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(1.西南林業(yè)大學生態(tài)與水土保持學院， 云南 昆明 650224； 2.昆明市園林科研所， 云南 昆明 650224； 3.中國林業(yè)科學院資源昆蟲研究所， 云南 昆明 650224)

黑黃檀(DalbergiafuscaPierre)，又名版納黑檀、牛角木，屬蝶形花科黃檀屬，國家Ⅱ級重點保護植物[1]。其材質堅實，是重要的紅木資源，在我國《紅木》標準(GB/T 18107—2000)中屬黑酸枝木類[2]；黑黃檀世界范圍主產區(qū)為越南、緬甸、老撾、柬埔寨等國[3]；國內分布極其狹窄，主要集中于云南西雙版納和普洱地區(qū)[1]，綠春、元江有零星分布[4]；多集中分布在海拔900～1 400 m的干燥、貧瘠山地和干熱河谷中，或散生在山地雨林或半落葉季雨林退化后形成的次生雜木林中[5]。當前，我國紅木原料基本依賴進口，《瀕危野生動植物種國際貿易公約》已將七種紅木原材列入管制范圍，紅木資源生產國多已制定了種種限制出口政策，紅木市場面臨著嚴重的資源短缺危機。黑黃檀因獨特的材性可替代進口紅木，但因過度利用和生境喪失，其種群數(shù)量急劇下降，已成漸危種[6]。故近些年對黑黃檀的人工繁育、種群擴繁研究成為熱點。

黑黃檀果實成熟于12月中下旬，種子具有宿存特征，可持續(xù)到翌年3月[7]，自然分布區(qū)11月到次年4月間降水少，具有典型的“冬旱”氣候特征[8]，對于不具有休眠習性的黑黃檀種子而言，如何適應這種季節(jié)性干旱目前并不清楚。種子萌發(fā)是高等植物生活史中一個重要過程，也是構建植物種群的關鍵環(huán)節(jié)[9]。不同植物的種子成熟后具有各自獨特的宿存特征、散布式樣及生境適應特征，因受水分等外界環(huán)境以及生物自身特性的影響，具有不同的萌發(fā)策略[10-12]，而種子萌發(fā)策略是否成功不僅影響該物種的生存和繁衍[13]，在推動自然群落的演替中也扮演著重要角色[14-15]。在多變的環(huán)境中，植物種群的建成很大程度上取決于種子在多變條件下萌發(fā)與休眠的切換能力[16]。目前有關黑黃檀的基礎研究較少，主要集中在木材性質、貯藏條件、種子特性等方面[17-19]，現(xiàn)有研究無法系統(tǒng)闡釋種子萌發(fā)特性及影響因素以及與當?shù)靥厥獾母蔁岷庸葰夂蜷g的適應關系。黑黃檀種子具有宿存特性，期間伴隨自然脫水過程，該過程中種子萌發(fā)率如何變化、果莢有何影響、種子忍耐滲透脅迫的能力怎樣等問題目前還不清楚；另外，其自然分布區(qū)存在季節(jié)性干旱的特征，種子是如何響應這種短暫干旱氣候的未見報道。無論從種質資源保護角度還是其優(yōu)越的木材價值而言，探討黑黃檀種子在不同宿存時長、果莢的有無、滲透脅迫強弱等條件下的萌發(fā)特性及原因，對黑黃檀的高效培育、種群擴繁具有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 種子采集地概況

黑黃檀果實的成熟期為12月中下旬，莢果成熟時不開裂，且宿存期較長，外業(yè)調查發(fā)現(xiàn)，少量莢果甚至到第2年幼果期時仍存于枝頭。成熟莢果于2015年1月底采自瀾滄江流域普洱段和瀾滄段的河谷地帶，海拔800～1 200 m，年平均氣溫17～21 ℃，年降水量1 200～1 500 mm，主要集中在6—9月，11月至次年4月為旱季，降水量占全年的10% ～ 20%(表1)；土壤為紅壤或磚紅壤。黑黃檀為陽性樹種，多分布于向陽山坡、山脊、疏林和半落葉的闊葉林中，也見與思茅松混生。在黑黃檀采集地，其主要伴生植物有香須樹(Albiziaodoratissima)、黃豆樹(Albiziaprocera)、火繩樹(Eriolaenaspectabilis)、云南石梓(Gmelinaarborea)、西南木荷(Schimawallichii)、白茅(Imperatacylindrica)等。

