楊艷玲，程悅寧，張 萍，周玉成，張海威，程世鵬*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130122；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130118)

布魯菌病(Brucellosis，簡(jiǎn)稱布病)是由布魯菌(Brucella)引起的人畜共患傳染病，造成多種動(dòng)物和人感染，危害日益加重[1]。當(dāng)前布病的防控主要是采取血清監(jiān)測(cè)和疫苗免疫為主的措施，現(xiàn)有的弱毒疫苗免疫由于存在安全隱患以及目前的檢測(cè)方法的靈敏性和特異性等問題嚴(yán)重阻礙了人畜布魯菌病的凈化和防控工作。為此，篩選和鑒定有效的毒力因子、疫苗候選抗原和診斷標(biāo)識(shí)對(duì)于研制安全有效的疫苗和建立靈敏特異的診斷方法具有重要的意義?！绑w內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)抗原技術(shù)”(invivo-induced antigen technology, IVIAT)被廣泛用于一些病原菌毒力分子和候選抗原篩選鑒定的研究中，“體內(nèi)誘導(dǎo)基因”是致病菌在宿主體內(nèi)表達(dá)而在體外不表達(dá)的功能基因[2-4]。大量研究證實(shí)，這些僅體內(nèi)表達(dá)的基因常常對(duì)病原菌在體內(nèi)的致病和生存有重要意義。通過收集病原菌在不同感染途徑，不同感染階段的康復(fù)血清可以獲得病原菌在不同感染階段可能產(chǎn)生的不同抗原物質(zhì)，這些抗原物質(zhì)有的是病原菌重要的毒力成分，有的是病原菌診斷標(biāo)識(shí)以及藥物靶點(diǎn)，對(duì)研究病原菌的致病、疫苗和診斷具有重要意義。為此，本研究構(gòu)建了羊布魯菌基因表達(dá)文庫，收集臨床上羊布魯菌感染陽性血清，利用IVIAT篩選鑒定羊布魯菌特異的體內(nèi)誘導(dǎo)抗原。對(duì)篩選得到的基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，為篩選和鑒定布魯菌新的毒力分子、診斷靶標(biāo)、疫苗候選抗原和藥物靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 布魯菌16M標(biāo)準(zhǔn)菌株為軍事醫(yī)學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所王興龍研究員惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)購自TaKaRa生物；質(zhì)粒pET-30abc(+)購自Thermo Scientific,TSB培養(yǎng)基購自Sigma，用于培養(yǎng)布魯菌16M菌株；LB培養(yǎng)基(OXOID)用于培養(yǎng)大腸桿菌；卡那霉素(購自Merk)終質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1。所有菌株均用20%甘油保存于-70 ℃冰箱中；試驗(yàn)用血清采自感染羊布魯菌的羊，虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽性。

1.1.2 主要試劑 DNA限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、CIAP、DNA連接試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、膠回收及質(zhì)粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司。氯霉素、X-gal、IPTG等購自上海生物工程有限公司。混合蛋白酶抑制劑購自ROCH公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鹿IgG購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 文庫構(gòu)建 布魯菌16M標(biāo)準(zhǔn)菌株在TSB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48 h，然后提取基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ 37 ℃酶切2 h。然后回收大小在0.5～2 kb的片段，用T4連接酶連接到pET-30abc(先用BamHⅠ酶切載體，然后再用CIAP去磷酸化)載體中，4 ℃過夜。將基因組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取100個(gè)單菌落在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，分別提取質(zhì)粒，用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定構(gòu)建的文庫是否合格(空質(zhì)粒少于20%)，將平皿上的菌落用PBS全部洗下，提取質(zhì)粒即為構(gòu)建好的布魯菌基因組文庫。將基因組文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。

1.2.2 血清探針的制備 從布魯菌感染梅花鹿的陽性血清中隨機(jī)選取7份混合在一起(陽性血清來自于吉林省動(dòng)物疫病防控中心)，這些血清樣本分別用虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和ELISA進(jìn)行檢測(cè)，均確定為布魯菌陽性血清。將血清用0.22 μm 的濾膜過濾，用膜吸附法先與布魯菌16M全菌進(jìn)行作用，37 ℃ 30 min，去除布魯菌菌體表面蛋白的抗體，吸附過程重復(fù)3～5次，用ELISA檢測(cè)抗體下降的程度，然后再將上述血清分別與布魯菌菌體裂解產(chǎn)物和大腸桿菌BL21的裂解產(chǎn)物進(jìn)行吸附，分別去除布魯菌裂解產(chǎn)物的抗體及宿主菌的抗體。吸附后所得血清即為制備的布魯菌血清探針。

