要通過干擾腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制達(dá)到抗腫瘤效果，并且與給藥濃度呈正相關(guān)，但同時毒性作用也會增加[2-3]。此外，順鉑治療肺癌產(chǎn)生耐藥的研究時有報道[4]，因此有必要尋找降低毒副作用、提高治療效果的聯(lián)合用藥方案。

茶多酚（tea ployphenols, TP），其是一類多羥基酚類化合物，普遍存在于茶葉中，目前學(xué)術(shù)界對它的研究較多，文獻(xiàn)報道其有化療增敏、抑制腫瘤細(xì)胞生長、減輕化療藥的毒副作用的功效[5-6]。但茶多酚在肺癌中的報道較少，因此本研究在體外采用TP與DDP聯(lián)合作用于肺癌細(xì)胞，以闡明其對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的作用和影響，探討其對DDP抗腫瘤療效的增敏作用，并初步探討其作用機(jī)制，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，RPMI-1640培養(yǎng)基及胰酶均購自美國Invitrogen公司，MTT試劑盒、二甲亞砜（DMSO）購自美國Invitrogen公司，AnnexinV/PI雙染試劑盒購自南京博泰生物科技有限公司，p-AKT、p-ERK1/2、AKT、ERK1/2抗體購自美國Cell signaling technology公司，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購于上海碧云天生物技術(shù)研究所，離心機(jī)購自日本久保田公司，超凈工作臺購自江蘇蘇凈集團(tuán)，生化床購自蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品公司，電泳儀、電轉(zhuǎn)儀購自北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 結(jié)合臨床及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TP和DDP給藥濃度分別選擇10和5 μg/ml，實(shí)驗(yàn)分為TP組、DDP組、TP聯(lián)合DDP組（TP+DDP組）及空白對照組，空白對照組僅加入等量溶媒。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，于37℃、5%二氧化碳CO2的條件下，加入RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至融合后，胰酶消化細(xì)胞，并待細(xì)胞長至對數(shù)期時加入藥物行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖率的檢測采用MTT法，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于96孔板，按每孔5×103個的數(shù)量接種，每孔100μl。培養(yǎng)條件為：37℃、5%CO2，細(xì)胞培養(yǎng)生長至70%，按分組要求給予不同處理藥物，每組設(shè)5個復(fù)孔。藥物作用24 h后，每孔加入5 g/L MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔按150μl的量加入DMSO，在室溫條件下，震蕩10 min，在570 nm處用酶標(biāo)儀檢測4組細(xì)胞的吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖率=處理組OD值/對照組OD值×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞凋亡率的檢測采用流式細(xì)胞術(shù)，將TP組、DDP組、TP+DDP組及空白對照組4組細(xì)胞以每孔5×105個接種于12孔板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，4℃離心5 min（1500 r/min），棄上清。用500μl PBS溶液重懸細(xì)胞并計數(shù)，取1×106個細(xì)胞數(shù)，加入5μl AnnexinV-FITC并混勻，加入5μl PI并混勻，在2～8℃避光孵育15 min，冰浴避光保存，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測 采用 Western blot檢測p-ERK1/2、p-AKT蛋白的相對表達(dá)，裂解4組細(xì)胞后，提取4組細(xì)胞總蛋白，測定4組蛋白濃度后，定量，上樣，以50μg/孔的標(biāo)準(zhǔn)上樣，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，條件：濃縮膠60 mA 50 min、分離膠120 mA 1 min，將凝膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，放入含50 g/L脫脂奶粉的溶液中封閉1 h，加入p-ERK1/2、p-AKT、GAPDH一抗，濃度為1︰200，在4℃條件下孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1︰1000）或HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1︰1000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像儀中顯色，采用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以p-AKT、p-ERK1/2分別與AKT、ERK1/2條帶灰度的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組A549細(xì)胞增殖率比較

MTT示：TP組增殖率為（91.0±3.6）%，DDP組增殖率為（84.3±5.0）%，TP+DDP組增殖率為（70.3±4.2）%，空白對照組增殖率為100%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=84.47，P=0.000），TP組、DDP組及TP+DDP組增殖率均低于空白對照組；TP+DDP組細(xì)胞增殖率與DDP組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.398，P=0.002），TP+DDP組低于DDP組（見圖1）。培養(yǎng)第2天開始DDP對細(xì)胞A549有抑制作用，且隨著作用時間的延長，生長曲線下降逐漸明顯，TP+DDP組生長曲線下降較DDP組更為明顯，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2）。

圖1 TP、DDP及兩者聯(lián)用對細(xì)胞A549增殖的影響

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)所示，空白對照組總凋亡率為（7.86±0.34）%，DDP組總凋亡率為（18.78±0.62）%，TP組總凋亡率為（5.85±0.41）%，TP+DDP組為（26.46±0.45）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=102.93，P=0.000）；DDP組和TP+DDP組總凋亡率與空白對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），TP+DDP組細(xì)胞凋亡率高于TP組（t=8.398，P=0.015），TP組與空白對照組凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.839，P=0.265）。見圖3。

圖2 TP、DDP及兩者聯(lián)合作用下A549細(xì)胞的生長曲線

2.3 p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)變化

空白對照組p-AKT蛋白相對表達(dá)為（1.0±0.03），TP 組為（1.0±0.04），DDP 組為（0.79±0.06），TP+DDP組為（0.68±0.02），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.12，P=0.000）；DDP組p-AKT蛋白相對表達(dá)與空白對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.422，P=0.005），DDP組低于空白對照組；TP+DDP組p-AKT蛋白相對表達(dá)與空白對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-15.372，P=0.000），TP+DDP組低于空白對照組。見圖4。

