Sibila M Pieters M Molitor T Maes D Haesebrouck F Segales J

陳善真1 曹仁祺2 饒 雷2 張居榮2 陳海輝2 林顯站2 王貴平*譯

（1廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東廣州 511400；2陽西縣豐沃生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，廣東陽江 529800）

豬支原體是豬地方性肺炎的主要病原，其他病原如巴氏桿菌、豬傳染性胸膜肺炎桿菌、豬鼻支原體、鏈球菌、副豬嗜血桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌、化膿隱秘桿菌也經(jīng)常繼發(fā)感染。該病的特征是高發(fā)病率和低死亡率，盡管各年齡段的豬群均易感，但地方性肺炎在小于6周齡的仔豬群中并不常見。肥育中期到屠宰期間的青年豬地方性肺炎的流行率特別高，而臨床癥狀的嚴(yán)重程度取決于豬支原體毒株、感染壓力、是否存在繼發(fā)感染和環(huán)境因素。當(dāng)肺炎支原體感染未伴有其他病原繼發(fā)感染時，地方性肺炎表現(xiàn)為亞臨床經(jīng)過，伴隨輕微的臨床癥狀包括慢性干咳、平均日增重減少和飼料轉(zhuǎn)化率降低；當(dāng)伴隨繼發(fā)感染時，臨床癥狀包括呼吸困難、發(fā)熱，偶爾出現(xiàn)死亡。

豬支原體密切參與了豬呼吸道綜合征的發(fā)病，該病是既有細(xì)菌（可能潛在參與了地方性肺炎的細(xì)菌）又有病毒（豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬2型圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、豬流感病毒和豬呼吸道冠狀病毒）參與的疾病。豬呼吸道綜合征通常影響14～20周齡的育肥豬，臨床主要表現(xiàn)為生長速度和飼料轉(zhuǎn)化率下降，同時伴有食欲減退、發(fā)燒、咳嗽和呼吸困難。該病在此階段豬群高度流行，所以也被稱為“18周齡墻”。

盡管通過改進(jìn)管理措施、合理地使用藥物和疫苗，很大程度上減輕了地方性肺炎對豬群健康和胴體品質(zhì)的不利影響，地方性肺炎對全世界養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失仍然不容忽視。這些損失主要?dú)w因于日增重降低、料肉比增高、藥物治療費(fèi)用增加，在一些案例中，死亡率也在增加。

充分了解豬肺炎支原體及其他相關(guān)病原的傳播途徑，對于控制該病、理解該病發(fā)病機(jī)制的影響因素是必要的。總結(jié)了在目前不同生產(chǎn)系統(tǒng)下豬支原體傳播和血清轉(zhuǎn)換動力學(xué)的知識，比較了監(jiān)測地方性肺炎的不同流行病學(xué)工具，同時討論了豬支原體肺炎毒株的不同毒力特征和目前檢測應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)。

1 評估豬支原體感染的流行病學(xué)和診斷學(xué)工具

調(diào)查和控制傳染性疾病取決于診斷方法的可利用性。下面介紹幾種監(jiān)測豬支原體感染常用的診斷方法。

1.1 臨床癥狀

地方性肺炎的主要臨床表現(xiàn)是逐漸出現(xiàn)慢性干咳，尤其是在生產(chǎn)周期的育肥豬階段。和如前所述的其他病原共感染后導(dǎo)致發(fā)熱、厭食和呼吸困難。雖然是逐漸出現(xiàn)的，但咳嗽反復(fù)發(fā)作，程度也因豬支原體的感染劑量不同有所差別。為了確認(rèn)豬是否干咳，對于豬群的觀察需要足夠的時間跨度，而且最好是趕豬運(yùn)動。在給定時間段內(nèi)確定咳嗽豬的頭數(shù)（“咳嗽評分系統(tǒng)”）已經(jīng)被用于豬肺炎支原體傳播和致病機(jī)制的研究，也被用于評估豬支原體疫苗對自然感染和實(shí)驗(yàn)條件下感染豬的免疫效果。然而，考慮到缺乏咳嗽的診斷特異性而且亞臨床感染的豬不會表現(xiàn)咳嗽癥狀，還需要配合使用其他診斷方法。

1.2 屠宰監(jiān)測

在屠宰檢查時，利用“肺部病變評分”系統(tǒng)評價豬群呼吸道疾病，是評估地方性肺炎發(fā)病率及其對胴體市場價格影響的常用方法。據(jù)估計(jì)，為了準(zhǔn)確測量1個豬場的肺炎發(fā)病率和嚴(yán)重程度，至少需要檢查30頭豬的肺臟。這種方法對于檢查在育肥階段影響生產(chǎn)的亞臨床疾病也很有幫助。然而，地方性肺炎病變并不是豬支原體感染所特有的，因?yàn)槠渌≡ū热缲i流感病毒）也能產(chǎn)生類似病變。

