王瑤函，吳蕊

（河南省阜外華中心血管病醫(yī)院 心肺功能科，河南 鄭州 450003）

高血壓以體循環(huán)動脈壓升高為特征，是伴有心臟、血管、腦和腎臟等器官功能性或器質(zhì)性損害的臨床綜合征[1]。高血壓治療不及時將導致腦溢血、動脈硬化、心肌梗死、腎衰竭和失明。高血壓的發(fā)病率和病死率逐年在增加，已嚴重威脅人類的生命與健康[2]。3'，5'-環(huán)化腺苷一磷酸（3'，5'-cyclic adenosine monophosphate, cAMP）在心肌收縮、血管平滑肌緊張性、細胞增殖和蛋白質(zhì)的合成等多種生物學活動中發(fā)揮作用[3]。本研究通過實驗觀察cAMP對高血壓鼠血管平滑肌細胞增殖的影響，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

WKY大鼠20只，體重200～215 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011。20只大鼠隨機分為高血壓鼠和正常鼠，每組各10只。

1.2 試劑與儀器

蛋白提取試劑盒（美國Thermo Scientific公司），DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco公司），MTT試劑盒、DAB試劑盒、ROS試劑盒（廣州碧云天公司），腺苷酸環(huán)化酶激活劑（Forskolin，F(xiàn)SK）、一氧化氮合酶抑制劑（N-Nitro-L-arginine Methyl Ester，LNAME）、膠原酶Ⅰ、db-cAMP（美國Sigma公司）及其配套供給的稀釋溶劑，兔抗鼠Giα2抗體、兔抗鼠Giα3抗體、羊抗鼠表皮生長因子受體（EGFR）抗體、兔抗鼠p-EGFR抗體、兔抗鼠細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）抗體、兔抗鼠p-ERK1/2抗體、羊抗鼠原癌基因（c-Src）抗體、兔抗鼠pc-Src抗體和Dynein抗體（美國Abcam公司），ECL發(fā)光液（美國Millipore公司）。流式細胞儀（FACSVerse，美國BD公司），凝膠成像儀（GelDoc-It，美國UVP公司），酶標儀（ELX800，美國Bio-Tek公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 一氧化氮（NO）缺乏性高血壓鼠模型的復制[4]正常鼠常規(guī)飼養(yǎng)，高血壓鼠每日喂食L-NAME，每天灌胃給藥L-NAME 1次，劑量為6 mg/kg，連續(xù)給藥1周和3周后，每天對大鼠進行24 h動態(tài)血壓檢測和活動記錄，大鼠動態(tài)血壓的收縮壓/舒張壓符合白晝＞150/100 mmHg，夜間＞140/90 mmHg時為高血壓。

1.3.2 血管平滑肌的原代培養(yǎng) 正常和高血壓大鼠脫頸處死，75%酒精浸泡2～3 min，無菌臺中迅速將胸/腹主動脈取出，放到盛有預冷的PBS的平皿中清洗表面的凝血塊。把主動脈放到盛有DMEM+雙抗的培養(yǎng)皿中用手術鉗除去外膜和脂肪。將血管縱向剪開，用刀片自上而下輕輕刮2下，除去內(nèi)膜。放到加有3～5 ml 1 mg/ml膠原酶Ⅰ+DMEM+雙抗的15 ml管中，室溫孵育3 h。用20% FBS+雙抗的DMEM洗血管，把血管切成1 mm3的小片，內(nèi)膜一面朝下貼向培養(yǎng)瓶底，放到5% CO2培養(yǎng)中培養(yǎng)4 h貼壁后加入適量的20% FBS+雙抗的DMEM液。培養(yǎng)過夜。第2天換液，待組織處長出細胞后移去組織，繼續(xù)培養(yǎng)細胞，待后續(xù)實驗用。

1.3.3 流式細胞儀檢測活性氧（ROS） 取培養(yǎng)的正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞胰酶消化計數(shù)后在24孔板中接種3×104/2 ml個細胞每孔，貼壁培養(yǎng)24 h。正常鼠血管平滑肌細胞加入0.5 mmol/L dbcAMP，高血壓鼠血管平滑肌細胞加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP培養(yǎng)12 h，同時設空白對照組。棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次。用無血清DMEM培養(yǎng)液按照1∶1000稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μl/L，每孔加入500 μl稀釋后的探針，培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清DMEM洗滌細胞3次，充分洗去未進入細胞的DCFH-DA探針。細胞刮刀收集細胞，流式細胞儀定量檢測細胞ROS水平。