空白對照組p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)為（1.0±0.02），TP 組為（0.98±0.04），DDP 組為（0.82±0.05），TP+DDP 組為（0.65±0.05），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=35.970，P=0.000）；DDP組p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)與空白對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.789，P=0.004），DDP組低于對照組；經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，TP+DDP組p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-11.257，P=0.000），TP+DDP組低于空白對照組。見圖4。

圖4 TP、DDP及兩者聯(lián)用對A549細(xì)胞p-ERK1/2及p-AKT蛋白表達(dá)的影響

3 討論

順鉑是治療非小細(xì)胞肺癌的重要藥物，單藥有效率為16%～20%，通常與紫杉醇或長春瑞濱聯(lián)用作為標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案[7-8]。但抗腫瘤的化療藥副作用大，引起諸多不良反應(yīng)，諸如：脫發(fā)、骨髓抑制、肝腎毒性及胃腸道反應(yīng)等，而且長期使用容易導(dǎo)致耐藥性發(fā)生，進(jìn)而引起腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移等[9]，如何減輕化療藥物的毒性，并增強(qiáng)化療藥物療效成為了腫瘤研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。

TP作為一種無毒性作用的天然植物提取物，有研究報道，其有一定的抗腫瘤作用，少量的茶多酚作用于前列腺癌、乳腺癌及肺癌細(xì)胞可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量TP作用于A549細(xì)胞未能引起細(xì)胞凋亡，然而與DDP聯(lián)用卻可以增加A549細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在受到生理和病理性刺激后出現(xiàn)的一種自發(fā)性死亡過程，在細(xì)胞凋亡過程中，半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族發(fā)揮著重要的作用，凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程被啟動后，半胱氨酸蛋白酶8（Caspase-8）可由酶原變成具有活性的蛋白，并誘導(dǎo)凋亡級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生，半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）是細(xì)胞凋亡性死亡的最終執(zhí)行者，它最終被活化為裂解型Caspase-3，能夠直接裂解多個重要的結(jié)構(gòu)與功能蛋白[13-14]。

細(xì)胞凋亡過程可分為3個階段，即起始階段、效應(yīng)階段和凋亡執(zhí)行階段，機(jī)體內(nèi)存在多種因素影響著細(xì)胞凋亡的過程。

絲裂素活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用越來越受到關(guān)注，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞各種生理過程，包括炎癥、應(yīng)激、生長發(fā)育、分化與死亡[15]。MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）、Jun氨基末端激酶（JNK）、p38蛋白和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）途徑，其中ERK通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，它可在上游因子MEK的作用下發(fā)生磷酸化而激活[16-17]。

ERK通路與PI3K/AKT通路存在密切的聯(lián)系，ZHANG等[18]證明ERK通路與AKT通路有交互作用，他們發(fā)現(xiàn)抑制Hela細(xì)胞ERK的活化，可引起mTOR的激活，而PI3K/AKT信號通路的激活可阻斷該過程所致mTOR的活化。PI3K信號通路可調(diào)控著諸如細(xì)胞凋亡、分裂、分化等多種生物學(xué)過程。絲氨酸/蘇氨酸AKT，又稱蛋白激酶B，為其直接靶作用蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡的發(fā)生。在PI3K的作用下，AKT發(fā)生磷酸化而被激活，從而作用于多種底物來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖和代謝[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞A549中，TP與DDP聯(lián)合后可顯著增強(qiáng)DDP的抗腫瘤效應(yīng)，MTT法檢測結(jié)果顯示DDP組的細(xì)胞活力為（84.3±5.0）%，而TP+DDP組的細(xì)胞活力僅為（70.3±4.2）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，TP組的細(xì)胞增殖僅有輕度抑制，因此TP與DDP聯(lián)合可明顯提高DDP對細(xì)胞A549增殖的抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)測定凋亡發(fā)現(xiàn)，TP對細(xì)胞凋亡作用不明顯，無顯著影響。DDP組與空白對照組比較，細(xì)胞凋亡率升高，而TP+DDP組細(xì)胞凋亡率高于TP組，說明TP可促進(jìn)DDP對肺癌細(xì)胞A549的毒性作用。Western blot檢測AKT和ERK1/2的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，DDP組與TP+DDP組細(xì)胞中p-AKT和p-ERK1/2蛋白表達(dá)均降低，并且TP+DDP組細(xì)胞中p-ERK1/2和p-AKT蛋白表達(dá)低于DDP組，而TP組對p-ERK1/2和p-AKT蛋白表達(dá)均無明顯影響。

綜合以上結(jié)果，說明DDP可抑制A549細(xì)胞增殖，并且可引起細(xì)胞凋亡，但低劑量TP對A549細(xì)胞的增殖僅有輕微抑制作用，并且對細(xì)胞凋亡無明顯影響，而TP與DDP聯(lián)合應(yīng)用卻可使細(xì)胞增殖率大幅降低，并使細(xì)胞凋亡率明顯升高，同時TP與DDP聯(lián)用對ERK1/2和AKT蛋白磷酸化的抑制作用也明顯增加，說明TP可增強(qiáng)DDP的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與抑制AKT和ERK1/2蛋白磷酸化有關(guān)。