通過屠宰場監(jiān)測，回顧性分析地方性肺炎的發(fā)病率，這種方法的局限在于只能確認(rèn)生產(chǎn)階段后期的慢性肺臟病變，并不能提供關(guān)于育肥豬動態(tài)的呼吸系統(tǒng)健康信息。同樣，其他細(xì)菌感染，如傳染性胸膜肺炎，導(dǎo)致嚴(yán)重的胸膜炎而掩蓋了地方性肺炎的病變。病變消除可能造成檢測的假陰性結(jié)果，或者對早期支原體病得出1個模棱兩可的診斷結(jié)果。表1中總結(jié)了屠宰場監(jiān)測最常用的肺臟病變評分系統(tǒng)。視覺評估肺臟實(shí)變比例帶有主觀性以及損傷診斷缺乏特異性，限制了屠宰場監(jiān)測方法的應(yīng)用，因此需要其他驗(yàn)證方法。

表1 屠宰場監(jiān)測地方性肺炎所用評分系統(tǒng)匯總

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

通過細(xì)菌培養(yǎng)從感染肺臟中分離豬支原體，被認(rèn)為是診斷豬支原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是分離病原需要特殊的Friis培養(yǎng)基。S?rensen等比較了監(jiān)測豬支原體的幾種方法：細(xì)菌培養(yǎng)、免疫熒光（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和PCR，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)是最敏感的方法，特別是在地方性肺炎感染后期只有少量豬支原體存在的時候。然而，豬支原體培養(yǎng)是費(fèi)力費(fèi)時的（從臨床樣品中分離需要4～8周時間），而且培養(yǎng)基上經(jīng)常長滿豬鼻支原體或絮狀支原體。

1.4 豬支原體感染的血清學(xué)檢測

血清學(xué)試驗(yàn)經(jīng)常被用來監(jiān)測豬群健康狀況。豬支原體抗體的檢測可以通過ELISA，少數(shù)情況下使用補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。豬群的支原體抗體需要應(yīng)用ELISA方法對不同生長階段的豬群進(jìn)行同步檢測（橫向研究）或者對整個生產(chǎn)周期中的某一豬群進(jìn)行檢測（縱向研究）。在這種情況下，ELISA方法是一種快速、廉價且易于自動化的方法，在測定母源抗體和獲得性抗體水平、豬群血清轉(zhuǎn)陽所需時間方面，都提供了有用的信息。阻斷ELISA（IDEI，豬支原體EIA試劑盒，Oxoid）和兩個間接ELISA試驗(yàn)（Herdcheck，IDEXX和Tween 20-ELISA）是最常用的檢測豬支原體血清抗體的方法。對于這些試劑盒的特異性和敏感性，也有學(xué)者比較研究報(bào)道過。當(dāng)血清學(xué)檢測結(jié)果出現(xiàn)不一致時，針對不同豬支原體抗原的蛋白印跡分析（WBI）可被用作確證試驗(yàn)。支原體抗體的實(shí)用性受到下列5個因素干擾：ELISA結(jié)果的差異（取決于檢測所用的方法）；血清學(xué)檢測不能區(qū)分自然感染和疫苗接種抗體；不同測量方法的抗體滴度之間缺乏相關(guān)性；不同毒株豬支原體導(dǎo)致的抗體差異；豬群血清轉(zhuǎn)陽時間的顯著差異。

自然條件下豬支原體血清轉(zhuǎn)陽較實(shí)驗(yàn)條件下緩慢，不過豬經(jīng)氣管內(nèi)感染肺炎支原體后2～4周，可以檢測到抗體。S?rensen等報(bào)道，在經(jīng)空氣感染的豬群中，盡管一部分豬只最早在感染后8天就血清轉(zhuǎn)陽，但其他的豬群需要再經(jīng)過5周時間才會轉(zhuǎn)陽。在自然條件下，Morris等發(fā)現(xiàn)，豬群在接觸感染后3周，就出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)陽，抗體滴度在感染后11周達(dá)到高峰。在另外兩項(xiàng)田間試驗(yàn)中，血清轉(zhuǎn)陽主要發(fā)生在生長育肥豬單元（8～24周階段），在感染后6～9周時間。豬支原體感染后血清轉(zhuǎn)陽延遲，部分原因在于支原體吸附在呼吸道纖毛上皮細(xì)胞上，并不像其他病原那樣入侵到肺臟組織。這可能導(dǎo)致支原體抗原較緩慢地遞呈給宿主細(xì)胞。此外需要注意的是支原體抗體滴度和抗支原體感染的保護(hù)力無關(guān)。

1.5 豬支原體抗原的檢測

盡管免疫組化（IHC）和IFA試驗(yàn)?zāi)芴禺愋缘貦z測出肺組織切片或者涂片中豬支原體，但這些技術(shù)的缺點(diǎn)是診斷只能在動物死后進(jìn)行。而且，使用這些技術(shù)時只能檢測小塊的肺臟樣品，如果樣品中不含有呼吸道組織，這就增加了假陰性結(jié)果的風(fēng)險。另外，檢測的敏感性可能因?yàn)榻M織樣品處理不當(dāng)而大打折扣。如果多抗與其他的支原體緊密相關(guān)，這些檢測方法中使用的抗體質(zhì)量也可能限制了其特異性。