1.3.4 噻唑藍比色（MTT）法檢測db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞活性的影響 取培養(yǎng)的正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞消化計數(shù)以每孔2×103個細胞（100 μl）的數(shù)量接種在96孔板培養(yǎng)24 h，分別加入0.5 mmol/L db-cAMP和FSK，同時設對照組，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。取出96孔板棄掉培養(yǎng)液，每孔加入100 μl無血清的DMEM培養(yǎng)液，再每孔加入5 g/L MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶標儀在波長490 nm處讀取吸光度（A490）值。

1.3.5 Western blot檢測 取培養(yǎng)的正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞消化計數(shù)以每孔5×104個細胞的數(shù)量接種在6孔板培養(yǎng)24 h，正常鼠血管平滑肌細胞加入0.5 mmol/L db-cAMP，高血壓鼠血管平滑肌細胞加入0.1、0.3、0.5和1 mmol/L db-cAMP，同時設對照組，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。用蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，用BCA法測定每組蛋白濃度，每孔總蛋白上樣量為50 μg，上完樣后進行12% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)PVDF膜（80 V，90 min），用封閉液（5%脫脂奶粉）封閉2 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分別用如下一抗Giα-2（1∶1000）、Giα-3（1∶1000）、p-EGFR（1∶5000）、p-EKR1/2（1∶2000）、ERK1/2（1∶1000）、c-Src（1∶1000）、pc-Src（1∶1000）和Dynein（1∶2000）4℃過夜，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分別用稀釋比例為1∶1000的對應二抗37℃搖床反應1 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。然后采用ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，并用Labworks 4.6軟件對圖像進行灰度分析，記錄灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。進行3次獨立實驗后，進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，均通過正態(tài)性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞增殖的影響

在正常鼠中（見圖1左），對照組細胞活性水平為（100.0±0.0）%，db-cAMP組和FSK組細胞活性水平均相近，3組整體比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.483，P=0.324），提示在正常鼠中db-cAMP和FSK對血管平滑肌細胞無促增殖作用。在高血壓鼠中（見圖1右），對照組細胞活性水平為（100.0±0.0）%，db-cAMP組細胞活性水平為（36.7±0.2）%，F(xiàn)SK組細胞活性水平為（49.1±0.3）%，3組整體比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=24.483，P=0.025）；與對照組比較，db-cAMP組和FSK組細胞活性均下降，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.916和4.136，P=0.021和0.039），提示db-cAMP和FSK對血管平滑肌細胞具有抑制增殖的作用。

圖1 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞增殖的影響

2.2 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞 Giα2 和 Giα3 蛋白表達的影響

與正常鼠不添加db-cAMP比較，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細胞中Giα2（見圖2A）和Giα3（見圖2B）的蛋白表達均增加（t=83.785和32.935，P=0.000和0.001）。①在高血壓鼠血管平滑肌細胞中分別加入0.1、0.3、0.5和1.0（mmol/L）db-cAMP后Giα2蛋白表達從開始的158.1逐漸下降，甚至降到比正常鼠不添加db-cAMP時還低，其中高血壓鼠的Giα2蛋白表達與正常鼠不添加db-cAMP比較差異有統(tǒng)計學意義（t=22.171、14.008、6.880和31.502，P=0.002、0.005、0.020和 0.001），高血壓鼠中添加db-cAMP的Giα2蛋白表達均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.949、28.289、57.677和 83.653，P=0.001、0.000、0.000和 0.000）（ 見 圖2C和表1）；②在高血壓鼠血管平滑肌細胞中分別加入 0.1、0.3、0.5和 1.0 mmol/L db-cAMP 后 Giα3蛋白表達從開始的138.0逐漸下降，最終降到與正常鼠不添加db-cAMP時的水平相近，其中高血壓鼠不添加db-cAMP、添加 0.1、0.3 mmol/L db-cAMP 的 Giα3 蛋白表達高于正常鼠不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學意義（t=32.935、13.313和 7.772，P=0.001、0.006和0.016），高血壓鼠中添加db-cAMP的Giα3蛋白表達均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.07、24.503、19.804和 22.093，均P=0.000）（見圖2D和表 2）。

圖2 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞Giα2和Giα3蛋白表達的影響

表1 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的Giα2/Dynein蛋白相對表達量比較 （n =10）

表2 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的Giα3/Dynein蛋白相對表達量比較 （n =10）

2.3 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞內(nèi)ROS生成的影響

與正常鼠不添加db-cAMP比較，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細胞中的超氧陰離子含量明顯增加（見圖3）。在高血壓鼠血管平滑肌細胞中分別加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP后血管平滑肌細胞內(nèi)的O2-含量從開始的42.12逐漸下降，甚至降到比正常鼠不添加db-cAMP時還低，其中高血壓鼠不添加db-cAMP、添加0.3、1.0 mmol/L的O2-含量與正常鼠不添加db-cAMP比較差異有統(tǒng)計學意義（t=14.440、3.348和 4.449，P=0.000、0.029和0.011），高血壓鼠中添加db-cAMP的O2-含量均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.433、16.210、13.633和17.183，均P=0.000）（見表3）。