1.2 種子形態(tài)性狀、千粒重及含水量的測定

成熟種子的長、寬、厚形態(tài)指標采用游標卡尺隨機測量100粒種子來計；千粒重和含水量的測定參照《林木種子檢驗規(guī)程》(GB 2772—1999)[20]的方法，隨機數(shù)取100粒，用d=0.000 1 g的電子天平稱量，8次重復，將均值換算成1 000粒種子的重量。含水量測定采用高溫烘干法，隨機選取25粒種子(稱鮮重)置于已知質量樣品盒中，于103 ℃烘箱中烘17 h，迅速蓋好樣品盒蓋子，并放入干燥器里冷卻至室溫，再稱出種子干重，4次重復，以種子失水占鮮重的百分比表示含水量。

1.3 不同宿存時間對種子萌發(fā)的影響

黑黃檀莢果成熟后具宿存特性，為探討宿存時長對種子萌發(fā)的影響，同時排除諸如蟲害、雨淋不均等因素的干擾，在自然變溫條件下，將剛成熟的莢果隨機分成12份統(tǒng)一采用透氣紙袋裝存，并以懸掛于室內的方式來模擬莢果在樹枝上的宿存狀態(tài)，分別在采后3、6、9、12個月時測定種子含水量及萌發(fā)參數(shù)。含水量測定同1.2方法；種子萌發(fā)實驗參照《林木種子檢驗規(guī)程》(GB 2772—1999)[20]，采用2層濾紙為基質，每皿25粒，4次重復，加蒸餾水到半浸沒種子，于PGX-128 A多段可編程光照培養(yǎng)箱進行，設25 ℃溫度、14 h/d的周期性光照，光照強度為3級，每24 h統(tǒng)計種子萌發(fā)情況。

表1 黑黃檀種子采集地(普洱和瀾滄)月均溫(MT)與月均降水(MP)

采集地1月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月普洱MT(℃)12.514.217.420.021.622.221.821.720.919.115.812.6MP(mm)13.418.323.851.0150.8219.5324.3309.6167.8125.473.619.6瀾滄MT(℃)13.015.018.221.022.923.422.923.022.220.417.013.5MP(mm)11.816.020.144.8161.4278.6329.2293.0191.2135.679.420.7

注：數(shù)據(jù)來源于中國天氣網http://www.weather.com.cn 1971—2000年統(tǒng)計資料。

1.4 果莢對種子萌發(fā)的影響

黑黃檀莢果成熟時不開裂且包裹嚴實，外業(yè)調查時發(fā)現(xiàn)剛成熟的果莢具有與花類似的酸香氣味，宿存幾個月的莢果其部分外莢上會有因微生物或昆蟲作用形成的孔洞，為探明果莢是否對種子萌發(fā)存在影響以及是否含有抑制種子萌發(fā)的物質，進行如下處理：取上述室溫條件下貯存3個月的莢果，隨機分成4組，第1組剝除果莢僅留種子(對照，記作S，seeds only)；第2組剝除果莢并剪碎與種子一起萌發(fā)置床，即(種子+果莢)組(S+P，seeds+broken pericarps)；第3組對果莢戳孔但不剝除(P-H，pods with holes)；第4組完整莢果(P，whole pods)；每組4個重復，每個重復25粒種子(莢果以實際種子數(shù)計)，放置培養(yǎng)皿前統(tǒng)一采用0.5%的甲醛消毒30 min，蒸餾水沖洗3次，實驗控制條件同1.3。

1.5 種子吸水動態(tài)

將室溫貯藏3個月的莢果隨機分成2組，一組去莢僅留種子，一組帶莢種子，于25 ℃、14 h/d光照的培養(yǎng)箱中進行種子吸水動態(tài)測定，每盤60粒種子(莢果以實際種子數(shù)計)，3次重復。前12 h每隔2 h取樣稱鮮重，12 h后每隔6 h取樣稱重；帶莢種子測定時剝除果莢，擦干種子表面，用精密天平稱重；因帶莢種子取樣稱重后不能再放回，故每次取樣5粒，共計12次。用種子鮮重增加值與初始鮮重的比例即吸水率來反映吸水狀況。

