蔡秀磊， 單 虎， 于 敏，張曉華

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003; 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

目前，細菌性病害是阻礙水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素，不但會給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]，而且由于抗生素濫用也導(dǎo)致了嚴重的耐藥性和食品安全問題[2]，因此尋找安全有效的科學(xué)防控手段一直是我們關(guān)注的熱點。在研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多海洋細菌(如玫瑰桿菌類群的菌株)可以抑制病原菌的生長，并能產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，具有潛在的應(yīng)用前景。褐桿菌是由Martens等[3]于2006年報道的新屬，屬于變形菌門，α-變形菌綱，紅桿菌目，紅桿菌科。目前褐桿菌屬共包括8個種，據(jù)報道該屬的許多菌株對弧菌等水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌均具有較強的抑菌活性[4]，且能通過多種方式從外界獲得營養(yǎng)物質(zhì)并保持生存優(yōu)勢[5]，逐漸受到科研人員的關(guān)注。2012年，Cude等發(fā)現(xiàn)褐桿菌(Phaeobacter)Y41可以產(chǎn)生藍色色素，并能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)顯著抑制鰻弧菌的生長[6]。我們從養(yǎng)殖水體中分離到一株能夠廣泛抑制病原菌的褐桿菌L2，在確定其分類學(xué)地位的基礎(chǔ)上，對其抑菌活性及抑菌活性物質(zhì)進行了初步的分析與鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株L2為本實驗室自養(yǎng)殖水體中防污附鋼片的微生物粘膜中分離得到的菌株，抑菌譜測定實驗中所用的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室分離并保存，鰻弧菌和芽胞桿菌由本實驗室分離并保存。菌株L2、鰻弧菌和芽胞桿菌采用MA培養(yǎng)基在28 ℃進行培養(yǎng)，其他指示菌采用LB 培養(yǎng)基在 37 ℃進行培養(yǎng)。所有菌株以含15%甘油的MA或LB培養(yǎng)基保存于本實驗室-80 ℃冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株L2的 16S rRNA基因測序及序列分析 采用酚氯仿抽提法[7]提取菌株L2的基因組DNA，并以此為模板采用通用引物B8F和B1510[8]擴增菌株L2的16S rRNA基因。其PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化、連接到pUCm-T載體后委托上海英俊測序。將測序所得的16S rRNA基因序列與韓國標準菌數(shù)據(jù)庫(www.ezbiocloud.net)進行比對，用序列綜合分析軟件MEGA7.0[9]以neighbour-joining (NJ)、maximum-likelihood (ML)和maximum-parsimony (MP) 法構(gòu)建菌株L2及相近菌株16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 菌株L2抑菌譜測定 自-80 ℃冰箱將菌株L2復(fù)蘇到MA平板上，培養(yǎng)48 h，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至5 mL MB培養(yǎng)基中，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)箱中以170 r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)過夜。各指示菌經(jīng)復(fù)蘇和振蕩培養(yǎng)過夜后，按1∶100的比例與LB半固體培養(yǎng)基混合、倒板，并采用牛津杯法檢測菌株L2對各指示菌的抑菌活性。每孔中加入菌株L2的發(fā)酵液各50 μL，并選取氨芐青霉素、卡那霉素和四環(huán)素這三種抗生素作為陽性對照。每片藥敏片的抗生素含量分別為：氨芐青霉素10 μg、卡那霉素30 μg和四環(huán)素30 μg。培養(yǎng)24 h后觀察菌株L2和藥敏片的抑菌活性，除去牛津杯的直徑或藥敏片直徑計算菌株L2及3種抗生素的抑菌圈直徑。

1.2.3 不同培養(yǎng)時間對菌株L2的生物量、抑菌活性的影響 將過夜培養(yǎng)的L2發(fā)酵液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接入5 mL MB培養(yǎng)基，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)箱中以170 r/min轉(zhuǎn)速分別振蕩培養(yǎng)12、24、36、48、60和72 h后，收集發(fā)酵液，使用可見光分光光度計測定OD600值，測定不同培養(yǎng)時間菌株L2的生物量；用低溫高速離心機在4 ℃下將發(fā)酵液12 000 r/min 離心10 min，上清經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌后，以牛津杯法檢測其對鰻弧菌(Vibrioanguillarum)VIB72的抑菌活性強弱。

