王丹陽(yáng)，張 康，王旭榮，王海瑞，王 磊，張 凱，張景艷，李建喜，王學(xué)智

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

牛病毒性腹瀉病(BVD)又稱(chēng)牛病毒性腹瀉-黏膜病，是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的急性、接觸性傳染病[1]。臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、免疫抑制、白細(xì)胞減少、出血及致死性黏膜病，妊娠母畜流產(chǎn)、產(chǎn)畸形胎或持續(xù)性感染牛(PI牛)[2]。該病毒屬于黃病毒科瘟病毒屬[3]，單股正鏈RNA分子，基因序列及抗原性和豬瘟病毒、羊邊界病毒有很高的同源性[4]。近年來(lái)隨著對(duì)BVDV分子特征的深入研究，囊膜蛋白E2(gP53)含有多種抗原結(jié)構(gòu)域，有利于介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)及病毒感染的初始階段[5-7]，有些抗原決定區(qū)有較高的變異率[8-9]，使得BVDV具有高度的變異性，導(dǎo)致疫苗保護(hù)失效和持續(xù)性感染。目前，疫苗接種仍是防控該病的主要方法，但因弱毒疫苗可誘發(fā)免疫抑制和黏膜病[10]，而滅活疫苗免疫期較短,成本較高等諸多原因使得至今還沒(méi)有保護(hù)效果非常好的疫苗能有效地防控該病。為此，研究高效敏感抗BVDV的藥物對(duì)牛病毒性腹瀉病的治療及防控具有重要意義。隨著中草藥抗病毒藥物的研發(fā)近幾年早已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[11]，有關(guān)針對(duì)于BVDV抗病毒藥物的研究也日益增多。經(jīng)研究表明，人參皂苷和鹿角盤(pán)多糖具有顯著的抗BVDV的作用[12-13]；金絲桃素可溶性粉對(duì)BVDV也具有抑制作用，且直接殺滅作用顯著[14]；苦馬豆素(SW)對(duì)BVDV有較好的復(fù)制抑制作用和綜合作用，也有一定的直接殺傷作用[15]；沙冬青種子總生物堿對(duì)BVDV有較強(qiáng)的直接殺傷和復(fù)制抑制作用，而無(wú)明顯的吸附阻斷作用[16]；另外，莪術(shù)油、魚(yú)腥草、黃茂、雙黃連和五味子乙素對(duì)鹿源BVDV均具有顯著的抑制作用[17-18]；此外，訶子提取物及鞣質(zhì)類(lèi)成分、甘青烏頭和矮紫堇提取物及多種生物堿成分，均具有一定的抗菌、抗病毒、抗炎等功效[19-21]。本研究主要采用了利巴韋林做陽(yáng)性對(duì)照藥物，通過(guò)三種不同的作用方式探究3種藏藥的體外抗BVDV效果，這在之前相關(guān)的研究中均未見(jiàn)報(bào)道，為抗BVDV藥物的研發(fā)及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

藏藥訶子、矮紫堇、甘青烏頭由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所購(gòu)自藏區(qū)，水提法提取，凍干成粉后密封，4 ℃避光保存?zhèn)溆茫魂?yáng)性藥物(利巴韋林)購(gòu)自索萊寶生物有限公司。

1.2 病毒與細(xì)胞

美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)毒株BVDV(NADL)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。MDBK細(xì)胞株購(gòu)自上海和園生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)；胎牛血清(FBS)(GIBCO公司)；胰酶(GIBCO公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(索萊寶生物科技有限公司)；Cell Counting Kit-8(碧云天生物技術(shù)有限公司)；DMSO(索萊寶生物科技有限公司)；SpectraMax M2e酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；生物顯微鏡(22EB，德國(guó)DIALUX)；原位冷凍干燥機(jī)(LGJ-10F北京松原華星科技有限公司)等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同濃度藥物稀釋液的配制 采用二倍稀釋法用3%細(xì)胞維持液對(duì)3種藏藥凍干粉分別配制以下10個(gè)濃度：256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 mg·mL-1，利巴韋林干粉稀釋256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg·mL-1，0.22 μm微濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 病毒TCID50的測(cè)定 參照郝寶成等[9]的病毒毒力測(cè)定方法對(duì)BVDV的TCID50進(jìn)行測(cè)定。按Reed-Muench氏法計(jì)算BVDV的TCID50為10-4.67·0.1 mL-1。