1.6 萌發(fā)對滲透脅迫的響應

黑黃檀種子不存在休眠習性，成熟期12月中下旬為當?shù)氐暮导?，為弄清楚萌發(fā)初期水分條件如何影響種子萌發(fā)，參考齊淑艷等[21]的研究方法，做了如下處理：將室溫貯藏3個月的莢果剝出種子，分別置于5%、10%、15%、20%、25%、30%等6個不同濃度的聚乙二醇(polyethylene glycol)PEG-6000溶液中浸泡24 h，根據(jù)Michel等[22]的換算方法，上述PEG溶液對應的水勢分別為-0.05，-0.15，-0.32，-0.54，-0.81，-1.15 MPa，然后置于培養(yǎng)皿中進行萌發(fā)實驗，其他萌發(fā)條件同1.3，以蒸餾水浸泡為對照，每組25粒，4次重復。

1.7 指標計算與數(shù)據(jù)處理

種子萌發(fā)特性選取萌發(fā)率和發(fā)芽勢參數(shù)來表征，當胚根突破種皮并長至2 mm時，即視為萌發(fā)，萌發(fā)率采用最終萌發(fā)率即連續(xù)7 d沒有種子再萌發(fā)時結束實驗；發(fā)芽勢采用前5 d對應的萌發(fā)率來表示。

萌發(fā)率(%)=最終萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(%)=5 d萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。

對PEG滲透脅迫的耐受指標參考張曉艷等[23]采用以下2個指標表示：

1) 耐滲透脅迫適宜濃度(%)=萌發(fā)率達到對照萌發(fā)率75%時對應的PEG溶液濃度。

2) 滲透脅迫半數(shù)抑制濃度(臨界值)(%)=萌發(fā)率達到對照萌發(fā)率50%時對應的PEG溶液濃度。

種子形態(tài)大小、千粒重、含水量及萌發(fā)參數(shù)指標均以平均數(shù)±標準差表示。用Excel 2016軟件進行原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，用最少顯著差數(shù)法(LSD)進行均值多重比較。

2 結果與分析

2.1 種子千粒重及形態(tài)性狀

黑黃檀莢果偏平，舌狀披針形，內含1～2枚種子，不開裂，莢果宿存期較長，種子扁腎形，長(9.51±0.52)mm，寬(5.96±0.33)mm，厚(1.06±0.10)mm。千粒重為(47.05±0.11)g，按《林木種子檢驗規(guī)程》中每千克是否超過5 000粒將種子分為大種子和小種子，黑黃檀屬小種子。

2.2 不同宿存時間種子含水量及萌發(fā)參數(shù)變化

黑黃檀剛成熟種子含水量為(34.60±2.84)%，含水量隨宿存時間延長顯著下降，尤其在前3個月脫水快速，脫水率高達61.64%，宿存時長為6～12個月之間時，種子含水量隨時間緩慢下降，但變化不顯著，期間含水量穩(wěn)定在5%～8%之間(圖1)。而萌發(fā)率和發(fā)芽勢則是剛成熟種子的最低，分別為55.67%和51.62%；隨宿存時間延長，伴隨種子脫水過程，萌發(fā)率和發(fā)芽勢逐漸升高，3個月時顯著增加到95.57%和86.60%；宿存時長達1年時，種子萌發(fā)率又顯著下降，但仍然維持在81.85%左右，說明種子耐脫水能力非常強。

2.3 果莢對種子萌發(fā)的影響

黑黃檀種子成熟后革質的果莢依然緊閉，果莢剝除與保留2種處理存在顯著差異。(種子+果莢)組萌發(fā)率和發(fā)芽勢比純種子(對照組)稍有下降，但差異不顯著，說明果莢皮不含抑制種子萌發(fā)的物質；完整莢果組相比于對照，其萌發(fā)率和發(fā)芽勢均顯著降低，分別為48.53%和12.79%，分別比對照減少了48.20%和85.24%；而果莢戳孔組(模擬動物或微生物的作用)萌發(fā)率和發(fā)芽勢可達79.17%和30.00%；比完整莢果顯著提高，但與對照相比，極顯著下降了15.50%和65.38%(圖2)，說明果莢的存在顯著抑制了種子的萌發(fā)且推遲了萌發(fā)的啟動時間，而經過諸如動物啃咬或微生物對果莢的分解作用(通過果莢戳孔模擬處理)，增加了水分和氧氣的滲入，有利于種子內生物酶的活化，促進種子萌發(fā)。