2.4 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞EGFR蛋白磷酸化水平的影響

與正常鼠不添加db-cAMP相比，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細胞中EGFR的磷酸化水平表達增加（見圖4）。與正常鼠不添加db-cAMP相比，正常鼠添加0.5 mmol/L db-cAMP的血管平滑肌細胞中EGFR的磷酸化水平變化不大，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。高血壓鼠血管平滑肌細胞中分 別 加 入 0.1、0.3、0.5和 1.0 mmol/L db-cAMP后EGFR的磷酸化水平逐漸降低，從142.2降低到接近正常鼠不添加db-cAMP時的水平。其中高血壓鼠不添 加 db-cAMP、 添 加 0.1、0.3 mmol/L db-cAMP后EGFR的磷酸化水平高于正常鼠不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學意義（t=68.340、52.952和25.993，P=0.000、0.000和0.001），高血壓鼠中添加0.3、0.5和1.0mmol/L db-cAMP后EGFR的磷酸化水平均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學意義（t=22.080、31.976和 40.912，均P=0.000）。見表 4。

圖3 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞內(nèi)ROS生成的影響

表3 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的O2-生成比較 （n =10）

2.5 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞ERK蛋白磷酸化水平的影響

與正常鼠不添加db-cAMP比較，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細胞中ERK的磷酸化水平明顯增加（見圖5）。血管平滑肌細胞中ERK的磷酸化水平在高血壓鼠血管平滑肌細胞中分別加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP后，ERK的磷酸化水平均降低，從139.3直降至78.1，其中高血壓鼠不添加db-cAMP、添加0.1、0.5、1.0 mmol/L后ERK的磷酸化水平與正常鼠不添加db-cAMP比較差異有統(tǒng)計學意義（t=54.421、30.797、11.949和27.559，P=0.000、0.001、0.007和0.001），高血壓鼠中添加dbcAMP的ERK的磷酸化水平均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學意義（t=22.695、26.886、45.280和56.967，均P=0.000）。見表 5。

圖4 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞EGFR蛋白磷酸化水平表達的影響

表4 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的pEGFR/總EGFR比較 （n =10）

圖5 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞ERK蛋白磷酸化水平表達的影響

表5 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的PERK1/2/總ERK1/2比較 （n =10）

2.6 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞c-Src蛋白磷酸化水平的影響

與正常鼠不添加db-cAMP比較，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細胞中c-Src的磷酸化水平明顯增加（見圖6）。高血壓鼠血管平滑肌細胞中分別加入0.1、0.3、0.5和 1.0mmol/L db-cAMP后c-Src的磷酸化水平降低，從177.3降至與正常鼠不添加db-cAMP時的水平接近。其中高血壓鼠不添加db-cAMP、添加0.1、0.3、0.5mmol/L db-cAMP 后c-Src的磷酸化水平高于正常鼠不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學意義（t=56.544、93.928、36.290和22.761，P=0.000、0.000、0.000和0.001），高血壓鼠中添加dbcAMP的c-Src的磷酸化水平均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.411、17.528、23.924和50.542，P=0.012、0.000、0.000 和 0.000）。見表 6。

圖6 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細胞c-Src蛋白磷酸化水平的影響

表6 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的pc-Src/總c-Src比較 （n =10）

3 討論

cAMP是由腺苷酸環(huán)化酶信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)所產(chǎn)生的第2信使，在血管平滑肌緊張性和細胞增殖等多種生物學活動中發(fā)揮作用[3]。Gs和Gi分別是鳥嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)因子和抑制因子，它們可以通過調(diào)節(jié)激素的水平從而調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性和cAMP的表達水平。Gi蛋白的表達減少可以誘導高血壓、心肌肥大和心力衰竭等多種病理狀態(tài)[5]。報道指出，在自發(fā)性高血壓鼠模型的心血管組織中，Gi蛋白表達、腺苷酸環(huán)化酶活性和cAMP的表達異常[6]。在自發(fā)高血壓鼠模型和醋酸脫氧皮質(zhì)酮高血壓鼠模型的心臟中，Gi蛋白表達增加導致cAMP水平的下降，并且自發(fā)高血壓鼠模型和醋酸脫氧皮質(zhì)酮高血壓鼠模型中，Giα蛋白表達的增加現(xiàn)象出現(xiàn)于高血壓現(xiàn)象出現(xiàn)之前，這表明Giα蛋白表達的增加和cAMP表達的下降可能是高血壓發(fā)病機制的重要因素[7]。通過用百日咳毒素處理2周大小的自發(fā)高血壓鼠模型來抑制Giα蛋白的活性，可以有效抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性并且增加cAMP的表達水平，同時緩解自發(fā)高血壓鼠模型高血壓狀態(tài)[8]。血管緊張素Ⅱ所誘導的Giα蛋白表達的增加可以被db-cAMP所抑制，從而抑制血管平滑肌細胞的增殖[9]。本研究在探究cAMP對高血壓鼠血管平滑肌細胞增殖影響的過程中發(fā)現(xiàn)與正常鼠模型中的血管平滑肌細胞相比，高血壓鼠模型中VSMC細胞中的Giα蛋白表達水平增加，并且細胞增殖速度加快。有報道指出[10-11]增加內(nèi)源性血管緊張素Ⅱ（ANG Ⅱ）和內(nèi)皮素1（ET-1）的表達可以增加Giα蛋白的表達和細胞增殖。

