趙新，蘭青闊，陳銳，劉娜，朱珠，王成，沈曉玲，王永

（天津市農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所，天津300381）

生菜一直以來都是我們餐桌上較為常見的鮮食蔬菜，一般不經(jīng)過加熱簡單清洗后直接食用，多以涼拌、生吃為主，營養(yǎng)豐富、口感清爽。但生菜屬于低矮植株，極易受到各種交叉污染的侵襲，又因其葉片層層疊生，褶皺凹凸，感染細菌后不易清洗，因此，在近幾年的例行風險監(jiān)測中，生菜中各種風險因子的檢出水平一直高居不下，已引起相關部門的高度關注[1]。鮮切蔬菜即食性的特點使其具有較高的安全風險，據(jù)估計，美國在1998年～2008年因食用果蔬（包括新鮮蔬菜和加工蔬菜）引起的食源性疾病占到了食源性疾病總數(shù)的46%[2－3]。

蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus簡稱B.cereus）是一種在米制品、肉制品、海鮮、乳品、蔬菜中比較常見的產(chǎn)芽孢細菌，同時也是主要的食源性條件致病菌，主要為腹瀉型和嘔吐型兩種類型[4]。食品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量超過105CFU/mL，即可引起腹瀉和嘔吐，偶見引起眼疾、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和菌血癥等疾病，在我國細菌性食物中毒事件中，由蠟樣芽孢桿菌引起的中毒事件近年來躍居前三位，因此其關注度在逐漸升高[5－6]。

為進一步了解即食生菜中蠟樣芽孢桿菌的污染水平，選取市售和基地的大棚、露地和水培生菜等不同栽培模式的生菜進行蠟樣芽孢桿菌污染的主動監(jiān)測，獲取相關數(shù)據(jù)。同時進行消費者對生菜的購買需求、食用方式、存放方式等的市場調研，搜集了一定的基礎調研數(shù)據(jù)。通過@Risk 6風險評估軟件[7－8]，預測消費者因食用被蠟樣芽孢桿菌污染的生菜所面臨的風險，同時根據(jù)評估結果提出相應管控措施，以保證消費者健康食用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年6月～10月，在天津市薊州和寶坻分別選擇2個生菜生產(chǎn)基地作為采樣點，按照無菌采樣原則采集水培生菜，共60份，每份500 g～1 000 g；同時按照無菌采樣原則采集基質、井水、營養(yǎng)液等環(huán)境樣本，共30份，每份500 g/mL～1 000 g/mL。在天津市南開區(qū)、西青區(qū)、河北區(qū)和東麗區(qū)選擇4個大型農(nóng)貿(mào)市場作為采樣點，按無菌采樣原則采集大棚、露地生菜，共32份。每份樣品用無菌袋封閉，獨立包裝，避免交叉污染，采樣后置低溫冷藏箱儲運，6 h內(nèi)運回實驗室，24 h內(nèi)完成檢驗。

1.2 培養(yǎng)基與儀器設備

甘露醇卵黃多黏菌素（mannitol－egg－yolk－polymyxin，MYP）瓊脂基礎、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、生化鑒定試劑盒等：北京陸橋技術有限責任公司。

JYD－400拍擊式均質器：上海之信儀器有限公司；SQ810C全自動高壓滅菌鍋：日本YAMATO有限公司；DRP－9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒有限公司；PL602－L電子天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；S1電動移液器：Thermo有限公司；生物安全柜：ESCO公司；CJ－2F超凈工作臺：蘇州市金燕凈化設備有限公司；CX31顯微鏡：奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品檢測

以無菌操作稱取生菜檢樣25 g，放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的均質袋中，充分均質混勻，按照GB/T 4789.14－2014《食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》檢驗方法進行定量檢測，根據(jù)證實為蠟樣芽孢桿菌陽性的菌落數(shù)，應用公式進行計算，報告每克生菜中蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，最低檢出限為＜10 CFU/g。同時在基地中采集與生菜生長相關的環(huán)境樣本（基質、水、營養(yǎng)液等）按照上述方法進行蠟樣芽孢桿菌定量檢測，分析可能污染來源。

