王冰 張春青 王萍 白麗娜 李天寶 安向東 陳葉

110031沈陽市疾病預(yù)防控制中心

腸道病毒（enterovirus，EV）是一類無包膜單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，人類是其最重要的宿主。EV主要通過糞-口途徑感染，引起急性弛緩性麻痹、皰疹性咽峽炎、手足口病、無菌性腦膜炎和結(jié)膜炎等多種臨床癥狀。根據(jù)遺傳特征可將EV分為A、B、C和D四個病毒基因組，手足口病主要由A組的腸道病毒A71型（enterovirus A71， EV-A71）、柯薩奇病毒（coxakievirus， CV）A 組（2、4、5、6、10、16 型）和 B 組（1 ～5 型）等引起，以往監(jiān)測表明EV-A71和CV-A16最為常見［1］。然而，從2013年開始，我國多個省份監(jiān)測顯示柯薩奇病毒A組6型（CV-A6）開始增多且引起多地爆發(fā)，成為手足口病的主要病原之一，甚至有取代EV-A71和CV-A16的趨勢。

因此，為了解遼寧省沈陽地區(qū)CV-A6型病毒的分子流行特點，本實驗室選取了2013—2017年間收集的手足口病非EV-A71非CV-A16腸道病毒陽性標本進行CV-A6的檢測，并對其VP1全長基因序列進行測定和系統(tǒng)進化分析，為今后此類疾病監(jiān)測和疫情處置提供客觀的參考依據(jù)。

1 材料方法

1.1 標本收集 標本均取自2013—2017年遼寧省沈陽地區(qū)各級手足口病哨點監(jiān)測醫(yī)院收治的疑似手足口病患者的糞便、肛拭子以及咽拭子標本，共2 881 份，男女患者比例為 1.43∶1（1 696∶1 185）。 標本采集、運輸和保存等操作均嚴格按照《手足口病預(yù)防控制指南（2009年版）》進行。

表1 沈陽地區(qū)2013—2017年手足口病病原構(gòu)成及腸道病毒陽性病例數(shù)Tab.1 Enterovirus-associated hand，foot and mouth diseace cases and distribution of enterovirus strains in Shenyang from 2013 to 2017

1.2 標本前處理 取糞便標本約0.1 g，加入分裝好0.9 ml PBS的1.5 ml Eppendorf管中。振蕩混勻，制備10%的便懸液，5 000×g離心5 min，應(yīng)用上清液進行RNA提取。肛拭子標本參考糞便標本進行前處理，咽拭子標本振蕩混勻后直接進行核酸提取。

1.3 核酸提取 取1.2處理的標本200μl，采用德國Qiagen公司RNeasy Mini Kit試劑（批號74104）在QIA Cube核酸提取儀上對標本進行RNA的提取，最終RNA洗脫體積為50μl。

1.4 熒光定量 RT-PCR（Real-Time RT-PCR）檢測 首先采用通用型EV核酸熒光定量RT-PCR試劑盒對待檢核酸進行檢測，然后對陽性標本進行EV-A71型和 CV-A16型核酸檢測，最后對非 EVA71非CV-A16的EV核酸陽性標本，使用CV-A6型熒光定量RT-PCR試劑盒進行核酸檢測，鑒定出CV-A6型陽性標本。該檢測均使用江蘇碩世生物科技有限公司試劑盒，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行，反應(yīng)體系、擴增條件和結(jié)果判讀均按照試劑盒說明書進行。

1.5 CV-A6 VP1區(qū)擴增和測序 采用傳統(tǒng)RTPCR方法，將1.4鑒定為CV-A6型陽性的核酸標本進行擴增，選用德國Qiagen公司的One step RT-PCR Kit試劑（批號210212），在ABI公司的veriti PCR儀上進行擴增，反應(yīng)體系、擴增參數(shù)和引物序列參見文獻［2］，擴增陽性產(chǎn)物純化后送上海伯杰生物科技有限公司進行雙向測序。

1.6 序列拼接和進化分析 應(yīng)用Lasergene7.1軟件對序列進行拼接，從GenBank下載相關(guān)CV-A6型VP1區(qū)的核苷酸序列，利用MEGA6.0軟件與本研究完成測序的序列進行比對，應(yīng)用Neighbor-Joining（N-J）法構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 沈陽地區(qū)2013—2017年共采集手足口病患者臨床標本2 881份，腸道病毒核酸陽性標本2 066 份，陽性率為71.71%（2 066／2 881）（表1）。 其中 EV-A71 占 33.30%（688／2 066），CV-A16占24.20%（500／2 066），其他腸道病毒占 42.50%（878／2 066）。其中2015年其他腸道病毒比例大幅度增加，達到83.19%（292／351）。

