張陽，閆鶴

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aurues，S. aureus)是一種常見的人畜共患病病原菌，能夠引發(fā)人和動物的局部性化膿感染、肺炎和敗血癥等疾病[1]，可以在不同動物宿主間傳播，具有廣泛的宿主適應性[2～4]。據(jù)中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒2013～2015報告，在2011～2014年內，我國共發(fā)生1244起由食源性病原微生物引起的爆發(fā)性食物中毒事件，共導致27479人患病，其中由S.aureus引發(fā)的患病人數(shù)為3269，占比11.9%[5]。該菌是污染豬肉產(chǎn)品引發(fā)細菌性食物中毒的主要食源性致病菌之一[6]，S. aureus通過生豬養(yǎng)殖場環(huán)境傳播至人或污染豬肉產(chǎn)品，無疑會給食品安全和人的健康帶來潛在威脅。S. aureus的致病性主要源于其分泌的多種致病因子，這些致病因子包括溶血素、殺白細胞素、脫皮毒素和腸毒素等多種外毒素以及血漿凝固酶和耐熱核酸酶等葡萄球菌酶[7]。

凝固酶是S. aureus的一種重要致病因子，能否產(chǎn)生有活性的凝固酶是凝固酶陽性S. aureus與凝固酶陰性葡萄球菌的重要差異之一[8]。導致不同動物血漿凝固的致病因子為S. aureus中clfA基因編碼的凝聚因子A（ClfA）、coa基因編碼的凝固酶(Coa)、vwb基因編碼的血管性血友病因子結合蛋白(vWbp)，其中Coa和vWbp起主要作用[9]。ClfA在抑制S. aureus被宿主免疫細胞吞噬和侵入宿主中起到重要作用[9]。

Coa屬于游離凝固酶，僅通過與凝血酶原結合形成葡萄球菌凝血酶復合物，通過位阻作用改變凝血酶原的空間結構從而發(fā)揮凝血酶的作用[10]；而vWbp被稱為結合凝固酶，vWbp介導的動物血漿凝固是S.aureus致病性的重要體現(xiàn)之一，vWbp能以非蛋白水解的方式活化凝血酶原，改變人類血液的凝血級聯(lián)反應，從而產(chǎn)生大量不可調控的纖維蛋白聚合體，將S.aureus和血小板形成S. aureus微血栓，從而增加S.aureus在血管中的粘附[11]。

Coa是最早發(fā)現(xiàn)于S. aureus中的毒力因子之一，早在1985年就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Coa的氨基酸序列及其基因coa的核酸序列，coa基因分布于所有凝固酶陽性的S. aureus基因組中[12]；直到 2002年，vWbp才被Bjerketorp發(fā)現(xiàn)[13]。vWbp共分為兩種，一種是由染色體vwbC編碼的vWbpC(Chromosomal-encodedvWbp)，另一種是由致病島vwbS編碼的 vWbpS(SaPI-encodedvWbp)。染色體vwbC基因存在于所有的S. aureus中，其編碼的vWbp能使兔血漿凝固而不能使牛血漿和羊血漿凝固，對不同動物宿主血漿凝固適應性較差[14]；而致病島vwbS基因目前在分布于牛源、馬源和羊源S. aureus中，其編碼的vWbp具有特異性N末端區(qū)域，不僅能使兔血漿凝固同時可以使牛血漿、羊血漿、馬血漿凝固，對不同動物宿主血漿凝固適應性較強[14]。

目前已知的vwbS基因有 SaPIbov4中的vwbSbo4(GenBank Accession No： HM211303)、SaPIbov5中的vwbSbo5(GenBank Accession No： HM228919)、SaPIov2 中vwbSov2(GenBank Accession No： CP001996)和 SaPIeq1 中的vwbSeq1(GenBank Accession No：HM228920)，其中vwbSbo4和vwbSbo5的具有相同的基因序列，在SaPIbov4和SaPIbov5中方向相反，且均來源于牛源S. aureus[14]。關于vwbS基因及其所在的致病島、基因功能等信息見表1[14]。

表1 葡萄球菌凝固酶vwb基因的分布、來源及功能[14]Table 1 The distribution, origin and function of staphylococcal coagulase vwbgenes[14]