1.3.2 膳食調查

隨機選取200人，利用統(tǒng)一的問卷進行膳食調查，問題包括生菜購買后儲存時間、購買后存儲方式、食用前清洗方式、食用方式、當天食用量占全部購買量的多少、家庭中食用生菜的人數(shù)、食用人性別、人均每餐生菜食用量、人均每星期生菜食用次數(shù)，由此了解天津市居民對生菜的消費情況。

1.3.3 污染水平分析

為便于計算，當生菜試樣中蠟樣芽孢桿菌濃度低于最低檢出限時，則假設蠟樣芽孢桿菌菌量為最低檢出限的50%（5 CFU/g）；當定性結果為陽性，而定量結果為陰性時，也就是生菜試樣中的樣芽孢桿菌實際待菌量低于10 CFU/g時，則假設蠟樣芽孢桿菌菌量為10 CFU/g。參照Combase數(shù)據(jù)庫中蠟樣芽孢桿菌基礎預測模型，結合膳食調查結果，獲得不同溫度條件下蠟樣芽孢桿菌的最大比生長速率。應用@Risk 6風險評估軟件設置變量參數(shù)，進行生菜中蠟樣芽孢桿菌定量風險評估，結合現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析生菜中蠟樣芽孢桿菌污染水平。

2 結果與分析

2.1 基地水培生菜中蠟樣芽孢桿菌篩查結果

根據(jù)天津地區(qū)水培生菜種植情況，選取寶坻區(qū)和薊州區(qū)2家水培生菜種植基地作為定點取樣基地，根據(jù)市場銷售情況每家基地選取4種～5種水培生菜品種，先后共采集樣本60份，經(jīng)GB/T 4789.14－2014《食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》方法檢驗，蠟樣芽孢桿菌均有不同程度的檢出。寶坻區(qū)30份水培生菜中蠟樣芽孢桿菌最低污染量為5 CFU/g，最高污染量為500 CFU/g，平均污染量為147.9 CFU/g；薊州區(qū)30份水培生菜中蠟樣芽孢桿菌最低污染量為38 CFU/g，最高污染量為2 550 CFU/g，平均污染量為691.9 CFU/g，如表1所示。

表1 基地水培生菜中蠟樣芽孢桿菌篩查結果Table 1 Screening results of Bacillus cereus in the lettuce of the base

續(xù)表1 基地水培生菜中蠟樣芽孢桿菌篩查結果Continue table 1 Screening results of Bacillus cereus in the lettuce of the base

2.2 基地水培生菜蠟樣芽孢桿菌可能污染來源分析

寶坻區(qū)種植基地水培生菜的生長模式為基質育苗后，水培床統(tǒng)一供水培養(yǎng)，定期添加營養(yǎng)液，因此其環(huán)境樣本主要為基質、井水和營養(yǎng)液；薊州區(qū)種植基地水培生菜的生長模式為基質培養(yǎng)后，水培床統(tǒng)一供水培養(yǎng)，不添加營養(yǎng)液，因此其環(huán)境樣本主要為基質和井水。先后共采集樣本30份，經(jīng)GB/T 4789.14－2014《食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》方法檢驗，其中基質和營養(yǎng)液中蠟樣芽孢桿菌均有不同程度的檢出，井水中均未檢出。寶坻區(qū)18份環(huán)境樣本中蠟樣芽孢桿菌最低污染量為0.5 CFU/g，最高污染量為2 400 CFU/g，平均污染量為545.3 CFU/g；薊州區(qū)12份環(huán)境樣本中蠟樣芽孢桿菌最低污染量為0.5 CFU/g，最高污染量為9 350 CFU/g，平均污染量為4 558.6 CFU/g，如表2所示。

2.3 市售露地大棚生菜中蠟樣芽孢桿菌篩查結果

根據(jù)露地大棚生菜在天津地區(qū)市場流通環(huán)節(jié)的銷售情況，選取4家農(nóng)貿(mào)市場，于6月～10月份進行蠟樣芽孢桿菌風險篩查，評估總量32份，結果顯示，其中13份樣本蠟樣芽孢桿菌有不同程度的檢出，蠟樣芽孢桿菌的最低污染量為5 CFU/g，最高污染量為2 200 CFU/g，平均污染量為136.3 CFU/g，具體結果見表3。