2.2 CV-A6檢測情況 本實驗室對878份非EVA71非CV-A16的其他腸道病毒陽性標本進行CVA6核酸檢測，共檢測到CV-A6陽性標本575份，占總腸道病毒陽性標本的構(gòu)成比為27.83%，在手足口病病原譜中僅次于EV-A71（33.30%），超過CVA16居第2位。表1可見，2013—2017年中CV-A6所占總腸道病毒的構(gòu)成比間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中 2015年所占比例最高達到 68.38%（240／351），CV-A6成為該年的絕對優(yōu)勢流行株；而高峰后的2016年則為5.65%，降低到近年最低。

2.3 RT-PCR擴增和序列測定 對熒光定量RTPCR檢出的CV-A6核酸陽性標本575份，本研究按照不同年份每年隨機抽取16份，連續(xù)5年間共計80份標本，使用傳統(tǒng)RT-PCR方法擴增CV-A6的全長VP1區(qū)，除4份標本因病毒載量較低導(dǎo)致PCR產(chǎn)物濃度不足以進行測序反應(yīng)外，其余76份樣本成功擴增，PCR產(chǎn)物與預(yù)計片段大小相符。

2.4 CV-A6系統(tǒng)進化樹分析 為分析沈陽地區(qū)CV-A6型分子流行病學(xué)特征，從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取國內(nèi)各省（市）和其他國家或地區(qū)具有典型代表性的CV-A6全長VP1區(qū)序列共65條，分別來自法國、西班牙、美國、日本、芬蘭，以及中國（山東、吉林、遼寧、四川、河南、江西、河北、湖南、云南、廣東、福建和臺灣），同本研究測得的76條序列進行遺傳進化分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1）。從進化樹圖可以看出，141條CV-A6 VP1區(qū)序列在系統(tǒng)進化樹中分為4個不同基因型（A、B、C和D），各基因型間核苷酸差異在14%～23%之間，各基因型間具有明顯的時空分布差異。A基因型只包括1949年分離自美國的原型株Gdula株（AF081297），B基因型僅包括4株1992—2007年在中國山東和廣東發(fā)現(xiàn)的病毒株（192022、KP143075、AFP051 和 KP142078），而C基因型也僅有2株分別為1996年中國山東株（JQ364887）和 2008 年的印度株（JN203517）。1999—2017年在中國、日本、芬蘭、法國和西班牙發(fā)現(xiàn)的134株病毒株則一起構(gòu)成了D基因型的進化分支。

D基因型又可以進一步分為3個基因亞型（D1、D2和D3）。 D1亞型于1999—2008年間分別在日本（1999年）、西班牙（2008年）和法國（2010年）發(fā)現(xiàn)；D2亞型在2006—2013年間流行于中國和日本；D3亞型毒株則是于2009—2017年間分別由中國、日本、芬蘭、法國和西班牙陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。進化分析表明，D3亞型由兩個分支D3a和D3b構(gòu)成，其核苷酸差異在4% ～8%，其中D3b進化分支在2008—2013年分別流行于西班牙（2008年）、芬蘭（2008年）、法國（2010 年）、日本（2011 年）和中國（2011—2013年），其余GenBank下載的毒株和本研究分離株序列共計101條均屬于D3a進化分支；進化分析表明，隨時間推移該分支又進化成兩個小分支分別為D3a.1和D3a.2，D3a.1流行空間廣持續(xù)時間短，主要于2010—2013年間流行于法國（2010年）和中國（2010—2013年），同源性在97% ～99%；D3a.2流行空間局限但持續(xù)時間長，除2009—2010年間中國臺灣的2株外，其余均為2012—2017年間的中國流行株，同源性在95% ～99%之間。

3 討論

近年監(jiān)測結(jié)果顯示，我國手足口病的流行高峰、流行強度和病原構(gòu)成等主要流行特征在高、中、低緯度地區(qū)間差異較大［1］。東北地區(qū)處于我國高緯度，與處于中緯度的安徽、上海等地相比流行高峰出現(xiàn)晚、流行強度低、呈明顯單峰分布，病原更新速率也較慢，本地區(qū)的手足口病具有獨特的流行特點與病原進化特征。

