鄭曉風(fēng)，鄭曉琴，石 莉，劉英玉，姚 剛，張曉紅

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

沙門菌(Salmonella)是一種常見的食源性致病菌[1]，主要通過養(yǎng)殖場(chǎng)及周圍的環(huán)境、肉及肉制品加工、運(yùn)輸及儲(chǔ)存、銷售等環(huán)節(jié)污染畜禽產(chǎn)品，當(dāng)人誤食沙門菌污染的食品，可引起惡心、發(fā)熱、腹痛、腹瀉及菌血癥等癥狀，甚至死亡[2]。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國每年發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒事件中，由沙門菌引起的食物中毒約占40%[3]。歐美和日本等國家沙門菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的第2位[4]。

目前，國內(nèi)外常用的沙門菌檢測(cè)技術(shù)包括傳統(tǒng)方法(GB 4789.4-2016)[5]、免疫學(xué)方法[6]及分子生物學(xué)方法[7]，其中，基于傳統(tǒng)沙門菌分離和鑒定方法是國內(nèi)認(rèn)可的金標(biāo)準(zhǔn)[8]，沙門菌陽性菌結(jié)果推測(cè)到病原體進(jìn)一步鑒定約需6 d～7 d時(shí)間，雖檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但無法避免耗時(shí)耗力的缺點(diǎn)[9]?；诳乖贵w相結(jié)合產(chǎn)生特異性非放射性免疫反應(yīng)的方法，所需時(shí)間3 h～48 h即可完成樣品檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)勢(shì)[10]，但需要專業(yè)人員和設(shè)備完成多種類抗體的制備[11]。利用堿基配對(duì)原理的核酸探針雜交技術(shù)、快速擴(kuò)增目的基因?yàn)闄z測(cè)原理的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，具有高靈敏度、強(qiáng)特異性、結(jié)果清晰等優(yōu)勢(shì)[12]，但易在試驗(yàn)操作過程中造成污染，從而產(chǎn)生假陰性或假陽性的結(jié)果。

多年來，沙門菌的快檢技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)，如夏詩琪等建立一種同時(shí)聯(lián)檢5種典型沙門菌膠體金試紙條，成功檢出增菌16 h～20 h的沙門菌，最低檢測(cè)限為10 CFU/mL～100 CFU/mL[13]，具有操作過程簡(jiǎn)便、結(jié)果判定清晰等優(yōu)勢(shì)。但其檢測(cè)靈敏度仍有待提高。邴欣等設(shè)計(jì)了只需目測(cè)法結(jié)合光熱效應(yīng)溫差法，用于沙門菌的快速檢測(cè)試紙條，最低檢測(cè)限達(dá)到2.4×104CFU/mL和2.4×103CFU/mL。當(dāng)前已有的食品中沙門菌檢測(cè)方法通常大于16 h培養(yǎng)物的富集，結(jié)果的報(bào)告時(shí)間至少需要12 h[14]。研發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、便捷、低成本的實(shí)用檢測(cè)試紙，為畜產(chǎn)品生產(chǎn)和質(zhì)量安全控制一線的初步篩查及抽樣檢測(cè)提供一種“輕簡(jiǎn)”新技術(shù)，應(yīng)用于生產(chǎn)一線。因此，本試驗(yàn)擬采用姚剛團(tuán)隊(duì)研發(fā)的大腸埃希菌與沙門菌紙基微流控聯(lián)合檢測(cè)試紙(E.coli+S.en-μPADs)與市售食品沙門菌快速檢測(cè)試紙，用于檢測(cè)畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)沙門菌污染結(jié)果，從而完成E.coli+S.en-μPADs臨床應(yīng)用效果評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢樣品 從新疆庫爾勒市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上采集的牛肉、牛胴體拭子、牛肉刀具拭子、牛肉稱臺(tái)拭子、羊肉、羊胴體拭子、羊肉刀具拭子、豬胴體拭子、豬肉案板拭子、豬肉刀具拭子、豬肉稱臺(tái)拭子、驢胴體拭子、驢肉刀具拭子、雞肉案板拭子、雞肉刀具拭子，共計(jì)40份樣品。