表2 環(huán)境樣本中蠟樣芽孢桿菌篩查結果Table 2 Screening results of Bacillus cereus in environmental samples

表3 市售露地大棚生菜樣本中蠟樣芽孢桿菌篩查結果Table 3 Screening results of Bacillus cereus in lettuce samples in the market

2.4 膳食調查結果

根據(jù)天津市居民食用生菜的消費習慣，針對@Risk 6軟件對風險因素的分析，設置9道問題，隨機調研200份問卷，居民購買生菜之后習慣12 h內(nèi)食用的占13%、24 h內(nèi)食用的占61%、48 h內(nèi)食用的占19%、48 h以上占7%，居民購買生菜之后習慣冰箱存儲的占65%、室溫存儲的占35%，具體匯總結果如表4。

表4 問卷調研結果匯總Table 4 Summary of questionnaire survey results

2.5 污染水平分析結果

結合生菜中蠟樣芽孢桿菌的篩查結果、家庭食用生菜的膳食調研結果、蠟樣芽孢桿菌食物中毒診斷標準（105CFU/g）以及蠟樣芽孢桿菌預測模型參數(shù)，設置生菜中蠟樣芽孢桿菌污染水平分析微生物定量風險評估（quantitative microbial risk assessmeht，QMRA）模型，模型中的參數(shù)分布均以@Risk 6軟件的語法設立，具體見表5。

表5 污染水平QMRA模型Table 5 The pollution level QMRA model

經(jīng)@Risk 6軟件1 000次迭代模擬寶坻水培生菜食用時蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布為89.2%在 0.55 lg（CFU/g）～5.00 lg（CFU/g），超過中毒診斷標準5 lg（CFU/g）的概率為10.7%；薊州水培生菜食用時蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布為87.7%在0.70 lg（CFU/g）～5.00 lg（CFU/g），超過中毒診斷標準5 lg（CFU/g）的概率為12.3%；寶坻水培生菜食用時蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布為92.6%在0.20 lg（CFU/g）～5.00 lg（CFU/g），超過中毒診斷標準5 lg（CFU/g）的概率為 7.1%，具體見圖1～圖3。

針對天津地區(qū)水培、露地、大棚生菜的初始污染水平篩查結果，應用@Risk 6風險評估軟件，分析發(fā)現(xiàn)貯藏溫度、貯藏時間、初始污染量、污染比例與最終污染量/概率分布的相關系數(shù)依次為 0.81、0.45、0.26、0.08，其中貯藏溫度與最終污染量/概率分布相關性最大，如圖4所示。若將貯藏溫度嚴格控制在冰箱7℃保存，寶坻基地水培生菜100%的最終污染量/概率分布在2.675 lg（CFU/g）以下，薊州基地水培生菜100%的最終污染量/概率分布在2.975 lg（CFU/g）以下，市售露地大棚生菜100%的最終污染量/概率分布在2.625 lg（CFU/g）以下，如圖5～圖7。因此，控制相關性最大的貯藏溫度，可有效地保證寶坻基地水培生菜、薊州基地水培生菜、市售露地大棚生菜在現(xiàn)有200份居民食用習慣調研數(shù)據(jù)下的食用安全性。

圖1 寶坻水培生菜中蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布Fig.1 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in hydroponic culture of Baodi base

圖2 薊州水培生菜中蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布Fig.2 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in hydroponic culture of Jizhou base

圖3 市售露地大棚生菜中蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布Fig.3 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in outdoor shed lettuce of market

圖4 水培露地大棚生菜中蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布相關系數(shù)Fig.4 The final pollution/probability distribution correlation coefficient of the Bacillus cereus in the lettuce