1.2.4 分步硫酸銨沉淀法對菌株L2胞外蛋白的初步純化與抑菌活性檢測 采用平板玻璃紙覆蓋法[10]制備菌株L2的胞外產(chǎn)物。采用分步硫酸銨沉淀法對菌株L2的胞外蛋白進行初步純化。根據(jù)胞外產(chǎn)物的體積緩慢加入硫酸銨并攪拌，使其飽和度達到20%，待硫酸銨完全溶解后，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，收集蛋白沉淀。重復(fù)以上步驟，所得上清分別依次加入硫酸銨使其飽和度達到40%、60%及80%，離心收集蛋白沉淀。所得的蛋白沉淀以0.01 mol/L PBS溶液溶解后以相同溶液透析24 h，從而按照不同硫酸銨飽和度將胞外蛋白初步分離為20%、20%～40%、40%～60%和60%～80% 4部分。以Bradford法測定各部分蛋白的含量，并以鰻弧菌VIB72為指示菌，采用牛津杯法檢測4部分胞外蛋白的抑菌活性。

1.2.5 菌株L2胞外蛋白的膠內(nèi)抑菌活性檢測與活性蛋白的質(zhì)譜鑒定 取15 μL經(jīng)80%硫酸銨飽和度沉淀所得的樣品，加入5 μL 4×SDS上樣緩沖液混勻，用制備的5%濃縮膠、12%分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳時平行進行2個重復(fù)，電泳結(jié)束后一塊膠用考馬斯亮藍R-250染色，一塊膠用于膠內(nèi)活性檢測。

蛋白樣品經(jīng)電泳后，將含有待測樣品的膠條切下，放置于經(jīng)滅菌處理的平板中，在超凈臺中倒入30 mL滅菌三蒸水沖洗膠條，重復(fù)3次后，將膠條置于含有滅菌三蒸水的平板中，打開超凈臺內(nèi)的紫外燈滅菌10 min。輕輕倒掉三蒸水，將膠條平置于另一個干燥的平板中待用。在滅菌的錐形瓶中加入10 mL的0.5% MA半固體培養(yǎng)基，待其冷卻至50 ℃左右時，加入100 μL培養(yǎng)過夜的菌株VIB72(約108cfu/mL)并迅速搖勻、倒板，確保培養(yǎng)基均勻覆蓋在膠條上。待培養(yǎng)基凝固后，正置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，于12 h后觀察結(jié)果。

延長電泳時間，使蛋白條帶更好的分離后，切下有抑菌活性的蛋白條帶，置于離心管中，經(jīng)雙蒸水沖洗后，加入膠內(nèi)消化脫色液清洗2次，并用乙腈脫水至膠粒變白后真空抽干乙腈，加入二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)孵育后，加入0.1 μg/μL的酶儲液對膠塊進行消化過夜后并以終濃度0.1% 的三氟乙酸(TFA)溶液終止消化[11]，取部分樣品委托上海華大基因采用MALDI Tof/Tof (Thermo Q-Exactive 質(zhì)譜儀)進行LC-MS/MS鑒定，并采用軟件Mascot 2.3.01進行數(shù)據(jù)搜索、比對。

2 結(jié)果

2.1 菌株L2的 16S rRNA基因測序結(jié)果

通過細菌通用引物對菌株L2的16S rRNA 基因進行擴增，得到1 482 bp的序列。經(jīng)過與韓國標準菌數(shù)據(jù)庫(www.ezbiocloud.net)進行比對，該基因與抑菌褐桿菌(Phaeobacterinhibens)DSM 16374T相似性最高，為99.86%，與P.gallaeciensisDSM 26640T相似性為99.57%，其次是LeisingeradaeponensisDSM 23529T和L.methylohalidivoransDSM 14336T，相似性為97.84%。用軟件MEGA 7.0對菌株L2及相近菌株的16S rRNA 基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析(見圖1)，結(jié)果顯示菌株L2與P.inhibensDSM 16374T親緣關(guān)系最近，聚為一簇。由此可初步判定菌株L2為抑菌褐桿菌。

2.2 菌株L2的抑菌譜

采用牛津杯法進行菌株L2的體外拮抗實驗，菌株L2可以抑制本實驗中選用的所有病原菌，其中對金黃色葡萄球菌PMJ10-1、TTB1-1和鰻弧菌VIB72的抑制效果最強，其抑菌譜見表1。氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素均無法抑制所有選取的病原菌，部分菌株具有較為廣泛的耐藥性，而菌株L2對病原菌的抑菌活性及抑菌范圍明顯強于這3種抗生素。在后續(xù)研究中，我們均選用能被菌株L2顯著抑制的鰻弧菌VIB72作為指示菌。

(“●”表示該節(jié)點與采用ML、MP法的結(jié)果一致；“○”表示該節(jié)點與采用ML法的結(jié)果一致。Closed circles indicate that the corresponding nodes are also recovered in tree generated with the maximum-likelihood and maximum-parsimony algorithms; Hollowed circles indicate that the corresponding nodes are also recovered in tree generated with the maximum-likelihood algorithm.)