1.1.2 菌株 標(biāo)準(zhǔn)腸炎沙門菌CVCC 3762菌株，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 β萘酚辛酸酯(β-naphthyl caprylate)，Apollo Scientific公司產(chǎn)品；營養(yǎng)肉湯生物試劑、營養(yǎng)瓊脂生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；無水乙醇分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；N，N-二甲基甲酰胺分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；乳糖分析純，天津永晟精細(xì)化工廠產(chǎn)品；綠洲市售食品沙門菌快速檢測(cè)試紙，達(dá)元綠洲生化公司產(chǎn)品；E.coli+S.en-μPADs，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院基礎(chǔ)教研室提供；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD博迅凈化工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；4℃ BCD-219D冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；PL203電子天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 新鮮牛羊肉樣品無菌采自從新疆庫爾勒市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上銷售的牛羊肉，迅速放入4℃運(yùn)輸箱保存，4 h內(nèi)返回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)。豬肉、驢肉、雞肉胴體表面拭子及加工用具拭子樣品從新疆庫爾勒市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上銷售的豬肉、驢肉、雞肉，用蘸有生理鹽水的棉簽無菌采集胴體、案板、刀具、稱臺(tái)表面，迅速放入裝有300 mL/L甘油肉湯保存。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 新鮮牛羊肉樣品處理 將采集的新鮮牛羊肉等按GB4789.4-2016[15]進(jìn)行樣品的前處理。無菌稱取25 g肉樣，放入盛有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶?jī)?nèi)，用手順時(shí)針搖勻樣品液時(shí)間持續(xù)1 min～2 min，制成1∶10的樣品勻液。根據(jù)試驗(yàn)需求，依次將樣品制成10倍遞增系列稀釋度的勻液。嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，每遞增稀釋樣液1次，需更換1次無菌吸管。密封錐形瓶放入36℃±1℃恒溫箱，培養(yǎng)15 h。

1.2.2.2 豬肉、驢肉、雞肉胴體表面拭子及加工用具拭子樣品處理 將采集的300 mL/L甘油肉湯的胴體表面及加工用具拭子液體倒入225 mL營養(yǎng)肉湯中，用手順時(shí)針搖勻樣品液時(shí)間持續(xù)1 min～2 min，制成1∶10的樣品勻液。密封錐形瓶放入36℃±1℃恒溫箱，培養(yǎng)15 h。

1.2.3E.coli+S.en-μPADs檢測(cè) 根據(jù)E.coli+S.en-μPADs使用步驟：取培養(yǎng)15 h后的樣品處理液1 mL，加入到盛有5 mL營養(yǎng)肉湯的離心管中，置于37 ℃恒溫?fù)u床上，以190 r/min的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)5 h。將富集5 h后的菌液直接滴加在E.coli+S.en-μPADs上，置于37℃溫箱1.5 h，在加有沙門菌底物端滴加顯色劑固藍(lán)b鹽，反應(yīng)完成后，將試紙顯色結(jié)果掃描，用ImageJ 1.4 u讀取E.coli+S.en-μPADs的灰度值。結(jié)果判定結(jié)合試紙顯色判定：若E.coli+S.en-μPADs的灰度值大于空白對(duì)照的灰度值，則表示檢出沙門菌；若E.coli+S.en-μPADs的灰度值小于或等于每組空白對(duì)照，則表示未檢出沙門菌。

1.2.4 綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙檢測(cè) 參照綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙片使用說明書，將沙門菌測(cè)試片置于無菌操作臺(tái)內(nèi)，揭開覆蓋薄膜，用無菌吸管或移液槍吸取1 mL的樣品勻液于無紡布棉墊上。待液體完全被無紡布棉墊吸收后，蓋上覆蓋薄膜，保證測(cè)試片邊緣不出現(xiàn)褶皺，蓋上覆蓋薄膜后輕輕按壓測(cè)試片邊緣，保證覆蓋薄膜粘帖牢固。每個(gè)稀釋度須接種2張測(cè)試片，同時(shí)做1片空白陰性對(duì)照。將加樣后的測(cè)試片正置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 h～24 h。培養(yǎng)后的測(cè)試片上沙門菌顯紫紅色，而其他菌群顯藍(lán)色。

1.2.5 符合率計(jì)算 陽性符合率=E.coli+S.en-μPADs檢出陽性樣品與綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙檢出陽性樣品相符合數(shù)/綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙檢出陽性樣品總數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉檢測(cè)結(jié)果

E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙具體檢測(cè)結(jié)果如表1所示。E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙?jiān)趯?duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉檢測(cè)結(jié)果對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)畜禽肉樣15份，E.coli+S.en-μPADs檢出10份大腸埃希菌和11份沙門菌，綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙檢出9份沙門菌，E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙二者的沙門菌陽性檢出符合率為100%。

表1 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉檢測(cè)結(jié)果

注：“+”表示檢出，“-”表示未檢出。

Note："+" indicates that a strain was detected, "-" indicates that a strain was not detected.