1.4.3 藥物對(duì)MDBK細(xì)胞最大安全濃度的測(cè)定 消化MDBK，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，按每孔1×105·mL-1的密度接種于96孔板，培養(yǎng)成單層細(xì)胞后，棄生長(zhǎng)液，加梯度稀釋的藥液，100 μL·孔-1，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)重復(fù)，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，逐日觀察細(xì)胞病變程度和病變孔數(shù)。同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組和空白對(duì)照組。待CPE不再繼續(xù)時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞板3次，每孔加入10 μL的CCK8試劑，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度(OD值)。按照下面的公式計(jì)算細(xì)胞病變率，并利用GraphPad PrismTM軟件計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(CC50)。CC50是能夠使50%的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)的藥物濃度；最大安全濃度(MNTC)是能夠使90%以上的細(xì)胞存活的藥物濃度。

細(xì)胞病變率(%)=[(細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-試驗(yàn)加藥組平均OD值)/細(xì)胞對(duì)照組平均OD值]×100%。

1.4.4 藥物體外抗BVDV作用

1.4.4.1 不同濃度藥物稀釋液的配制：采用二倍倍比稀釋法以最大藥物安全濃度為基準(zhǔn)(訶子1 mg·mL-1；矮紫堇1 mg·mL-1；甘青烏頭8 mg·mL-1；利巴韋林 2 μg·mL-1)配制以下5個(gè)稀釋濃度。

1.4.4.2 藥物對(duì)BVDV的直接殺傷作用：將等量的100·TCID50BVDV病毒液與藥物稀釋液混合均勻置于培養(yǎng)箱中預(yù)先作用4 h，加入96孔板，100 μL·孔-1，培養(yǎng)箱中作用2 h，棄上清液，加100 μL細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，逐日觀察、詳細(xì)記錄每孔的CPE。同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組和空白對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)重復(fù)，待病毒對(duì)照組CPE不再繼續(xù)時(shí)，按“1.4.3”操作進(jìn)行CCK8細(xì)胞活力檢測(cè)，并計(jì)算該作用方式下的抗BVDV有效率和藥物半數(shù)有效濃度(EC50)。

藥物的抗病毒有效率(%)=[(試驗(yàn)加藥組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值)]×100%。

1.4.4.3 藥物對(duì)BVDV的吸附阻斷作用：細(xì)胞接種96孔板，待長(zhǎng)成單層細(xì)胞后加藥物稀釋液，37 ℃培養(yǎng)4 h后，棄液，加入100·TCID50病毒液，100 μL·孔-1，吸附2 h棄去病毒液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察CPE并記錄病變孔數(shù)。待病毒對(duì)照組不再出現(xiàn)CPE時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，計(jì)算該作用方式下的抗病毒有效率。

1.4.4.4 藥物對(duì)BVDV復(fù)制阻斷作用：細(xì)胞接種96孔板，待長(zhǎng)成單層細(xì)胞后加入100·TCID50病毒液，每孔100 μL，吸附2 h后棄液，每孔加入100 μL藥物稀釋液，逐日觀察并記錄CPE，并測(cè)定有效抑制率。

1.4.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 22.0 軟件對(duì)有效抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析，對(duì)抑制率高達(dá)50%的供試藥物，利用GraphPad PrismTM軟件分別計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(CC50)及藥物半數(shù)有效濃度(EC50)，按公式TI=CC50/EC50，計(jì)算相應(yīng)的治療指數(shù)(TI)。