雖然通過IHC，利用特異性的單抗或多抗檢測福爾馬林固定、石蠟包埋的肺臟切片中的豬支原體，可以讓病理學(xué)家把支原體抗原的出現(xiàn)和地方性肺炎損傷關(guān)聯(lián)在一起，但這項(xiàng)技術(shù)由于靈敏度低，并不是實(shí)驗(yàn)室診斷的常規(guī)技術(shù)。直接和間接IFA已被用于定位豬肺臟中的支原體抗原。在致病機(jī)制和傳播研究的診斷中，也有人將IFA和PCR方法做了對比。當(dāng)動物體內(nèi)支原體載量較高時，IFA的陽性結(jié)果和地方性肺炎較急性感染階段相關(guān)；當(dāng)動物體內(nèi)支原體載量較低時，與該方法在其他慢性疾病中較低的靈敏度不同。IFA方法進(jìn)一步的局限性在于使用冰凍切片時，人工組織碎片可能遮蔽形態(tài)學(xué)特征。

2 分子診斷方法

2.1 原位雜交

原位雜交用來檢測和特異性定位經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的在自然和實(shí)驗(yàn)條件下感染的豬的肺臟組織中的支原體DNA。這項(xiàng)技術(shù)采用地高辛標(biāo)記的特異探針，靶基因是支原體基因組的重復(fù)序列。熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針定位的16S核糖體DNA序列，也被用來鑒定豬支原體、豬滑液支原體和豬鼻支原體的種特異性。原位雜交方法的缺點(diǎn)是需要動物死后的解剖樣本，而且此方法相對耗時，因此并不適用于快速診斷。

2.2 PCR

表2列出了用于檢測不同樣本中豬支原體DNA的PCR檢測方法。這些方法比細(xì)菌培養(yǎng)更迅速而且價格相對低廉。然而，PCR方法樣品污染也比較嚴(yán)重。考慮到支原體活的或死的DNA都可以擴(kuò)增，PCR確定的陽性豬群是否是活躍感染就是個問題。因?yàn)橹гw是吸附在氣管纖毛的上皮細(xì)胞上，用PCR檢測豬肺炎支原體最好的樣品是氣管-支氣管拭子或者支氣管肺泡灌洗液（BALF）。氣管-支氣管拭子和BALF同樣可以預(yù)測活體和死后實(shí)驗(yàn)性感染豬的感染狀況。利用PCR方法檢測肺組織的豬支原體已經(jīng)產(chǎn)生了差異較大的結(jié)論。Moorkamp等發(fā)現(xiàn)，在中等或嚴(yán)重的地方性肺炎病例中肺組織比BALF樣品更適合，而Kurth等發(fā)現(xiàn)在這種環(huán)境下檢測肺組織樣品是不可靠的。

表2 已報(bào)道的基于PCR檢測豬支原體的方法匯總

理想的情況下，一種檢測活體動物體內(nèi)病原的方法應(yīng)該具備操作簡便、快速且成本低廉的特點(diǎn)，而且能夠提供數(shù)據(jù)支持控制措施的實(shí)施。盡管在理論上利用PCR檢測活豬鼻腔內(nèi)的支原體符合上述標(biāo)準(zhǔn)，但研究表明，經(jīng)氣管內(nèi)進(jìn)行支原體攻毒感染的豬上呼吸道內(nèi)只有少量病原體存在，而且是間歇性地排毒。然而，采用PCR方法從鼻拭子中診斷自然感染被發(fā)現(xiàn)是可信的，而且鼻腔內(nèi)豬支原體的檢出和支氣管內(nèi)地方性肺炎造成的損傷是相關(guān)的。

盡管使用巢式PCR（n-PCR）檢測活體內(nèi)豬支原體的鼻拭子樣本的潛力已被報(bào)道，但目前來看這項(xiàng)技術(shù)更適合用于豬群而非動物個體水平上支原體的監(jiān)測。

利用PCR方法檢測豬支原體，為確定豬群何時感染提供了一種更加精確的方法，因?yàn)檠遛D(zhuǎn)化需要時間，而這個時間長短差別較大。

2.3 分子分型技術(shù)

地方性肺炎臨床發(fā)病過程的差異和支原體疫苗免疫效果的不一致，引起了人們對豬支原體分離株毒力不同的懷疑。

不同豬支原體分離株在抗原性、染色體組、基因組、蛋白質(zhì)組等水平上均存在差異。Vicca等最終揭示了這些分離株的不同毒力特征。豬支原體在吸附和傳播能力上的不同也被提及，但還沒有得到清晰的證明。

表3 對豬支原體田間毒株基因進(jìn)行分型的分子技術(shù)匯總

從流行病學(xué)角度看，對豬支原體分離株進(jìn)行分型有助于理解支原體在豬群內(nèi)和豬群間的傳播。表3列出了最近描述的分子分型技術(shù)，指出一種毒株可感染某一特定豬群，而參與不同支原體感染的毒株也不盡相同。

譯自：Sibila M,Pieters M,Molitor T,et al.Current perspectives on the diagnosis and epidemiology of Mycoplasma hyopneumoniae infection[J].Veterinary Journal,2009,181(3):221-231.