注：不同字母表示不同處理間存在顯著差異。圖1 宿存時長對種子含水量及萌發(fā)的影響

注：大、小寫字母表示不同處理間達到極顯著、顯著差異；S為純種子;S+P表示種子+果莢;P-H表示果莢戳孔;P為完整果莢。圖2 果莢對黑黃檀種子萌發(fā)的影響

2.4 種子吸水動態(tài)及PEG滲透脅迫對種子萌發(fā)參數(shù)的影響

室溫貯藏3個月的種子在吸水初期，吸水速率很快，最初4 h吸水重量可達自身重量的97.12%，4～8 h趨緩，接下來吸水速率又緩慢升高；24 h時種子鮮重增加到最初重量的1.58倍，此后趨于穩(wěn)定(圖3)；說明純種子吸水過程主要發(fā)生在24 h內；當吸水48 h時開始有種子萌出胚根；而帶莢種子前8 h吸水率僅12.67%，10～24 h是快速吸水期，吸水率達110.35%，36 h后吸水率趨緩；帶莢種子直到96 h吸水達到自身鮮重的1.43倍時才有個別種子萌出，發(fā)芽勢僅為12.79%(圖2)，說明革質的果莢限制了水分的透過，延長了種子吸脹過程，推遲了初始萌發(fā)時間。

圖3 黑黃檀種子吸水動態(tài)

黑黃檀種子在不同濃度PEG滲透脅迫下，萌發(fā)率和發(fā)芽勢有顯著差異(圖4)。隨PEG脅迫濃度增大，種子萌發(fā)率和發(fā)芽勢均顯著下降。但當PEG濃度為5%時，萌發(fā)率比對照稍有升高，但不顯著；當PEG濃度達到30%時，萌發(fā)率從對照的93.47%下降到3.33%，發(fā)芽勢亦從89.11%下降到0%；隨著PEG脅迫程度升高，種子起始萌發(fā)時間推后，最終萌發(fā)的持續(xù)時間延長。由萌發(fā)率與PEG濃度的線性回歸方程(y=-3.299x+106.892)可知，種子萌發(fā)耐滲透脅迫的適宜濃度為11.15%，PEG滲透脅迫的臨界濃度為18.23%，表明，黑黃檀種子忍耐滲透脅迫的能力較強。

表2 黑黃檀種子萌發(fā)率與PEG濃度的回歸分析

回歸方程決定系數(shù)R2耐滲透脅迫適宜濃度(%)滲透脅迫半數(shù)抑制濃度(臨界值)(%)y=-3.299x+106.8920.951**11.1518.23

注：y為種子的萌發(fā)率；x為PEG濃度；**表示在0.01水平顯著。

注：不同字母表示不同處理間存在顯著差異。圖4 PEG滲透脅迫對種子萌發(fā)的影響

3 討論與結論

3.1 種子脫水耐性和果莢熟后不裂的生態(tài)適應意義

正常性種子在母株上成熟過程中會逐漸脫水，當脫落時含水量已較低，通常能進一步干燥到1%～5%的含水量仍具有萌發(fā)活性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，分布于瀾滄江河谷地帶的黑黃檀種子剛成熟時含水量為34.60%，具有熟時逐步脫水習性，屬正常性種子。熟后3～6個月含水量可快速下降到13.27%至8.26%，前期快速脫水，可避免微生物滋生，減少種子損失。與此同時，伴隨自然脫水過程，種子萌發(fā)率經歷先升后降的過程，當自然脫水到含水量5.61%時，浸泡復水后萌發(fā)率仍可達81.85%；另外，種子萌發(fā)對PEG滲透脅迫耐受的臨界濃度可高達18.23%，說明黑黃檀種子具有較強的耐脫水能力和耐滲透脅迫能力，對水分多變生境具有良好的適應意義。