通過研究初步發(fā)現(xiàn)在高血壓鼠模型中血管平滑肌細胞中，db-cAMP可以通過抑制ROS和ROS所介導的c-Src信號通路來抑制Giα蛋白表達的增加和細胞增殖的提高。cAMP在調(diào)節(jié)多種細胞增殖具有重要作用。其中cAMP已經(jīng)被證實可以調(diào)節(jié)上皮細胞、甲狀腺細胞、肝細胞、Swiss 3T3細胞和角質(zhì)細胞的增殖[12-13]。同時，cAMP也可以抑制多種細胞的增殖，例如白血病細胞和平滑肌細胞[14]。本研究選取db-cAMP，其為可以穿透細胞的cAMP類似物，作用于高血壓鼠模型中血管平滑肌細胞時，可以抑制Giα蛋白表達的增加和細胞增殖。db-cAMP對正常鼠血管平滑肌細胞增殖無抑制作用，而在高血壓鼠中，db-cAMP對血管平滑肌細胞具有抑制增殖的作用，加入db-cAMP后細胞活性分別大幅降低。高血壓鼠血管平滑肌細胞中分別加入db-cAMP后Giα2和Giα3的蛋白表達亦明顯降低。

有報道顯示[15]在高血壓鼠模型的血管平滑肌細胞中，蛋白激酶A（PKA）抑制劑可以抑制db-cAMP對Giα蛋白表達增加和細胞增殖。因此筆者推測dbcAMP對抑制Giα蛋白表達的增加和細胞增殖的潛在分子機制可能是由于PKA細胞通路介導的。本實驗發(fā)現(xiàn)，db-cAMP不僅可以抑制Gi蛋白表達的增加和細胞增殖，同時還可以抑制ERK1/2的磷酸化，表明在高血壓鼠模型的VSMC細胞中，db-cAMP對于抑制Giα蛋白表達的增加和細胞增殖可能是由絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路介導的。EGFR活化可以提高Giα蛋白的表達和促進細胞增殖[16]。本研究同時還發(fā)現(xiàn)，加入外源cAMP可以抑制EGFR的活性。初步說明，cAMP可能是通過抑制EGFR的表達從而抑制細胞的增殖和提高Gi蛋白的表達。

c-Src是介導氧應激和EGFR反式激活的主要分子，c-Src抑制因子PP2可以抑制PDGFR和EGFR磷酸化水平的提高[17]。在高血壓鼠血管平滑肌細胞中分別加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP后，c-Src的磷酸化水平表達降低，0.5和1.0 mmol/L db-cAMP組分別降低。所以初步推測外源cAMP可以抑制高血壓鼠模型血管平滑肌細胞中c-Src磷酸化水平。應強調(diào)的是，本研究的設計存在較大的不足和局限性：要觀察某一物質(zhì)是否具有某一新的作用，除了要設置陰性對照和陽性對照外（本實驗未設計），還應做量-效實驗，至少要有5個濃度點，劑量范圍至少達100倍。而本研究觀察僅有4個點，劑量范圍也只有10倍（0、0.1、0.3、0.5和1.0），不是真正的量-效實驗，今后將按照此要求設計實驗，進行量效關系的研究。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)cAMP可以抑制Giα蛋白的表達，細胞增殖，氧化應激，c-Src活化，EGF-R活化。提示db-cAMP抑制高血壓鼠模型的血管平滑肌細胞中Giα蛋白的表達提高和細胞增殖可能是由于其可以抑制氧化應激的上升和下游的信號通路。即高血壓鼠中cAMP表達水平的增加可能具有保護高血壓細胞免受氧應激所誘導的并發(fā)癥。