2.2 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉加工用具檢測(cè)結(jié)果

E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙具體檢測(cè)結(jié)果如表2所示。E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙?jiān)趯?duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉加工用具檢測(cè)結(jié)果對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)25份農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉加工用具，E.coli+S.en-μPADs檢出大腸埃希菌17份，沙門菌21份。綠洲食品沙門菌快速檢測(cè)試紙檢出沙門菌15份，二者沙門菌的陽性檢出符合率為93.3%。

3 討論

李小玲等建立的沙門菌內(nèi)標(biāo)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒，劉亞娟等[16]用夾心DNA雜交方法、王文彬等[17]發(fā)明金標(biāo)試紙傳感器等多種快檢食品中沙門菌方法，主要研究方法依靠血清學(xué)試驗(yàn)方法或者分子生物學(xué)方法結(jié)合傳統(tǒng)方法，需4 d～5 d才能得出完整的檢測(cè)報(bào)告。除此之外，試驗(yàn)所需的血清學(xué)試驗(yàn)和分子生物學(xué)中相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀器都集中在大城市中的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，無法實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)一線病原菌的即時(shí)檢測(cè)。國內(nèi)外科研工作者所研究的熱門領(lǐng)域轉(zhuǎn)向全自動(dòng)生物分析檢測(cè)系統(tǒng)，問世的有Vitek系統(tǒng)、Biolog系統(tǒng)、Soleris系統(tǒng)、焦磷酸測(cè)序技術(shù)等，具有實(shí)時(shí)性、準(zhǔn)確性、樣品量大等優(yōu)勢(shì)，但無法擺脫專業(yè)儀器和技術(shù)人員的依賴。因此，迫切需要“輕簡(jiǎn)技術(shù)”來實(shí)現(xiàn)快速“篩查”、“抽檢”的需要，從而能實(shí)現(xiàn)沙門菌的有效和準(zhǔn)確檢測(cè)。

通過比較E.coli+S.en-μPADs與商品化的食品沙門菌快速檢測(cè)試紙?jiān)谛笄萑馍a(chǎn)一線應(yīng)用效果顯示，兩種快檢試紙均可初步檢出食品中沙門菌的存在。從對(duì)樣品檢測(cè)周期上分析可知，商品化快檢試紙無需經(jīng)歷樣品前增菌培養(yǎng)，需15 h～24 h即可鑒定結(jié)果，E.coli+S.en-μPADs要求15 h初增菌，5 h增菌培養(yǎng)，1.5 h的顯色培養(yǎng)，但樣品的檢測(cè)時(shí)間只有21.5 h，較商品化快檢試紙縮短2.5 h。目前市售食品沙門菌快速檢測(cè)試紙價(jià)格為9元/片～45元/片，而E.coli+S.en-μPADs價(jià)格約1元/片。在完成樣品檢測(cè)時(shí)，需在市售食品沙門菌快速檢測(cè)試紙滴加液體1 mL，E.coli+S.en-μPADs僅需滴加液體90 μL，且顯色結(jié)果穩(wěn)定。

由于E.coli+S.en-μPADs與市售食品沙門菌快速檢測(cè)試紙比較而言，在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉檢測(cè)中陽性符合率較高，達(dá)到100%，但在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉加工用具陽性檢測(cè)符合率為93.3%，其主要原因可能在于畜禽肉加工用具中含菌量低，E.coli+S.en-μPADs不能檢測(cè)出，仍需要對(duì)E.coli+S.en-μPADs的靈敏度進(jìn)一步研究改進(jìn)。

表2 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜禽肉加工用具檢測(cè)結(jié)果

注：“+”表示檢出，“-”表示未檢出。

Note：“+” indicates that a strain was detected,“-” indicates that a strain was not detected.

與市售食品沙門菌快速檢測(cè)試紙檢測(cè)方法相比，E.coli+S.en-μPADs從增菌培養(yǎng)到報(bào)告結(jié)果時(shí)間短，節(jié)省樣品液消耗，僅需90 μL待檢樣品液即可呈現(xiàn)肉眼可見的顯色反應(yīng)。但與食品沙門菌快速檢測(cè)試紙相比，在檢測(cè)靈敏度方面尚需進(jìn)一步改進(jìn)提高。