2008年，芬蘭首次報道CV-A6導(dǎo)致手足口病的暴發(fā)，在歐洲、亞洲、美洲和大洋洲相繼出現(xiàn)了不同程度的流行［3-7］，在世界范圍內(nèi)逐漸成為手足口病的主要病原。中國與其他國家相比CV-A6導(dǎo)致手足口病的報道較晚，有關(guān)監(jiān)測表明2011年的廣東和福建等低緯度地區(qū)、2012年的江蘇和上海等中緯度地區(qū)、2013年的西北和華北等高緯度地區(qū)相繼有CV-A6導(dǎo)致手足口病的報道［8-12］，總體呈現(xiàn)自2011年開始由南向北迅速流行的趨勢。沈陽地區(qū)最早是在2013年手足口病監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)CV-A6毒株，歷年監(jiān)測結(jié)果表明該型毒株占腸道病毒的總構(gòu)成比達27.83%，在手足口病的病原譜中僅次于EV-A71，超過CV-A16居第二位。2013—2017年的連續(xù)監(jiān)測中，CV-A6型在所有手足口病腸道病毒各型別的構(gòu)成比變化較大，2015年是近幾年監(jiān)測中手足口病腸道病毒陽性率最高的年份，其陽性率接近80%，病原構(gòu)成中CV-A6型達到68.38%成為該年的絕對優(yōu)勢流行株。尤其值得關(guān)注的是，該年有16例手足口病重癥患者經(jīng)本實驗室確診是由CV-A6型毒株引起的，在以往監(jiān)測中鮮有所見，說明該型毒株在進化過程中傳播力增強的同時，致病力也有所改變。

◆沈陽序列圖1 CV-A6型腸道病毒VP1基因核苷酸全長序列系統(tǒng)進化樹◆Shenyang sequencesFig.1 Phylogenetic tree based on the entire VP1 nucleotide sequences of the CV-A6

VP1蛋白是腸道病毒最重要的衣殼蛋白，含有抗原決定位點和受體識別表位，具有與病毒血清型對應(yīng)的遺傳多態(tài)性，因此VP1區(qū)是腸道病毒基因分型和遺傳進化分析的重要研究對象［13］。本研究參照文獻［2］根據(jù)VP1構(gòu)建CV-A6型的系統(tǒng)進化樹，將其劃分為A、B、C、D等四個不同基因型，從圖1可以看出各基因型具有顯著的時空分布與進化規(guī)律。2007年之前，國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的5例CV-A6型病毒株均為非D型，并且僅局限在廣東和山東等少數(shù)省份（山東2株分別為A型和C型、廣東3株均為B型），兩省都為沿海發(fā)達省份，與境外往來較多，推測其均為輸入型病例，但由于非D型毒株的自身遺傳特點和宿主免疫屏障等原因，其在兩地未能進行有效的傳播。從2008年開始，國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的CV-A6型毒株均為D型，根據(jù)進化樹可以看出其在我國的進化大致可以分為三個階段，第1個階段發(fā)生在2009年之前以D2基因亞型流行為主；第2階段2009—2012年為進化的過渡階段，D2和D3亞型共存，并主要以D3a分支為主，D3b毒株僅在小范圍內(nèi)流行；第3階段為2013年以后，以D3a分支為主的CV-A6型毒株在國內(nèi)全面爆發(fā)流行。以上可見，我國發(fā)現(xiàn)CVA6型毒株以來主要以D2和D3亞型流行為主，且以D3a分支多見。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，D3a分支的CV-A6型毒株進化形成2個獨立分支，本研究將其命名為D3a.1和D3a.2，2分支間核苷酸差異在4% ～8%間。從圖1可以看出，2013年以來沈陽地區(qū)的CV-A6型全部位于D3a上，且以D3a.2為主。從時間來看，D3a.1分支僅包括2013年和2014年毒株，而2015—2017年間的所有毒株均位于D3a.2分支上（部分2013年和2014年毒株也位于該分支上）?？梢姡瑥臅r空來看，CV-A6型的D3a.2分支毒株已于2015年傳入沈陽地區(qū)，但此時沈陽地區(qū)人群針對D3a.2分支毒株的基礎(chǔ)免疫保護水平極低導(dǎo)致普遍易感，這也是沈陽地區(qū)在2015年手足口病檢測陽性率近年最高（79.59%），且CV-A6型居腸道病毒所有型別首位（68.38%）的原因。

本研究通過針對沈陽地區(qū)2013—2017年手足口病中CV-A6的檢測和基因進化特征分析，進一步客觀的證實了CV-A6是手足口病的重要病原體之一，闡明了2015年CV-A6在沈陽暴發(fā)流行的病原學(xué)基礎(chǔ)。手足口的監(jiān)測和防控應(yīng)該采取多病原和多地區(qū)聯(lián)動的措施，加強對新出現(xiàn)或新傳入的毒株類型的監(jiān)測，提高警惕、避免造成嚴重的疾病負擔(dān)和公共衛(wèi)生事件。

利益沖突 無