2 結(jié) 果

2.1 藥物對(duì)MDBK細(xì)胞最大安全濃度測(cè)定

試驗(yàn)加藥組的細(xì)胞毒性表現(xiàn)為細(xì)胞的殺傷作用，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系；利巴韋林組則表現(xiàn)一定的抑制細(xì)胞增長(zhǎng)效應(yīng)。經(jīng)測(cè)定訶子、矮紫堇、甘青烏頭和利巴韋林的最大安全濃度分別為1 mg·mL-1、1 mg·mL-1、8 mg·mL-1和2 μg·mL-1；經(jīng)軟件分析后，藥物半數(shù)中毒濃度分別為6.383 mg·mL-1、7.116 mg·mL-1、42.40 mg·mL-1和20 μg·mL-1,表明4種藥物對(duì)MDBK細(xì)胞的毒性從大到小依次為利巴韋林、訶子、矮紫堇和甘青烏頭。

2.2 藥物對(duì)BVDV的直接殺傷作用

在藥物和BVDV預(yù)先作用的給藥方式下，各加藥組的細(xì)胞病變程度較病毒對(duì)照組有所減輕。由表1可看出，4種藥物對(duì)BVDV均表現(xiàn)出有一定的抑制作用，在安全濃度范圍內(nèi)，有效抑制率呈一定的量效關(guān)系。相比同種藥物的其他濃度組，訶子、矮紫堇、甘青烏頭和利巴韋林均在最大藥物安全濃度時(shí)有較高的有效抑制率，分別是52.43%、72.86%、56.87%和51.06%；經(jīng)軟件分析，EC50分別為0.613 mg·mL-1、0.367 mg·mL-1、3.059 mg·mL-1和2 μg·mL-1，TI分別為10.41、19.39、13.86和10.00(表2)，表明4種藥物對(duì)BVDV均具有一定的直接滅活作用，其抑制作用效果較好的是矮紫堇，其次是甘青烏頭、訶子和利巴韋林。

表1藥物對(duì)BVDV直接殺傷作用的CPE及CCK8檢測(cè)結(jié)果

Table1TheresultsofdirectlykillingeffectofdrugsonBVDVbyCPEandCCK8

藥物稀釋倍數(shù)Drugs dilution factor訶子Terminalia chebula矮紫堇Corydalis hendersonii甘青烏頭Aconitum tanguticum利巴韋林RibavirinCPE有效抑制率/%Effective inhibition rateCPE有效抑制率/%Effective inhibition rateCPE有效抑制率/%Effective inhibition rateCPE有效抑制率/%Effective inhibition rate20++52.43±0.07a+72.86±0.07A++56.87±0.05a++51.06±0.08a2-1+++41.32±0.03++55.67±0.06++54.11±0.05++49.89±0.032-2+++38.01±0.08+++26.01±0.09++49.41±0.10++47.59±0.092-3++++21.12±0.06++++18.02±0.04+++39.48±0.03+++27.96±0.052-4++++11.33±0.02++++12.22±0.07+++27.19±0.03++++19.42±0.09C-100.00-100.00-100.00-100.00V++++0.00++++0.00++++0.00++++0.00

表2藥物對(duì)BVDV治療指數(shù)的測(cè)定結(jié)果

Table2Theresultsoftreatmentindexofdrugs

組別Groups訶子Terminalia chebula矮紫堇Corydalis hendersonii甘青烏頭Aconitum tanguticum利巴韋林Ribavirin最大藥物安全濃度/(mg·mL-1)Maximum safe concentration1180.002半數(shù)中毒濃度CC50/(mg·mL-1)50% cytotoxic concentration6.3837.11642.400.020半數(shù)有效濃度EC50/(mg·mL-1)50% effective concentration0.6130.3673.0590.002治療指數(shù)TITreatment index10.4119.3913.8610.00

