夏晚霞，張尚微，葛亞中，任杰，余慶濤，楊繼國(guó),，寧正祥

（1.華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東東莞 523808）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（3.無限極（中國(guó)）有限公司，廣東廣州 510640）

人參（PanaxginsengC. A. Mey）為五加科多年生植物人參的根，是傳統(tǒng)名貴中藥，人參皂苷(ginsenoside，GS)是人參生理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是人參成分中最有效的藥用成分，其中含量較少的稀有人參皂苷(rare ginsenosides)具有極高的藥用價(jià)值和應(yīng)用前景[1,2]。例如，稀有人參皂苷Compound K (CK)在抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病、抗血栓形成、抗老化和保肝等方面具有很好的作用[3,4]；Rg3最初從紅參中分離得到[5]，它主要作用于細(xì)胞增殖周期的G2/M 期，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，選擇性抑制腫瘤細(xì)胞黏附和浸潤(rùn)，抑制腫瘤新生血管的形成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。但這些稀有皂苷天然含量極低，如Rg3在白參中的含量?jī)H為0.0003%，在紅參中的含量約為0.03%，因此從人參中直接提取這些稀有皂苷較為困難[6]。為了獲得大量人參皂苷，尤其是生理活性較強(qiáng)的稀有皂苷，國(guó)內(nèi)外學(xué)者展開了一系列的研究和探索，稀有人參皂苷能夠從人參中含量較高的Rb1、Rb2、Rc和Rd等主皂苷(major ginsenosides)轉(zhuǎn)化得到[7]。

乳酸菌是公認(rèn)的人體益生菌，具有安全性高，生長(zhǎng)速度快，代謝機(jī)制較明確，副產(chǎn)物少等特點(diǎn)，常用于制造酸奶、乳酪、啤酒、泡菜和其他發(fā)酵食品；在生物工程、工農(nóng)業(yè)和食品加工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[8]。大量研究表明，乳酸菌能夠調(diào)節(jié)胃腸道正常菌群，從而改善胃腸道功能；控制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)；提高食物消化率和生物效價(jià)；降低血液中的膽固醇含量，對(duì)冠心病和腦血管疾病具有很好的療效[9]。并且，另有研究表明，乳酸菌能夠產(chǎn)胞外β-葡萄糖苷酶，該酶能夠水解多種β-葡萄糖苷[10]。對(duì)比人參皂苷分子結(jié)構(gòu)，由于所連接的糖苷配基不同，會(huì)有多種單體人參皂苷。利用β-葡萄糖苷酶水解人參皂苷的葡萄糖苷，從而產(chǎn)生活性更高、藥效更強(qiáng)的稀有皂苷已成為人參研究的熱點(diǎn)問題。研究表明，發(fā)酵方法可以改變?nèi)藚⒃碥盏奶擎溄Y(jié)構(gòu)，促使其向稀有皂苷轉(zhuǎn)化，從而改變?nèi)藚⒅性碥蘸拖∮性碥盏暮?，增?qiáng)人參的藥理活性，促進(jìn)腸道吸收[11～13]。

因此，本研究選取5種乳酸菌對(duì)人參提取物進(jìn)行發(fā)酵，通過定向生物轉(zhuǎn)化將部分人參皂苷轉(zhuǎn)化成稀有皂苷，使發(fā)酵后的人參提取物中稀有皂苷的含量提高，同時(shí)研究發(fā)酵條件對(duì)轉(zhuǎn)化生成稀有皂苷含量的影響，并確定最適宜的發(fā)酵條件，為開發(fā)各種人參深加工產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參提取物（粉），無限極有限公司提供；濃縮蘋果汁，秦安長(zhǎng)城果汁飲料有限公司；干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，廣東省微生物菌種保藏中心；色譜純乙腈、磷酸、甲酸、分析純正丁醇購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；Thermo U3000高效液相色譜儀；Agilent HPLC-6500 Q-TOF飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人參提取物的乳酸菌發(fā)酵

利用5種乳酸菌分別對(duì)人參提取物進(jìn)行發(fā)酵，以濃縮蘋果汁為糖源，初始發(fā)酵液中含人參提取物和濃縮蘋果汁分別為 15%和 10%（m/m），初始總糖量為5%（m/m）。于60 ℃下，消毒45 min，冷卻后以1%的接種量加入培養(yǎng)好的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，混合均勻后封口于35 ℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵10 d。

1.2.2 人參皂苷LC-MS定性分析

樣品制備：取等量5種乳酸菌發(fā)酵液混合后冷凍干燥，得粉末狀樣品，精密稱取粉末1.0022 g，以料液比為1：20 mL，加入超純水20 mL于50 mL錐形瓶。以超聲頻率100 Hz，室溫超聲30 min，并補(bǔ)足損失水的體積。靜置濾紙過濾，濾液用水飽和正丁醇萃取 3次，合并上層液，在45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干，加甲醇5 mL溶解。以備分析用。