1.2.3 表達(dá)文庫的免疫篩選 將轉(zhuǎn)化獲得的表達(dá)文庫菌液以適宜濃度涂布于含有卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)5 h，將滅菌的PVDF膜小心放入長(zhǎng)好的平板上，充分接觸復(fù)印15 min，做好標(biāo)記，將標(biāo)記好的PVDF膜放入含卡那霉素(50 μg·mL-1)和IPTG(1 mmol·L-1)的LB平板上，菌落面朝上，37 ℃培養(yǎng)4 h，取出PVDF膜，在氯仿蒸汽中熏蒸15 min，部分裂解菌落。立即加入10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用PBS-T (含0.5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液)洗滌5 min后，加入PBS稀釋(1∶200)的吸附后血清4 ℃過夜孵育，PBS-T洗滌，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鹿IgG(1∶20 000)，室溫孵育1 h，PBS-T洗滌，TMB顯色，將結(jié)果與母板對(duì)比，標(biāo)記出陽性菌落。挑取陽性菌落劃線于含卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌落于含卡那霉素(50 μg·mL-1)LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，20%甘油保存于-70 ℃冰箱中。

1.2.4 基因鑒定 以僅含有pET-30a/b/c空載體的大腸桿菌BL21(DE3)為陰性對(duì)照，剔除假陽性克隆，對(duì)上一步確定的陽性克隆再次進(jìn)行菌落免疫印跡篩選，步驟相同，篩選出與對(duì)照比較仍呈陽性反應(yīng)的克隆。提取最終確定的陽性克隆的質(zhì)粒，對(duì)插入序列進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果在NCBI entrez database′sB.melitensis和B.abortusgenomes數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，用PSORTb 2.0 軟件進(jìn)行細(xì)胞定位。

1.2.5 RT-PCR驗(yàn)證 提取培養(yǎng)48 h的布魯菌16M總RNA，用DNaseⅠ消化RNA中的基因組DNA，用核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩⒄誔rimeScriptTMRT-PCR Kit使用說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)上述IVIAT鑒定的陽性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果所得序列設(shè)計(jì)引物(表1)，按照RT-PCR試劑盒的反應(yīng)體系，優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

表114個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因的PCR引物

Table1FourteenPCRprimersthatinducedexpressionofthegeneinvivo

編號(hào)No.基因名稱Gene引物(5'→ 3') Primer1glucose-6-phosphate dehydrogenaseF-TCGGCCTGATCCACCTCTTCR-ATCCCTTCGACTGCATCGTTTT2Copper-binding periplasmic protein precursorF -CGTGAAATGAATGCCGATGCR-ATAGAACGCTGGCTGGAGGC3NAD(P)H quinone oxidoreductaseF-TTTCCTTCGATCCTGCGGTGGTR-TTGGCTGGCGGTGGCTATGC4tRNA uridine 5-carboxymethylaminomethyl modification enzyme GidAF-TTGAAATGTGGTGCCGTGGTTR-GCGATCCGTCATAAGCGAGAA5cyclic nucleotide-binding domain proteinF-TTGCGGTCGGAATAGAGGAACR-CGAAACCCGTGGAAGTGGATG6aldehyde dehydrogenase family proteinF-GCGCAGTGCCATGTCCAGATR-AGCCCGAAAGTTCCCGTTGT7betaine-aldehyde dehydrogenaseF-GTCAGGATGCGATTGAGAAGGGR-CCGAGGCAACAGCAACCACT8hypothetical protein DUF1332R-TGAACCAGAACAACCCTTCCCF-GTTTGATCGTCTGCTGGAATT9cobalamin synthesis protein P47KF-GCCTGTTTGACGGCTTCCTCR-CATCCTCTTCTCACGCAGGTTT10acetate-CoA ligaseF-TGCGAGACAAGTGCCGATTCR-CAATGTGCAGGAGGGCGTAG11cobW/HypB/UreG, nucleotide-binding domain proteinF-ATATGCTTTGGGCGTTGATGR-TTGGCGATGCGAAAATTAGA