2.3 藥物對(duì)BVDV的吸附阻斷作用

藥物對(duì)BVDV吸附阻斷作用的CPE觀察和細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。CPE觀察結(jié)果顯示：藥物預(yù)先處理組與病毒對(duì)照組相比，細(xì)胞病變的程度均沒(méi)有明顯變化。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，4種藥物對(duì)BVDV的有效抑制率均在20%以下，表明訶子、矮紫堇、甘青烏頭和利巴韋林均不能阻止BVDV對(duì)MDBK細(xì)胞的吸附作用。

表3藥物對(duì)BVDV吸附阻斷作用的CPE及CCK8檢測(cè)結(jié)果

Table3TheresultsofadsorptionblockingeffectofdrugsonBVDVbyCPEandCCK8

藥物稀釋倍數(shù)Drugs dilution factor訶子Terminalia chebula矮紫堇Corydalis hendersonii甘青烏頭Aconitum tanguticum利巴韋林RibavirinCPE有效抑制率/%Effective inhibition rateCPE有效抑制率/%Effective inhibition rateCPE有效抑制率/%Effective inhibition rateCPE有效抑制率/%Effective inhibition rate20++++15.07±0.02++++6.90±0.07++++15.67±0.10++++16.76±0.072-1++++13.66±0.02++++6.70±0.04++++12.34±0.04++++11.17±0.082-2++++7.16±0.02++++6.13±0.04++++9.39±0.09++++8.01±0.052-3++++2.86±0.04++++1.72±0.03++++2.38±0.06++++6.28±0.032-4++++1.97±0.02++++1.22±0.07++++1.38±0.02++++5.36±0.02C-100.00-100.00-100.00-100.00V++++0.00++++0.00++++0.00++++0.00

2.4 藥物對(duì)BVDV復(fù)制阻斷作用

藥物對(duì)BVDV復(fù)制阻斷作用的CPE觀察和細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。CPE觀察結(jié)果顯示：病毒預(yù)先處理組與病毒對(duì)照組相比，細(xì)胞病變的程度均沒(méi)有明顯變化。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，3種藏藥對(duì)BVDV的有效抑制率均在15%以下，表明訶子、矮紫堇和甘青烏頭均不能阻斷BVDV在MDBK細(xì)胞中的復(fù)制過(guò)程。而利巴韋林在2 μg·mL-1濃度時(shí)與病毒對(duì)照組相比，細(xì)胞病變程度有所降低，但有效抑制率均小于30%，表明該作用方式下的利巴韋林對(duì)BVDV則有微弱的復(fù)制阻斷作用。

表4藥物對(duì)BVDV復(fù)制阻斷作用的CPE及CCK8檢測(cè)結(jié)果

Table4TheresultsofreplicationblockingeffectofdrugsonBVDVbyCPEandCCK8

藥物稀釋倍數(shù)Drugs dilution factor訶子Terminalia chebula矮紫堇Corydalis hendersonii甘青烏頭Aconitum tanguticum利巴韋林RibavirinCPE有效抑制率/%Effective inhibition rateCPE有效抑制率/%Effective inhibition rateCPE有效抑制率/%Effective inhibition rateCPE有效抑制率/%Effective inhibition rate20++++7.51±0.04++++13.05±0.03++++14.16±0.07+++27.96±0.022-1++++6.13±0.04++++7.69±0.07++++9.22±0.06++++19.54±0.022-2++++3.85±0.01++++3.72±0.09++++5.13±0.01++++12.55±0.062-3++++3.53±0.04++++2.07±0.06++++2.40±0.07++++6.24±0.072-4++++1.58±0.09++++1.07±0.03++++1.89±0.02++++4.95±0.02C-100.00-100.00-100.00-100.00V++++0.00++++0.00++++0.00++++0.00