樣品分析：色譜分離采用島津Intestinal ODS-SP C18 column (4.6×250 mm，5 μm)，梯度洗脫條件如下：流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，B為乙腈，梯度洗脫條件如下：0～25 min，19%～20% B；25～60 min，20%～40% B；60～70 min，40%～100% B。流速：1 mL/min，波長(zhǎng)：203 nm，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。質(zhì)譜條件：MS-Q-TOF檢測(cè)器；干燥氣（N2）流速，8 L/min；干燥氣溫度，320 ℃；霧化器壓力，35 psig；毛細(xì)管電壓，3500 V；OCT RFV，750 V；碎片電壓，100 V。用負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，離子掃描范圍為m/z60～1500。數(shù)據(jù)采集及處理分別采用 Agilent Mass Hunter Acquisition Software Version B.05.00和Mass Hunter Workstation Software Version B.05.00軟件(Agilent科技有限公司)。

1.2.3 人參皂苷HPLC定量分析

樣品制備：取10 mL發(fā)酵液置于分液漏斗中，向其中加入100 mL的乙醚脫脂，分三次進(jìn)行。然后取100 mL水飽和正丁醇萃取發(fā)酵液中的皂苷，分三次進(jìn)行。最后，將三次萃取液收集，45 ℃減壓蒸發(fā)至干，用3 mL甲醇溶解，備用。

樣品分析：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%磷酸水(B)，按表1梯度洗脫，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫方法Table 1 Gradient elution method

標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定：分別精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rd、Rg3、F2、CK、Rh1 標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇配制成各單體皂苷濃度為1 mg/mL的混合溶液，將該混合液稀釋成 50、100、200、400、800、1000 μg/mL六個(gè)濃度，以峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取200 μg/mL對(duì)照品混合溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各峰面積RSD。取200 μg/mL對(duì)照品混合溶液在0、2、4、8、16、24 h分別進(jìn)樣，計(jì)算各峰面積RSD。

1.2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)探究發(fā)酵時(shí)間、初始pH、接種量和底物濃度對(duì)乳酸菌發(fā)酵人參提取物生成稀有皂苷的影響。發(fā)酵時(shí)間為28 d，取樣時(shí)間0 d、1 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d和28 d；接種量采用1%、5%、10%和15% 4個(gè)水平，初始pH按4.0、5.0、6.0、7.0和8.0設(shè)置，底物濃度采用5%、10%、15%和20% 4個(gè)水平。其他發(fā)酵條件同1.2.1，以發(fā)酵液中生成稀有皂苷的含量為篩選指標(biāo)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5和SPSS 19.0對(duì)本文數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，每組重復(fù) 3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用單因素分析和Tukey’s HSD法進(jìn)行多重比較，顯著水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參皂苷的LC-MS檢測(cè)

人參提取物發(fā)酵液中皂苷 LC-MS檢測(cè)的離子流圖如圖 1。根據(jù)保留時(shí)間、質(zhì)譜峰、精確的分子離子峰的質(zhì)荷比等信息解析得出A和B各自峰形對(duì)應(yīng)的物質(zhì)，見表2。

由圖1和表2分析表明，發(fā)酵液中檢測(cè)到38個(gè)人參皂苷的峰，其中有6個(gè)同分異構(gòu)體，同時(shí)，在發(fā)酵液中檢測(cè)到稀有皂苷F2、Rg3、和CK。結(jié)果表明人參提取物經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后含有多種人參皂苷和稀有皂苷，確定了發(fā)酵后人參提取物中有效活性成分的存在。

圖1 人參提取物發(fā)酵液中皂苷LC-MS檢測(cè)離子流圖Fig.1 LC-MS extracted ion chromatogram ofginsenosides from ginseng extracts fermentation broth

表2 人參提取物發(fā)酵液中皂苷LC-MS檢測(cè)圖譜解析Table 2 The analysis results of the mass spectraofginsenosides from ginseng extracts fermentation broth