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)文庫的構(gòu)建

提取羊布魯菌16M基因組，如圖1所示。用16倍倍比稀釋的Sau3AⅠ酶切基因組，基因組片段大小均在0.5～2 kb之間，如圖2所示。酶切片段純化后與線性去磷酸化的表達(dá)載體pET-30a/b/c連接，轉(zhuǎn)化到DH5α中，構(gòu)建羊布魯菌16M基因組文庫，大小為4×104。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒文庫全部轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)抽取轉(zhuǎn)化子，利用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切的方法，檢測(cè)插入效率，插入效率約為90%，空質(zhì)粒低于20%，證明構(gòu)建的文庫合格，如圖3所示。

2.2 羊布魯菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的篩選與鑒定

利用臨床上采集的7份羊布魯菌陽性血清經(jīng)過充分吸附后制成的免疫探針，篩選陽性克隆，菌落能夠與血清探針進(jìn)行特異性反應(yīng)，結(jié)果有14個(gè)特異性菌落發(fā)生了特異性反應(yīng)。如圖4A所示。對(duì)這14個(gè)特異性插入序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI GenBank上B.melitensis和B.abortus基因組序列中進(jìn)行檢索，14個(gè)產(chǎn)物均屬于B.melitesis和B.abortus兩株布魯菌的基因產(chǎn)物，它們分別是：glucose-6-pho-

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1～4均為布魯菌16M基因組M. DNA marker; Lanes 1-4 are Brucella 16M genomes圖1 羊布魯菌16M基因組電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of Brucella 16M genome

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1～5分別為內(nèi)切酶稀釋4、8、16、32、64倍的酶切結(jié)果M. DNA marker; Lanes 1-5 were the results of digestion by endonuclease diluted 4, 8, 16, 32 and 64 times圖2 布魯菌16M基因組Sau3AⅠ部分酶切Fig.2 Brucella 16M genome partially digested by Sau3AⅠ

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1～10為用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定挑取的10個(gè)轉(zhuǎn)化菌M. DNA marker; Lanes 1-10 were double-digested with KpnⅠ and HindⅢ to identify the 10 transformed bacteria圖3 雙酶切鑒定電泳圖Fig.3 Double enzyme digestion identification by electrophoresis

sphate dehydrogenase(葡萄糖-6磷酸脫氫酶)； copper-binding periplasmic protein precursor(周質(zhì)銅結(jié)合蛋白前體)；NAD(P)H quinone oxidoreductase, PIG3 family protein [NAD(P)H醌氧化還原酶PIG3家族蛋白]； tRNA uridine 5-carboxy methylaminomethyl modification enzyme GidA(mnmG) (tRNA尿苷5-羧基甲基氨甲基修飾酶GidA)； cyclic nucleotide-binding domain protein(環(huán)核苷酸結(jié)合域蛋白)；aldehyde dehydrogenase family protein(乙醛脫氫酶家族蛋白)；betaine-aldehyde dehydrogenase(三甲基甘氨醛脫氫酶)；hypothetical protein DK61_1527(未知蛋白)；cobalamin synthesis protein P47K(鈷氨素合成蛋白P47K)；acetate-CoA ligase(乙酸CoA連接酶)；cobW/HypB/UreG, nucleotide-binding domain protein(核苷酸結(jié)合域蛋白)； tellurite resistance TerB family protein(亞碲酸抑制TerB家族蛋白)；nitrous oxide reductase maturation NosD family protein(一氧化二氮成熟體NosD家族蛋白)； propionate-CoA ligase(丙酸CoA連接酶)。通過PSORTb 2.0軟件分析，這些蛋白主要與布魯菌的糖代謝、RNA修飾、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和跨膜運(yùn)輸?shù)裙δ芟嚓P(guān)，分別位于布魯菌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)(詳見表2)。

2.3 IVIAT鑒定基因產(chǎn)物RT-PCR分析

根據(jù)獲得的14個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)布魯菌16M反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR結(jié)果顯示有14個(gè)基因得到了特異性擴(kuò)增，驗(yàn)證了這些基因均屬于布魯菌基因組基因。結(jié)果如圖4B所示。