3 討 論

3.1目前，國(guó)內(nèi)外研究抗病毒藥物的治療效果通常采用CPE、病毒蝕斑技術(shù)和MTT比色分析等方法[22-24]。CPE觀察法比較直觀，但存在一定的主觀性、靈敏度低，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；MTT比色分析法采用染色法檢測(cè)吸光度值的變化來(lái)判斷細(xì)胞活性，可快速、靈敏地對(duì)藥效進(jìn)行定量分析[25]。而CCK-8試劑盒是一種MTT的升級(jí)替代品，比MTT更加穩(wěn)定且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯的毒性，等比線性范圍更寬，試驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定、靈敏[26]。故本研究采用CPE觀察法和CCK8檢測(cè)相結(jié)合的方法來(lái)進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)和抗病毒藥效學(xué)試驗(yàn)，更加客觀地評(píng)價(jià)藥物的抗病毒作用效果。

3.2我國(guó)的傳統(tǒng)中醫(yī)藥有著很長(zhǎng)的發(fā)展歷史，在抗病毒研究領(lǐng)域中已取得很大進(jìn)展。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，訶子的種子提取物對(duì)HIV-1、單純皰疹病毒(HSV-1)、流感病毒、柯薩奇病毒B3、B5(CVB3、CVB5)等均具有一定抑制作用[19,27]；甘青烏頭的提取物可抑制HSV-2病毒復(fù)制周期的各個(gè)環(huán)節(jié)[28]，其二萜生物堿在體外對(duì)H1N1有明顯的抑制作用[29]；紫堇屬植物中分離得到生物堿成分也具有一定的抗病毒作用[30]。為深入探討3種藏藥的抗BVDV作用，本研究采用3種不同作用方式進(jìn)行體外抗病毒藥效學(xué)試驗(yàn)。結(jié)果表明，藏藥訶子、矮紫堇、甘青烏頭及利巴韋林在藥物與病毒直接滅活作用的方式下均有較高的抑制率，分別為52.43%、72.86%、56.87%和51.06%，治療指數(shù)TI分別為10.41、19.39、13.86和10.00，表明4種藥物對(duì)BVDV均具有一定的直接殺傷作用，這與邱翔宇等[16]和郭志廷等[14]的研究報(bào)道基本相符；而在先加藥后加病毒、先加病毒后加藥兩種作用方式下的有效抑制率均小于30%，表明4種藥物對(duì)病毒的復(fù)制阻斷作用和吸附阻斷作用并不明顯，這與郭志廷等[14]報(bào)道的結(jié)果大致相符，而與郝寶成等[15]和邱翔宇等[16]的研究結(jié)果存在一定差異，推測(cè)可能與藥物的種類(lèi)、試驗(yàn)的條件、病毒的宿主來(lái)源有關(guān)。

3.3利巴韋林又名病毒唑，為廣譜抗病毒藥。該藥對(duì)許多DNA和RNA病毒有抑制作用，如流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型肝炎病毒、皰疹病毒、乙型肝炎病毒等[31-32]。臨床上通常用于治療流行性腮腺炎、流感病毒引起的呼吸道感染以及聯(lián)合聚乙二醇干擾素治療丙型肝炎等[33]。本研究選擇利巴韋林作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)供試藥物的抗病毒抑制效果。通過(guò)比較藥物抗病毒有效抑制率和治療指數(shù)，3種藏藥中矮紫堇的抗病毒有效率要顯著高于利巴韋林，而訶子和甘青烏頭則與利巴韋林相接近，表明藏藥矮紫堇的直接殺滅病毒作用要好于訶子、甘青烏頭和利巴韋林。

4 結(jié) 論

利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、利巴韋林做陽(yáng)性對(duì)照藥物首次探討了3種藏藥的體外抗BVDV作用。結(jié)果表明，3種藏藥對(duì)BVDV均有一定的抑制作用，且對(duì)病毒的直接殺滅作用均好于吸附阻斷作用和復(fù)制阻斷作用。其中，矮紫堇抑制效果最佳，優(yōu)于訶子、甘青烏頭及利巴韋林，未來(lái)將對(duì)其抗病毒作用機(jī)制做進(jìn)一步研究。