3 結論

寶坻基地、薊州基地、市售露地大棚92份生菜的篩查結果表明，蠟樣芽孢桿菌的初始污染量均在＜10 CFU/g～103CFU/g范圍內(nèi)，通過查閱相關文獻和網(wǎng)站，國內(nèi)還沒有蠟樣芽胞桿菌的限值標準，檢測還停留在風險監(jiān)測階段，參照WS/T 82－2006《蠟樣芽孢桿菌食物中毒診斷標準及處理原則》，中毒食品中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量不得超過5 lg（CFU/g），水培生菜中蠟樣芽孢桿菌初始污染量雖均不高于中毒診斷限量值，但經(jīng)居民購買后經(jīng)過不同時間和方式的存放后，最終食用時的蠟樣芽孢桿菌的污染量可能存在相對風險隱患，需進一步評估分析。

圖5 寶坻基地水培生菜冰箱7℃貯藏方式下蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布Fig.5 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in hydroponic culture of Baodi base storaged fridge 7℃

圖6 薊州基地水培生菜冰箱7℃貯藏方式下生菜中蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布Fig.6 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in hydroponic culture of Jizhou base storaged fridge 7℃

圖7 市售露地大棚生菜冰箱7℃貯藏方式下生菜中蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布Fig.7 The ultimate pollution/probability distribution of Bacillus cereus in outdoor shed lettuce of market storaged fridge 7℃

基地水培生菜的初始污染量較市售露地大棚生菜明顯偏高，這與水培生菜的水床流通式栽培模式相關，建議基地水培生菜采取有效的風險管理措施，嚴格控制初始污染量及基質和營養(yǎng)液的環(huán)境交叉污染。通過分析寶坻基地和薊州基地的污染可能來源，發(fā)現(xiàn)薊州基地的基質中蠟樣芽孢桿菌的污染水平明顯偏高，寶坻基地的營養(yǎng)液中的蠟樣芽孢桿菌在污染水平存在一定風險，由此得出結論，薊州基地中水培生菜中檢出的蠟樣芽孢桿菌大部分來源于基質，通過根系擴展到生菜的莖葉，寶坻基地中水培生菜中檢出的蠟樣芽孢桿菌大部分來源于營養(yǎng)液，通過根系擴展到生菜的莖葉。因此建議種植戶在購買基質和營養(yǎng)液的時候能加大對蠟樣芽孢桿菌的監(jiān)控，在源頭上控制蠟樣芽孢桿菌的蔓延和生長。

應用@Risk 6風險評估軟件，結合寶坻基地水培生菜、薊州基地水培生菜、市售露地大棚生菜的初始污染量篩查結果，評估居民購買生菜后經(jīng)不同溫度和時間存放后食用時生菜中蠟樣芽孢桿菌的最終污染量超過中毒診斷標準5 lg（CFU/g）的概率分別為10.7%、12.3%、7.1%，且貯藏溫度最終污染量/概率分布的相關性最大。因此，依據(jù)現(xiàn)有評估和調研結果，若居民購買生菜后全部冰箱7℃貯藏，寶坻基地水培生菜、薊州基地水培生菜、市售露地大棚生菜中蠟樣芽孢桿菌的最終污染量/概率分布可分別100%控制在2.675、2.975、2.625 lg（CFU/g）以下，保障食用安全性。

目前為止，國內(nèi)外已進行的蠟樣芽孢桿菌定量風險評估較少且不完善[9]。即食生菜中蠟樣芽孢桿菌的定量風險評估研究尚未見報道且難度較大。由于缺乏蠟樣芽孢桿菌的劑量-反應模型，本次評估以105CFU/g作為發(fā)生食物中毒的閾值標準[10-11]，同時缺乏生菜中蠟樣芽孢桿菌的生長預測模型，本次評估參照肉湯中蠟樣芽孢桿菌的生長預測模型和其他即食蔬菜中相關致病菌的生長預測模型進行了假設，因此評估中必然存在一定不確定性[12]。天津市蠟樣芽孢桿菌監(jiān)測僅從部分區(qū)域抽檢樣品，代表性方面存在局限。因此，盡快建立起劑量-反應模型[13]及不同基質中的生長預測模型[14-15]是今后蠟樣芽孢桿菌定量風險評估的進一步完善和研究方向。