1. 葡萄糖6-磷酸脫氫酶；2. 銅離子結(jié)合周質(zhì)蛋白前體；3. NAD(P)H醌氧化還原酶，PIG3家族蛋白；4. tRNA尿苷5-羧基甲氨基甲基修飾酶GidA(mnmG)；5. 環(huán)核苷酸結(jié)合域蛋白；6. 乙醛脫氫酶家族蛋白；7. 三甲基甘氨醛脫氫酶；8. 假定蛋白DK61_1527；9.鈷氨素合成蛋白p47K；10. 乙酸輔酶A連接酶；11. cobW/HypB/UreG核苷酸結(jié)合域蛋白；12. 亞碲酸抑制TerB家族蛋白；13. 一氧化二氮還原酶NosD家族蛋白；14 丙酸輔酶A連接酶；M.核酸相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Glucose-6-phosphate dehydrogenase；2. Copper-binding periplasmic protein precursor；3. NAD(P)H quinone oxidoreductase, PIG3 family protein；4. tRNA uridine 5-carboxy methylaminomethyl modification enzyme GidA(mnmG)；5. Cyclic nucleotide-binding domain protein；6. Aldehyde dehydrogenase family protein；7. Betaine-aldehyde dehydrogenase；8. Hypothetical protein DK61_1527；9. Cobalamin synthesis protein P47K；10. Acetate-CoA ligase；11. CobW/HypB/UreG, nucleotide-binding domain protein；12. Tellurite resistance TerB family protein；13. Nitrous oxide reductase maturation NosD family protein；14. Propionate-CoA ligase；M. DNA marker圖4 IVIAT篩選抗原與陰性對(duì)照血清的菌落免疫印跡反應(yīng)(A)及陽性克隆RT-PCR驗(yàn)證(B)Fig.4 Colony-immunoblotting of IVIAT screening antigens with negative control sera(A) and positive clones RT-PCR verification electrophoresis(B)

3 討 論

體內(nèi)誘導(dǎo)抗原鑒定技術(shù)(IVIAT)是一種新型的鑒定病原微生物體內(nèi)表達(dá)基因的方法，該方法是利用感染并康復(fù)的動(dòng)物血清，用體外培養(yǎng)的病菌全細(xì)胞、細(xì)胞裂解液及熱變性細(xì)胞裂解液吸附處理收集的動(dòng)物血清，再用吸附后的血清為探針來篩選已構(gòu)建于大腸桿菌宿主菌的病菌基因組表達(dá)文庫，陽性反應(yīng)克隆則含有病菌DNA序列所編碼的體內(nèi)抗原。大量的研究表明，這些獨(dú)特的在體內(nèi)表達(dá)而在體外不表達(dá)的基因往往對(duì)病原菌在體內(nèi)的生存和致病有重要意義，這些基因多半是病原菌的毒力因子、免疫候選抗原、藥物靶點(diǎn)和分子診斷標(biāo)識(shí)。因此，近年來有關(guān)病原菌的體內(nèi)誘導(dǎo)基因的研究越來越受到重視。該方法不需要?jiǎng)游锬Ｐ?，無需直接對(duì)病原微生物進(jìn)行操作，可以檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá)以及不同感染途徑、不同感染階段的基因等優(yōu)點(diǎn)，因此在較為復(fù)雜以及具有毒性的病原微生物中有著廣泛的應(yīng)用前景[5-7]。

表2NCBI比對(duì)鑒定得到的蛋白信息表

Table2NCBIidentificationoftheresultingproteininformationtable

編號(hào)No.布魯菌基因產(chǎn)物IDBrucella menlitensisgene product IDCOG或CDDCOG or CDD功能預(yù)測(cè)Putative function細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Predicted cellullar localization1WP_006121516Glucose-6-phosphate dehydrogenase氧化還原酶活性,參與葡萄糖代謝過程cytoplasm2PRJNA227977Copper-binding periplasmic protein precursor銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程membrane3AIJ90407.1NAD(P)H quinone oxidoreductase, PIG3 family proteinNADH脫氫酶活性,幫助醌結(jié)合cytoplasm4PRJNA244262tRNA uridine 5-carboxy methylaminomethyl modification enzyme GidA(mnmG)參與tRNA尿苷轉(zhuǎn)錄修飾cytoplasm5WP_002965067.1Cyclic nucleotide-binding domain protein參與細(xì)胞內(nèi)部多種物質(zhì)代謝過程cytoplasm6AE017224.1Aldehyde dehydrogenase family protein參與乙醛代謝過程plasma membrane7BAB_RS31655Betaine-aldehyde dehydrogenase參與甘氨酸三甲胺乙內(nèi)酯的合成cytoplasm8BAB_RS28320Hypothetical protein DK61_1527未知功能plasma membrane9PRJNA33767Cobalamin synthesis protein/ P47K family protein參與鈷氨素的生物合成過程plasma membrane10PRJNA243901Acetate-CoA ligase參與乙酰輔酶A的生物合成cytoplasm11AIJ94334.1CobW/HypB/UreG, nucleotide-binding domain protein氮化合物代謝過程cytoplasm12PRJNA243878Tellurite resistance TerB family protein功能未知membrane13PRJNA243893Nitrous oxide reductase maturation NosD family protein膜的有機(jī)成分組成membrane14CAP05266.1Propionate-CoA ligase參與丙酸破壞過程和二檸檬酸甲酯循環(huán)cytoplasm