不同動物宿主分離的S. aureus基因組有明顯的差異，表明在不同來源的S. aureus基因組中存在特定宿主適應性基因[4,14]。Sung等[15]研究表明S. aureus宿主適應性基因通常位于可移動元件(mobile genetic elements，MGEs)上，細菌可以通過獲得或缺失一個或多個MGEs從而獲得不同的宿主適應能力。近年來關于MGEs在細菌耐藥基因和毒力基因傳播中的重要作用已有較深入的研究[16～19]，但MGEs在細菌對不同動物宿主適應性和致病性方面的研究較少，S. aureus致病島(Staphylococcal Pathogenic Islands，SaPIs)是一種重要的MGEs，SaPIs中vwbS基因編碼的vWbp使不同動物血漿凝固是S. aureus對不同動物宿主適應性和致病作用的重要體現(xiàn)之一[14]。

豬肉在世界肉類食品中銷量最大，且一直保持增長勢頭。我國是生豬養(yǎng)殖大國，生豬出欄量和豬肉產(chǎn)量基本占到世界總量的 50%[20]，但目前國內關于S.aureus對不同動物宿主凝血致病性以及致病島vwbS凝固酶基因分布的研究較少，因此全面調研生豬養(yǎng)殖及生鮮豬肉食品分離的S. aureus對不同動物宿主凝血致病性以及攜帶vwbS凝固酶基因的狀況對豬肉食品安全和人類健康具有重要意義。

廈門是我國生豬養(yǎng)殖區(qū)域之一，該地區(qū)飼養(yǎng)的生豬是福建省豬肉食品的主要來源之一，本研究以廈門地區(qū)生豬養(yǎng)殖場、屠宰場及生鮮豬肉來源的S. aureus為研究對象，采用血漿凝固酶實驗研究豬源S. aureus對兔、牛、羊血漿的凝固活性，探究豬源S. aureus是否具有對不同動物宿主的凝血致病能力，同時結合PCR方法研究豬源S. aureus是否攜帶S. aureus凝固酶vwbC、vwbSbo4、vwbSov2和vwbSeq1基因，初步了解這4種基因在生豬養(yǎng)殖場環(huán)境及生鮮豬肉中S. aureus的分布狀況，研究為廈門地區(qū)生豬養(yǎng)殖場、屠宰場及生鮮豬肉來源的S. aureus對不同動物宿主的凝血致病作用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實驗菌株為本實驗室保存。自2014年9月至12月，在廈門某大型生豬養(yǎng)殖場、屠宰車間、超市和農(nóng)貿(mào)市場共采集的501份樣品中分離檢出的130株野生型S. aureus，樣本來源及菌株分離率狀況如表2所示。實驗菌株已根據(jù)GB 4789.10-2016S. aureus檢驗標準內容鑒定為S. aureus，且每份樣品僅挑選1個單菌落進行S. aureus判定，以避免同一樣品分離出多株相同克隆株。

此外，通過PCR方法驗證實驗菌株均攜帶凝固酶coa基因。所有實驗菌株已完成MLST分型實驗，不同來源菌株的ST型別分布情況見表3。實驗所用質控菌株為S. aureusATCC29213和S. aureusRN4220。

表2 不同樣品中S. aureus的分離情況Table 2 Isolation of S. aureus isolates from different pork productions

表3 不同樣品中S. aureus的ST型別分布Table 3 Distribution of ST types among S. aureus isolates from different pork productions

1.2 儀器與設備

Gene Amp PCR system 2700，美國 Applied Biosystems公司；GelDocEQ凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；核酸電泳儀，美國BIO-RAD公司；高速離心機，美國Thermo公司；恒溫培養(yǎng)箱，德國Binder公司；恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基和主要試劑

腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion Broth，BHI），廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒，北京博邁德生物技術有限公司；TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）、dNTPs、2000 bp DNAmarker、瓊脂糖，日本TaKaRa公司；兔血漿、牛血漿、羊血漿，廣州鴻泉生物科技有限公司；溶菌酶，德國Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株的活化及DNA的提取