15 Rb2 57.072 C53H90O22 1123.5892 16 Ma-Rb2 57.254 C56H92O25 1163.5829[M-H]-17 Rb3 57.568 C53H90O22 1123.5886 18 ChikusetsusaponinIVa 59.957 C42H66O14 793.4368[M-H]-19 Rd 60.050 C48H82O18 991.5461 20 Ma-Rd 60.294 C51H84O21 1031.541[M-H]-21 Zingibroside R1 65.650 C42H66O14 793.4369[M-H]-22 Notoginsenoside Ft1 63.608 C47H80O17 961.5365 23 unknown 64.237 C47H80O17 961.5355 24 Rg6 64.459 C42H70O12 811.4835 25 F4 64.922 C42H70O12 811.4838 26 RK1 68.066 C42H70O12 811.4841 27 Rg5 68.231 C42H70O12 811.4836 28 RK3 64.971 C36H60O8 665.4256 29 Rh4 65.005 C36H60O8 665.4256 30 S-PPT 66.841 C47H80O17 521.3836 31 20(S)-Rs3 66.256 C44H74O14 825.499 32 20(R)-Rs3 66.421 C44H74O14 829.4925 33 20(S)-F1 55.986 C36H62O9 683.4392 34 20(S)-F2 65.302 C42H72O13 829.4947 35 20(R)-F2 65.451 C42H72O13 829.4944 36 20(S)-Rg3 66.312 C42H72O13 829.4948 37 20(R)-Rg3 66.477 C42H72O13 829.4943 38 20(S)-CK 68.546 C36H62O8 667.4415

表3 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線、穩(wěn)定性和精密度Table 3 The working curve, stability and accuracy experiments (RSD) of standard samples of ginsenosides(n=6)

2.2 線性關(guān)系和方法學(xué)考察

以峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。各單體人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍見表3所示。精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明該方法精密度良好且在 24 h內(nèi)保持穩(wěn)定(表 3)。

2.3 乳酸菌的篩選

本研究選取了5種乳酸菌，植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌對(duì)人參提取物進(jìn)行發(fā)酵，通過比較5種乳酸菌發(fā)酵人參提取物后，發(fā)酵液中生成的 3種稀有皂苷 F2，Rg3和CK的水平，來篩選適合人參提取物發(fā)酵的乳酸菌。檢測(cè)結(jié)果表明，5種乳酸菌均能轉(zhuǎn)化人參提取物中的皂苷生成稀有皂苷，稀有皂苷含量比較結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的稀有皂苷 F2和Rg3含量相對(duì)較高，生成的CK含量無明顯差異。因此植物乳桿菌為最適人參提取物發(fā)酵生成稀有皂苷的菌種。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)稀有皂苷含量的影響Fig.2 Lactic acid bacteria fermentation on the influence of rare ginsenoside contents

2.4 植物乳桿菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)稀有皂苷含量的影響Fig.3 Fermentation time on the influence of rare ginsenoside contents

比較植物乳桿菌發(fā)酵不同時(shí)間發(fā)酵液中F2、Rg3和CK含量的變化，見圖3。

結(jié)果表明，在發(fā)酵前期，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，3種稀有皂苷的含量均逐漸增加，發(fā)酵16 d后，稀有皂苷的升降趨勢(shì)已經(jīng)不是很明顯，趨于穩(wěn)定，因此確定最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為16 d。

2.4.2 發(fā)酵初始pH的優(yōu)化

發(fā)酵前，調(diào)發(fā)酵液初始pH至不同的值，考察初始pH對(duì)發(fā)酵生成稀有皂苷的影響。比較發(fā)酵完成后發(fā)酵液中F2，Rg3和CK的含量，由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵液初始pH為6時(shí)，植物乳桿菌發(fā)酵完成后各稀有皂苷含量達(dá)到最大。因此確定植物乳桿菌發(fā)酵人參的最優(yōu)初始pH為6。

圖4 發(fā)酵初始PH對(duì)稀有皂苷含量的影響Fig.4 Fermentation PH on the influence of rare ginsenoside contents

2.4.3 接種量的優(yōu)化

圖5 接種量對(duì)稀有皂苷含量的影響Fig.5 Inoculation quantity on the influence of rare ginsenoside contents

2.4.4 底物濃度的優(yōu)化

圖6 底物濃度對(duì)稀有皂苷含量的影響Fig.6 Substrate concentration on the influence of rare ginsenoside contents

通過比較最終發(fā)酵液中稀有皂苷的含量來確定最適底物濃度，由圖6可知，綜合考慮3種稀有皂苷的含量，F(xiàn)2含量無明顯差異，Rg3和CK含量在底物濃度為10%時(shí)相對(duì)較高，隨著底物濃度的增加，稀有皂苷的含量基本不變，故選擇10%作為最佳發(fā)酵底物濃度。