本研究利用IVIAT技術(shù)，從大概40 000個(gè)含有布魯菌16M基因組片段的大腸桿菌克隆中篩選得到了14個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因。經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證，這些基因均是布魯菌16M體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的基因。它們主要是布魯菌糖代謝，離子物質(zhì)運(yùn)輸，細(xì)胞膜組成以及RNA修飾等過程中重要的基因表達(dá)產(chǎn)物。在先前的研究中利用IVIAT方法也鑒定了一些布魯菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的基因， Lowry等[8]運(yùn)用麋鹿血清從B.abortusRB51的基因組表達(dá)文庫中成功篩選得到了10個(gè)布魯菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因，驗(yàn)證了MDH、AfuA、D15等基因。孫曉慶[9]運(yùn)用牛血清從牛布魯菌疫苗株A19基因組中成功篩選得到33個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因，并對(duì)Fumly、SDR、MDH、Nirase、Fumhy、EnvZ、AfuA和D15等8個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原進(jìn)行原核表達(dá)和免疫原性分析。然而在本試驗(yàn)中，利用IVIAT篩選到的14個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因與他們的研究獲得的體內(nèi)誘導(dǎo)基因完全不一致，這些基因全部是未曾被報(bào)道過的基因，這主要有二個(gè)原因，其一是采用的宿主血清和布魯菌菌株不同，本研究的研究對(duì)象是羊的血清和平滑型菌株羊布魯菌16M，而其他學(xué)者開展研究所使用的血清分別是牛、麋鹿等動(dòng)物血清，菌株分別是粗糙型牛布魯菌疫苗株RB51[8]和平滑型牛布魯菌疫苗株A19[9]。布魯菌的種型之間，疫苗株和強(qiáng)毒株之間，平滑型菌株和粗糙型菌株之間在致病和免疫過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因存在較大差異，這就是本試驗(yàn)所得到的誘導(dǎo)基因與其他研究不一致的根本原因。其二是細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間不同，在本研究中細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為48 h，而其他研究中細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為24 h，這也是導(dǎo)致所得到的誘導(dǎo)抗原不一致的主要原因之一。細(xì)菌在不同培養(yǎng)時(shí)間所誘導(dǎo)表達(dá)的基因也存在著較大的差異。因此，在我們的研究中可以真實(shí)客觀地反映出羊布魯菌強(qiáng)毒株感染過程中所誘導(dǎo)表達(dá)的重要基因，這些基因?qū)τ谘芯垦虿剪斁⒏腥?、識(shí)別免疫、參與細(xì)胞代謝起到了至關(guān)重要的作用。在鑒定的14個(gè)基因中，有的已經(jīng)被驗(yàn)證了在布魯菌中的作用，如環(huán)核苷酸結(jié)合蛋白(cyclic nucleotide-binding domain protein，CNB)已經(jīng)被研究發(fā)現(xiàn)是布魯菌潛在的藥物靶點(diǎn)， CNB是環(huán)核苷單磷酸(cyclic nucleotide monophosphate，cNMP) 結(jié)合蛋白的保守區(qū)，cNMP結(jié)合蛋白根據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)的功能已經(jīng)被認(rèn)為是潛在的藥物作用靶點(diǎn)。CNB是關(guān)鍵的細(xì)胞裝置組成部分，調(diào)節(jié)多個(gè)細(xì)胞內(nèi)部過程。這些蛋白結(jié)構(gòu)域已經(jīng)在幾個(gè)蛋白家族被發(fā)現(xiàn)，如cAMP受體蛋白(CRP), cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶(PKA和PKG)以及ether-a-go-go(EAG)通道蛋白。CNB主要負(fù)責(zé)兩個(gè)二級(jí)信使cAMP和cGMP的結(jié)合[10]。本研究中通過體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)也鑒定到了該基因，這為研究布魯菌治療藥物的篩選提供了科學(xué)依據(jù)。