將保存于實驗室-80 ℃冰箱的菌株劃線接種至BHI瓊脂平板，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，然后挑取單菌落至BHI肉湯中，37 ℃培養(yǎng)10～16 h。S.aureus的DNA提取按照細菌基因組DNA快速提取試劑盒說明書進行。

1.4.2 血漿凝固酶實驗

分別取0.5 mL新鮮兔血漿、牛血漿和羊血漿分裝于無菌試管中，再各加入含1×108CFU/mL待檢菌株肉湯過夜培養(yǎng)物0.2 mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內，每隔30 min觀察一次并記錄實驗結果，連續(xù)觀察6 h。評定結果：如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結果。S. aureusATCC29213和S. aureusRN4220分別作為陽性和陰性對照。

1.4.3 血管性血友病因子結合蛋白基因vwb的擴增及引物的合成

為驗證實驗菌株是否攜帶S. aureus凝固酶vwbC、vwbSbo4、vwbSov2和vwbSeq1基因，所有菌株進行這4種vwb基因的PCR擴增，PCR陽性產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，將測序結果在www.ncbi.nlm.Nih.gov 網(wǎng)站對測得的序列進行分析，應用Standard Nucleotide BLAST對獲得的基因序列進行同源性檢索。引物均由上海生工生物股份有限公司合成。引物序列及片段長度如表4所示。

表4 vwb基因引物序列與PCR擴增產(chǎn)物大小Table 4 The information of vwb and its primer sequence and size of the amplification product by PCR

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用spss 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料用χ2檢驗，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 血漿凝固酶實驗結果

2.1.1S. aureus對不同動物血漿的陽性凝血率

不同來源的S. aureus對兔血漿、牛血漿和羊血漿的血漿凝固酶實驗結果見表5。

130株S. aureus對兔血漿、牛血漿和羊血漿的陽性凝血率分別為100.00%、28.46%和28.46%。不同來源的S. aureus對3種不同動物血漿的陽性凝血率不同。生豬養(yǎng)殖場分離株對3種血漿的陽性凝血率最高，均為100.00%；屠宰場和終端市場分離的S. aureus對兔血漿的陽性凝血率為100.00%，但對牛血漿和羊血漿的陽性凝血率均較低，屠宰車間分離株對牛血漿和羊血漿的陽性凝血率均為11.29%，終端市場分離株對牛血漿和羊血漿的陽性凝血率均為2.56%。

表5 130株S. aureus血漿凝固酶實驗結果Table 5 The result of coagulase test with 130 S. aureus isolates from different pork production

2.1.2 不同動物血漿的菌株凝血速率

本研究中不同來源的S. aureus對兔血漿、牛血漿和羊血漿的凝血速率存在差異，S. aureus對兔血漿的凝血速率快于對牛血漿和羊血漿的凝血速率。130株S. aureus對兔血漿的陽性凝血率為100.00%，且在0.5 h內使兔血漿達到完全凝固。實驗菌株對牛血漿和羊血漿凝固酶速率實驗結果如表6和表7所示，生豬養(yǎng)殖場中豬鼻拭紙和養(yǎng)殖環(huán)境分離的S. aureus均可使牛血漿和羊血漿在1 h內完全凝固，而屠宰車間和終端市場生鮮豬肉分離的S. aureus中分別只有6株和1株S. aureus可以使牛血漿和羊血漿在1 h內完全凝固。此外，屠宰場生鮮豬肉分離株中有1株S. aureus可以同時使牛血漿和羊血漿在4 h內完全凝固。通過分析不同來源的S. aureus對兔血漿、牛血漿和羊血漿凝血速率實驗結果發(fā)現(xiàn)，生豬養(yǎng)殖場分離株對3種血漿的凝血速率快于屠宰場和終端市場分離株。

表6 130株S. aureus牛血漿凝固酶速率實驗結果Table 6 The result of bovine plasma coagulase test with 130 S. aureus isolates from different pork production

表7 130株S. aureus羊血漿凝固酶速率實驗結果Table 7 The result of caprine plasma coagulase test with 130 S. aureus isolates from different pork production