2.5 最佳發(fā)酵工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可確定植物乳桿菌發(fā)酵人參提取物生成稀有皂苷的工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間16 d、初始pH 6、初始底物濃度10%、接種量10%。依據(jù)此發(fā)酵條件對(duì)人參進(jìn)行發(fā)酵，人參提取物經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，其發(fā)酵產(chǎn)物中3種稀有人參皂苷的含量分別可達(dá)到106.52 μg/mL（F2）、74.62 μg/mL（Rg3）和100.56 μg/mL（CK）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌對(duì)人參皂苷皆有轉(zhuǎn)化作用，但不同亞種轉(zhuǎn)化的種類與含量皆不相同[14～16]。大部分文獻(xiàn)報(bào)道都是對(duì)單一普通皂苷如Rb1等的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行研究[7]。付建國(guó)等[17]研究了人參固態(tài)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷，其研究表明發(fā)酵后烘干人參中CK含量有0.2%；陳賀等[18]研究人參固體發(fā)酵，最終CK含量為0.11 mg/g。這兩位研究者對(duì)人參進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，考察發(fā)酵后的人參中CK的含量。楊艷文等[19]報(bào)道了人參飲料生脈飲和人參健脾丸中F2、Rg3、CK，的含量，其中生脈飲中F2、Rg3、CK，的含量分別為0.056%、0、0；人參健脾丸中F2、Rg3、CK，含量分別為0、0.18%、0.26%。對(duì)比現(xiàn)有人參產(chǎn)品中的稀有皂苷含量，人參提取物經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中F2（0.106 mg/g）雖然沒有人參飲料中的含量高，但發(fā)酵液中含有稀有皂苷Rg3和CK，含量可達(dá)到0.074 mg/g和0.100 5 mg/g。發(fā)酵液還能夠進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，使得F2含量能夠進(jìn)一步提高而達(dá)到現(xiàn)有人參飲料的水平。人參健脾丸中Rg3和CK含量較發(fā)酵液中兩種稀有皂苷含量高，一方面人參健脾丸為固態(tài)產(chǎn)品；另一方面本研究發(fā)酵液含有人參健脾丸不含有的稀有皂苷F2，因此本研究的人參發(fā)酵液用于人參產(chǎn)品的開發(fā)具有一定的優(yōu)勢(shì)。

2.6 植物乳桿菌發(fā)酵過程中人參皂苷生物轉(zhuǎn)化途經(jīng)分析

本研究中HPLC方法檢測(cè)了人參提取物發(fā)酵前后9種人參皂苷含量的變化，結(jié)果見表4。由表4可以得出，發(fā)酵后Rg1、Re、Rb1和Rb2含量分別降低18.27%、47.3%、23.21%、和18.2%，Rd含量則基本保持不變。Rh1、F2、Rg3和CK分別增加58.12%、188.13%、203.21%和395.86%。常見皂苷向稀有皂苷的轉(zhuǎn)化是通過糖苷鍵的斷裂進(jìn)而去糖基化發(fā)生的，從結(jié)構(gòu)上分析，涉及本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的6種常見人參皂苷的可能轉(zhuǎn)化途徑有以下5種：Rb1→CK；Re→CK；Rb1→Rh1；Re→Rh1；Rb1→Rd→F2→Rg3→CK。這幾種轉(zhuǎn)化路徑與發(fā)酵過程種這幾種皂苷含量的變化是一致的。Re和Rb1可通過去糖基化轉(zhuǎn)化為Rh1和F2、Rg3和CK，因此前者含量降低，后者含量升高，而Rd是Rb1向稀有皂苷轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物，因此其含量基本保持不變。通過轉(zhuǎn)化途徑的分析，再次證實(shí)發(fā)酵過程中常見皂苷向稀有皂苷的轉(zhuǎn)化，因此表明微生物發(fā)酵是人參皂苷轉(zhuǎn)化的一種重要途徑。

表4 發(fā)酵后各皂苷含量（μg/mL）Table 4 Contents of each ginsenosideafter fermentation with Lactobacillus (μg/mL)

3 結(jié)論

本研究用乳酸菌對(duì)人參提取物進(jìn)行發(fā)酵，得到的發(fā)酵液中含有稀有皂苷F2、Rg3和CK，通過菌種篩選和工藝優(yōu)化，從植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌中確定植物乳桿菌為最適發(fā)酵菌種，確定最適發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間16 d、初始pH 6、初始底物濃度10%、接種量10%。用該發(fā)酵條件進(jìn)行人參提取物的轉(zhuǎn)化，得到稀有皂苷含量為106.52 μg/mL（F2）、74.62 μg/mL（Rg3）和 100.56 μg/mL（CK）。植物乳桿菌為人體益生菌，人參是名貴中藥，植物乳桿菌發(fā)酵后的人參提取物同時(shí)兼具發(fā)酵菌株與發(fā)酵底物的生理活性與功效，用于人參產(chǎn)品的開發(fā)具有一定的優(yōu)勢(shì)，為人參品的深加工奠定基礎(chǔ)。