黑黃檀種子成熟后及貯藏過程中莢果依然緊閉不裂，革質果皮的包裹能對種子起到很好的保護作用，這也可能是歷經一年或更長時間貯藏的黑黃檀種子依然能保持較高萌發(fā)率的原因之一。然而，在自然繁殖過程中，果莢不開裂；帶莢種子24 h吸水率比純種子減少了30.26%，發(fā)芽勢降低了85.24%，表明果莢對種子的緊密包裹導致通氣和透水性差，并影響到萌發(fā)初期的種子吸脹過程，進而抑制酶的活化、DNA及蛋白質的合成，細胞生長受阻、胚根難以突破種皮[25]；這與大多數(shù)存在透水性差的種皮或果皮限制種子萌發(fā)的研究[26-28]結果一致；此外，黑黃檀果莢戳孔后種子萌發(fā)率比完整莢果上升了30.63%，說明果莢的機械束縛也會對胚的生長具有一定的阻礙作用[29]。黑黃檀種子保持萌發(fā)活性的時間較長，有研究顯示，至少貯藏18個月仍具有較高的萌發(fā)率，雖然結構致密且不開裂的果莢對種子萌發(fā)具有阻礙效應，但此期間動物或微生物的噬蝕作用可增加果莢的通氣透水性，利于胚根萌出[18，30]；由此可見，黑黃檀在自然更新過程中，需要在果莢遭動物或微生物破壞后所產生的2種效應——提高萌出率與種子損失風險間進行權衡。但目前有關該物種的生物學研究還不夠深入，如宿存種子釋放規(guī)律、種子活力最長持續(xù)時間、植冠和土壤種子庫動態(tài)、果莢因生物作用所致殘損的時空變化等問題仍不清楚，故其生態(tài)權衡機制有待進一步探討。

3.2 宿存種子萌發(fā)與季節(jié)性干旱氣候的適應關系

黑黃檀種子具有宿存特性，野外調查發(fā)現(xiàn)莢果于12月中下旬成熟，多數(shù)莢果可宿存枝頭2～4個月，少量可持續(xù)到次年幼果期。與此同時，以種子采集地之一普洱為例，當?shù)?—3月降水量約為18.5 mm/月，從5月開始進入多雨季節(jié)，直到10月底月平均降水量約216.32 mm，雨季降水量占全年的86.67%(表1)，存在明顯的冬春季節(jié)性干旱現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)黑黃檀種子不具有休眠習性，但剛成熟種子萌發(fā)率較低，僅55.67%(圖1)，宿存習性使種子與其萌發(fā)所需條件隔離，有效避免了不利季節(jié)(1—3月份)形成太多幼苗引發(fā)較高的死亡率[31]；而宿存3個月后，萌發(fā)率和發(fā)芽勢分別提高到90.13%～95.57%和84.33%～6.67%，此時脫落的種子萌發(fā)所形成的幼苗正好遇上水熱條件均佳的季節(jié)，有利于幼苗快速生長和發(fā)育，盡快形成營養(yǎng)競爭力；而少量種子宿存時長達10個多月，仍保持約81.85%的萌發(fā)率，即便種子萌發(fā)，幼苗建成失敗，植物在該部分所分配的資源也非常有限[32]；而對應的自然條件恰恰是下一個旱季且氣溫較低，無論是植冠還是地面種子庫中種子都趨向于“休眠”[33]并不進行吸脹萌發(fā)，故該部分種子可視為植物種群更新的冗余備份，以分攤隨機風險。可見水分在時間上分布不均的生境中，植物傾向于形成較大的種子庫[31]，并通過宿存一段時間來調整釋放時間，以便在最適合種子萌發(fā)和幼苗建成的時機釋放種子，這種伴隨含水量、萌發(fā)率聯(lián)動的季節(jié)性差異，可認為是該物種對當?shù)丶竟?jié)性干旱氣候的一種適應。

與此同時，野外調查發(fā)現(xiàn)，植株能正常開花且大量結實，而且種子不具休眠習性，適宜的水熱條件下即可萌發(fā)且萌發(fā)率高，然而這些研究結果無法解釋黑黃檀林下幼苗少、分布狹窄的現(xiàn)象，說明導致種群瀕危的原因除了人為因素外，還可能存在其他限制因素，諸如種子捕食、傳播途徑[34]、生境中的理化限制條件[35]、幼苗建成過程的“環(huán)境篩”效應[36]等，目前相關影響機制并不清楚。

3.3 種子萌發(fā)特性對人工繁育的啟示

由于黑黃檀種子不具休眠習性，存在熟后伴隨自然脫水過程萌發(fā)率增高的現(xiàn)象，且耐脫水和耐滲透脅迫能力均較強，建議采種時間為果實熟后3個月左右，采后即播；若無法立即播種，可于常溫下帶果莢置于紙袋中保存，待播時剝除果莢浸種24 h后置床萌發(fā)。