2.2 S. aureus中致病島凝固酶基因vwbSbo4和vwbSov2的分布情況

130株實驗菌株中vwbC、vwbSbo4、vwbSov2和vwbSeq1基因的擴增結果見圖1。由圖1可知，除vwbSeq1基因在實驗菌株中未檢出外，S. aureus凝固酶vwbC、vwbSbo4、vwbSov2基因均擴增出相應目標條帶，且與GeneBank中對應目的基因的同源性為99%。

圖1 vwbC、vwbSbo4、vwbSov2和vwbSeq1基因PCR擴增結果Fig.1 The amplification results of vwbC, vwbSbo4, vwbSov2 andvwbSeq1genes by PCR

根據(jù)PCR的檢測結果，130株S. aureus中vwbC、vwbSbo4和vwbSov2凝固酶基因的檢出率分別為100.00%，26.92%和29.23%，結果見表8。不同樣本來源的S. aureus中均以vwbC基因的檢出率最高，達100.00%，說明vwbC基因存在于所有的S. aureus染色體基因組中，與David Viana等的研究結論一致[14]。本研究中vwbSbo4、vwbSov2、vwbSeq1基因的檢出率明顯比vwbC基因的檢出率低，其中vwbSbo4檢出率為26.92%，高于 David Viana研究中vwbSbo4的檢出率18.42%；vwbSov2檢出率為29.23%，高于David Viana研究中vwbSov2的檢出率 23.68%，但值得注意的是David Viana研究中vwbSbo4和vwbSov2基因全部分布在牛、羊和馬源的金葡菌中，在豬源S. aureus中并未檢出[14]，而本研究中vwbSbo4和vwbSov2基因全部分布于豬源S. aureus中。此外，Caitriona M等對牛和羊乳腺炎來源的29株S. aureus研究發(fā)現(xiàn)有37.93%（11/29）的菌株攜帶有vwbSov2基因[4]，高于本研究豬株S.aureus中vwbSov2的檢出率29.23%。目前國內對vwbSbo4和vwbSov2基因流行情況的研究相對較少，2016年Yan等利用全基因組測序技術對中國哈爾濱健康生豬分離的3株S. aureus進行基因結構分析中，發(fā)現(xiàn)3株S.aureus全部攜帶有vwbSbo4基因[21]。不同來源S. aureus中vwbSbo4和vwbSov2基因的檢出率有所不同，這可能與實驗菌株數(shù)量或采樣地點、國家等因素有關。

不同來源的S. aureus中vwbSbo4和vwbSov2基因的攜帶率不同，并且存在一定的差異。生豬養(yǎng)殖場中豬鼻拭紙樣品和環(huán)境樣品分離S. aureus中vwbSbo4具有相同的檢出率，均為95.45%；vwbSov2在豬鼻拭紙樣品和環(huán)境樣品分離S. aureus中的檢出率也相同，均為85.71%。屠宰場生鮮豬肉樣品分離S. aureus中vwbSbo4和vwbSov2的檢出率分別為11.29%和12.90%，終端市場生鮮豬肉樣品分離S. aureus中vwbSbo4和vwbSov2的檢出率分別為2.56%和7.69%。實驗結果表明S. aureus致病島凝固酶基因vwbSbo4和vwbSov2在生豬養(yǎng)殖場分離S. aureus中的檢出率明顯高于在屠宰場和終端市場分離S. aureus的檢出率，且差異具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。

從總的分布規(guī)律來看，菌株同時攜帶有vwbSbo4和vwbSov2基因的幾率較高，在生豬養(yǎng)殖場中，95.45%（21/22）的豬鼻拭紙樣品分離株和 85.71%(6/7)環(huán)境樣品分離株同時被檢測出vwbSbo4和vwbSov2；在屠宰場和終端市場生鮮豬肉樣品分離株中分別有 6株S.aureus和1株S. aureus同時攜帶vwbSbo4和vwbSov2基因，結果表明生豬養(yǎng)殖場分離的S. aureus同時攜帶vwbSbo4和vwbSov2的比率高于生鮮豬肉樣品分離的S.aureus，說明生豬養(yǎng)殖場中S. aureus更易捕獲致病島凝固酶vwbSbo4和vwbSov2基因，可能是由于活豬或養(yǎng)殖環(huán)境作為S. aureus的傳播媒介更容易被定殖或感染多種來源的S. aureus。