tRNA尿苷 5-羧基甲基氨甲基修飾酶GidA [tRNA uridine 5-carboxy methylaminomethyl modification enzyme GidA(mnmG)]是tRNA修飾過程中十分重要的酶，在真核生物和原核生物的翻譯過程中，tRNA修飾酶GidA有助于tRNA的正確折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及在監(jiān)督密碼子和反密碼子正確翻譯中起到了重要作用[11]。在幾個(gè)致病病原菌中，GidA在細(xì)菌生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂以及毒力調(diào)節(jié)等過程中均起到了關(guān)鍵的作用。在Ⅱ型鏈球菌中發(fā)現(xiàn)該基因不僅影響了細(xì)菌生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂、莢膜合成，也嚴(yán)重影響了Ⅱ型鏈球菌的毒力[12]。然而該基因在布魯菌中的作用還沒有被報(bào)道，有可能成為布魯菌新的毒力分子。

亞碲酸鹽抗性TerB家族蛋白(tellurite resistance TerB family protein)是細(xì)菌重要的毒力因子，在吞噬體抑制、毒素耐受以及細(xì)菌毒力等方面發(fā)揮著重要的作用。在很多細(xì)菌都有該基因，如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等，幫助細(xì)菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)生存和復(fù)制[13]。本研究首次在布魯菌中發(fā)現(xiàn)該基因，該分子也有可能成為布魯菌在細(xì)胞內(nèi)生存的重要毒力分子。

本研究中也篩選到NosD家族蛋白(nitrous oxide reductase maturation NosD family protein)。NosD是屬于糖水化合物和糖水解域的蛋白，其具體生物學(xué)意義還不是很清楚[14]。NosY是六螺旋的轉(zhuǎn)膜蛋白，其被認(rèn)為是和NosF和NosD一起形成ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，有研究已經(jīng)表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是布魯菌與宿主相互作用過程中的重要毒力因子，具有致病作用，也是重要的免疫成分，可用于布魯菌疫苗候選抗原[15]。在我們的研究中鑒定得到的NosD有可能成為布魯菌重要的免疫識(shí)別抗原。

NAD(P)H醌氧化還原酶PIG3家族蛋白[NAD(P)H quinone oxidoreductase, PIG3 family protein]主要參與腫瘤凋亡，被用作長(zhǎng)期的腫瘤促凋亡的標(biāo)識(shí)[16]，然而在本研究中鑒定得到了該蛋白，該分子也可能與布魯菌細(xì)胞內(nèi)生存有關(guān)，也可作為布魯菌感染宿主細(xì)胞后細(xì)胞凋亡的診斷標(biāo)識(shí)，布魯菌可能通過抑制該基因的表達(dá)來抑制宿主細(xì)胞的凋亡，從而在宿主內(nèi)得以生存。

雖然本研究所鑒定的14個(gè)布魯菌體內(nèi)誘導(dǎo)基因中有些基因的功能還未知，但是從上述已知的基因功能中我們不難發(fā)現(xiàn)這些基因在布魯菌的胞內(nèi)生存、毒力作用、細(xì)胞代謝、免疫識(shí)別等重要生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵作用，有可能成為布魯菌新的毒力分子，藥物作用靶點(diǎn)和免疫識(shí)別標(biāo)識(shí)，有待我們進(jìn)一步通過試驗(yàn)研究來證實(shí)這些基因的重要功能，本研究結(jié)果對(duì)于研究布魯菌的致病機(jī)制，篩選藥物作用靶點(diǎn)和分子診斷標(biāo)識(shí)提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究將體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(IVIAT)成功地應(yīng)用到布魯菌候選抗原和診斷標(biāo)識(shí)的篩選和鑒定研究中，利用該技術(shù)成功獲得14個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因，這些基因在布魯菌的毒力和免疫中均具有重要意義，將為布魯菌疫苗的研制和診斷產(chǎn)品的研發(fā)提供候選抗原和診斷標(biāo)識(shí)。