圖1 菌株L2與相近菌株16S rRNA基因構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig. 1 Phylogenetic tree of strain L2 based on 16S rRNA sequence by neighbour-joining method

2.3不同培養(yǎng)時間對菌株L2的生物量和抑菌活性的影響

菌株L2在培養(yǎng)48 h后，其生物量和胞外產(chǎn)物總蛋白量最高(見圖2)，培養(yǎng)72 h其生物量和胞外產(chǎn)物總蛋白量略有下降，但下降幅度不大，培養(yǎng)96 h后下降明顯。而菌株L2在培養(yǎng)24、48、72、96 h之后的胞外產(chǎn)物均具有抑菌活性，但在72 h時其抑菌活性最強。這表明菌株L2在培養(yǎng)48 h后，其生長進入穩(wěn)定期，且隨著胞外產(chǎn)物的逐步積累，在培養(yǎng)72 h時產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)活性最強。因此，我們在后續(xù)實驗中采用平板玻璃紙覆蓋法培養(yǎng)72 h的方法對菌株L2的抑菌物質(zhì)進行研究。

2.4 分步硫酸銨沉淀法對菌株L2胞外蛋白的初步純化與抑菌活性檢測

分步硫酸銨沉淀法可以初步將L2的胞外蛋白分離，分別得到了硫酸銨飽和度20%、20～40%、40～60%和60～80%的沉淀產(chǎn)物。經(jīng)低溫高速離心后，不同的硫酸銨飽和度均有蛋白析出，但各飽和度得到的蛋白量不同，且20%飽和度析出的蛋白為乳白色，其余3個飽和度析出的蛋白呈淺棕黃色。經(jīng)Bradford法測定蛋白濃度，其中飽和度為60%～80% 得到的蛋白量最小，40%～60%得到的蛋白量最大。抑菌活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了20%硫酸銨飽和度析出的蛋白未檢測到抑菌活性外，其它3個組分均有抑菌圈的產(chǎn)生，且40%～60%硫酸銨飽和度析出的蛋白抑菌活性最強，這可能與該組分的蛋白濃度最高有關(guān)(見表2)。由此可見，分步硫酸銨沉淀法可以初步對L2的胞外蛋白進行分離。為了獲得最大量有活性的胞外蛋白，采用飽和度為80%的硫酸銨沉淀法提取L2的胞外蛋白，進行下一步的實驗驗證。

表1 L2對不同指示菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of strain L2

Note:①Strain no；②Strain name；③Diameter of inhibition zone of L2；④Diameter of inhibition zone of AMP；⑤Diameter of inhibition zone of kan；⑥D(zhuǎn)iameter of inhibition zone of TET.

(a. 不同培養(yǎng)時間對生物量的影響；b，不同培養(yǎng)時間對抑菌活性的影響。a. effect of culture time on the biomass of strain L2; b. effect of culture time on the antibacterial activity of strain L2.)

圖2 不同培養(yǎng)時間對菌株L2生物量與抑菌活性的影響
Fig. 2 Effects of culture time on the biomass and antibacterial activity of strain L2

表2 不同硫酸銨飽和度沉淀的蛋白含量及抑菌活性Table 2 The concentrations and antibacterial activities of proteins after ammonium sulfate precipitation

Note:①Ammonium sulfate saturation；②Concentration of protein；③Volume；④ Diameter of inhibition zone

2.5 菌株L2胞外蛋白的膠內(nèi)抑菌活性檢測與活性蛋白的質(zhì)譜鑒定

菌株L2的胞外產(chǎn)物經(jīng)飽和度為80%的硫酸銨沉淀后，所得的沉淀可以顯著抑制鰻弧菌VIB72的生長，推測其抑菌活性物質(zhì)可能為大分子蛋白類物質(zhì)。粗提得到的菌株L2的胞外蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后進行膠內(nèi)活性檢測發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后的膠塊上出現(xiàn)明顯的透明圈(見圖3)，且經(jīng)過與染色后的膠條比對，其透明圈位置與膠條上約70 kDa的蛋白條帶位置相一致，表明該分子量約為70 kDa的蛋白具有抑菌活性。切下該蛋白條帶并經(jīng)質(zhì)譜鑒定、Mascot 2.3.01軟件進行數(shù)據(jù)搜索比對，該蛋白與金麗假交替單胞菌JG1分泌的抑菌蛋白PfaP相似性最高，為29.8%(見圖4)，推測L2所產(chǎn)生的抑菌蛋白可能與PfaP類似，同屬于L-氨基酸氧化酶[12]。