表8 130株S.aureus中不同類型vwb基因的檢出率Table 8 Detection of different kinds of vwb genes in 130 S. aureus isolates from different pork production

2.3 血漿凝固酶實驗與 vwb基因檢測結果對比分析

從兔血漿凝固酶實驗表型和相應的凝固酶基因檢測結果分析，130株豬源S. aureus均能使兔血漿在0.5 h內凝固，且實驗菌株均攜帶凝固酶vwbC和coa基因，說明所有實驗菌株的兔血漿凝固酶表型與其所攜帶的凝固酶基因表達結果保持一致。

從牛和羊血漿凝固酶實驗表型與相應的凝固酶基因檢測結果分析，130株S. aureus中，54.62%(71/130)的S. aureus對這兩種血漿的凝固酶表型均為陰性，且不含vwbSbo4和vwbSov2基因，說明本研究中牛血漿和羊血漿凝固酶表型與所攜帶的vwbSbo4和vwbSov2基因結果一致。在牛和羊血漿凝固酶陽性表型和相應的凝固酶vwbSbo4和vwbSov2基因陽性菌株中，26.92%(35/130)的S. aureus（尤其是生豬養(yǎng)殖場分離株）同時攜帶有vwbSbo4和vwbSov2基因，且可以使牛血漿和羊血漿在1 h內完全凝固，這一結果表明可能是vwbSbo4和vwbSov2兩種基因協(xié)同作用促使S. aureus對牛血漿和山血漿具有較快的凝血速率；在屠宰場生鮮豬肉分離株中有 1株攜帶vwbSbo4基因的S. aureus可以使牛血漿和羊血漿在4 h內凝固，而3株攜帶vwbSov2基因的S. aureus不能使牛血漿和羊血漿在實驗觀察6 h內凝固，說明vwbSbo4基因的凝血致病作用比vwbSov2基因的凝血致病作用強。此外，實驗發(fā)現(xiàn)在生豬養(yǎng)殖場環(huán)境樣分離的S. aureus中有1株不攜帶有vwbSbo4和vwbSov2基因，但能使牛血漿和羊血漿在1 h內凝固，說明在S. aureus中可能存在其他機制導致牛血漿和羊血漿凝固，這一現(xiàn)象需要進一步深入研究。

3 結論

3.1 本實驗首次檢測到豬肉生產(chǎn)鏈中生豬養(yǎng)殖場、屠宰場和終端市場三個環(huán)節(jié)分離的S. aureus對兔血漿、牛血漿和羊血漿具有凝血致病作用，同時通過PCR擴增檢測到vwbC，vwbSbo4和vwbSov23種S. aureus凝固酶基因，說明豬源S. aureus對不同動物宿主具有適應性和凝血致病作用。

3.2S. aureus凝固酶vwbC基因的檢出率最高，vwbSeq1基因未檢出，vwbSbo4和vwbSov2的檢出率在生豬養(yǎng)殖場豬鼻拭紙和養(yǎng)殖環(huán)境分離的S. aureus明顯高于屠宰場和終端市場生鮮豬肉分離的S. aureus。

3.3 所有菌株對兔血漿凝固酶實驗表型為陽性，且均在0.5 h內凝固，對牛血漿和羊血漿凝固酶實驗表型多樣，生豬養(yǎng)殖場中豬鼻拭紙和養(yǎng)殖環(huán)境分離S. aureus對牛血漿和羊血漿的陽性凝血率和速率快于屠宰場和終端市場生鮮豬肉分離S. aureus。

3.4 通過血漿凝固酶實驗和vwb基因檢測結果對比分析發(fā)現(xiàn)：S. aureus同時攜帶有vwbSbo4和vwbSov2基因對牛血漿和羊血漿的凝血速率比只攜帶vwbSbo4或vwbSov2基因對牛血漿和羊血漿的凝血速率快，這一現(xiàn)象可能是vwbSbo4和vwbSov2兩種基因協(xié)同作用的結果；存在1株S. aureus不攜帶vwbSbo4和vwbSov2基因，但可以使牛血漿和羊血漿在1 h內完全凝固，可能是S.aureus中可能存在其他機制導致牛血漿和羊血漿凝固，這一現(xiàn)象需要進一步實驗研究。