(M. 蛋白質(zhì)標準分子量(Fermentas, SM0431)；1. 胞外蛋白考馬斯亮藍染色；2. 胞外蛋白膠內(nèi)活性檢測。M. the molecular mass ladder (Fermentas SM0431); 1. the coomassive brilliant blue stained lane; 2. the non-stained lane placed on a MA plate containingV.anguillarum)

圖3 胞外蛋白的SDS-PAGE及膠內(nèi)抑菌活性檢測
Fig.3 SDS-PAGE and In-gel antibacterial assay for the ECP of strain L2

(紅色為一致的序列。Amino acid sequences sance as pfap are shown in red colour.)

圖4 菌株L2的抑菌活性蛋白與JG1分泌的PfaP的氨基酸序列比對
Fig.4 Amino acid sequence comparison between antibacterial protein of strain L2 and PfaP of JG1

3 討論

目前已發(fā)現(xiàn)許多褐桿菌屬細菌具有廣泛的抑菌活性，可以作為潛在的有益菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性病害的防治中。我們分離到的菌株L2可以抑制本實驗中的所有病原菌，且抑菌活性強于選用的3種抗生素，表明菌株L2具有作為有益菌進行應(yīng)用的潛能。經(jīng)16S rRNA基因序列分析，L2與抑菌褐桿菌(P.inhibens)DSM 16374T親緣關(guān)系最近，同屬于褐桿菌屬[13]。

褐桿菌屬于玫瑰桿菌類群，該類群在海洋浮游微生物群落中占有很大的優(yōu)勢，它們的數(shù)量約占某些海域整個浮游細菌群落的15～25%[14-15]，可以營自由生活或附著生活，并且能夠有效抑制弧菌的生長[16-17]，是重要的潛在水產(chǎn)有益菌。關(guān)于該類群菌株的抑菌活性物質(zhì)研究較多，它們可以分泌次級代謝物質(zhì)，如殺菌劑等[18]，能夠有效抑制魚幼體的致病菌[19]并對扇貝的幼蟲產(chǎn)生保護效果[20]。目前已知的玫瑰桿菌類群細菌分泌的具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物主要有tropodithietic acid (TDA)、靛青素 (Indigoidine)等[6, 21]，且絕大多數(shù)為吲哚、吲哚衍生物、環(huán)狀二肽和色胺酮等。抑菌褐桿菌DSM 17395作為玫瑰桿菌類群的模式菌，能夠產(chǎn)生具有強抑菌活性的物質(zhì)TDA[22]，但關(guān)于該菌是否可以產(chǎn)生其他抑菌活性物質(zhì)如抑菌蛋白等至今仍未見報道。我們分離到的菌株L2可以分泌具有抑菌活性的蛋白，且經(jīng)質(zhì)譜鑒定，其抑菌蛋白與JG1的抑菌蛋白PfaP的相似性最高，可能為一種L-氨基酸氧化酶。然而，實驗結(jié)果顯示菌株L2與JG1的抑菌譜有所差異，如菌株L2對金黃色葡萄球菌的抑制效果更強于菌株JG1。目前僅有少數(shù)報道對L-氨基酸氧化酶進行了成功的異源表達，如Geueke等利用變鉛青鏈霉菌成功獲得了有活性的重組L-氨基酸氧化酶[23]，Yang等在大腸桿菌BL21 (DE3)中成功表達了來自海兔子紫色墨汁中的L-氨基酸氧化酶，獲得的重組酶雖具有抑菌活性，但其活性遠低于野生型的L-氨基酸氧化酶[24]。

4 結(jié)語

我們分離到一株褐桿菌L2，根據(jù)其16S rRNA基因序列分析，菌株L2與抑菌褐桿菌(Phaeobacterinhibens)DSM 16374T親緣關(guān)系最近，且對多種病原菌具有廣泛的抑菌作用，確定了具有抑菌活性的蛋白條帶并進行了質(zhì)譜鑒定，其抑菌蛋白與金麗假交替單胞菌JG1分泌的抑菌蛋白的相似性較高，推測其為一種L-氨基酸氧化酶。在今后的研究中，我們將進一步分析菌株L2抑菌蛋白的序列，并選取合適的表達載體對該蛋白進行異源重組表達，探討其在細菌病害防治中的應(yīng)用價值。