付言峰, 李 蘭, 趙為民, 方曉敏, 李碧俠, 王學(xué)敏, 周李生, 任守文

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái),南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所,南京 210014)

產(chǎn)仔數(shù)是豬育種中母豬生產(chǎn)性能測(cè)定的一個(gè)重要指標(biāo)，也是一個(gè)十分重要的繁殖性狀和經(jīng)濟(jì)性狀[1-2]。由于豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀遺傳力(0.10～0.15)非常低和性別限制，所以用傳統(tǒng)的選擇手段進(jìn)行豬產(chǎn)仔數(shù)的育種比較困難[3-4]。產(chǎn)仔數(shù)受許多因素的影響，其中胚胎附植是一個(gè)重要影響因素，因?yàn)榇蟛糠峙咛?huì)在豬胚胎附植期(妊娠13～24 d)死亡，所以這一時(shí)期成為影響豬產(chǎn)仔數(shù)的重要時(shí)期，如何減少這一時(shí)期的胚胎死亡成為亟待解決的問(wèn)題[5]。

豬胚胎附植開(kāi)始于妊娠第12～14天[5-6]，在第18 天進(jìn)入附植高峰[7]，在第24天左右結(jié)束[8]。在胚胎附植過(guò)程中，卵巢分泌一些物質(zhì)，使子宮發(fā)育到胚胎附著的接受狀態(tài)，胚泡再根據(jù)子宮內(nèi)膜附植點(diǎn)的信號(hào)著床[9]。在妊娠30 d時(shí)，用6頭高育種值母豬和6頭低育種值母豬進(jìn)行了卵巢基因表達(dá)分析，鑒定了27個(gè)差異表達(dá)基因與豬產(chǎn)仔數(shù)QTL緊密關(guān)聯(lián)[10]。另外，在胚胎附植過(guò)程中給母豬注射雌激素，鑒定出一些由于破壞妊娠而導(dǎo)致的異常基因表達(dá)[11]。盡管胚胎附植對(duì)產(chǎn)仔數(shù)有影響，但目前人們對(duì)豬的胚胎附植準(zhǔn)確調(diào)控機(jī)制了解甚少。梅山豬是優(yōu)秀的高繁中國(guó)本土品種[12]，具有產(chǎn)仔數(shù)多、泌乳能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn),妊娠第30天的梅山豬胚胎死亡率(21%)比大白豬(45%)低很多[13]，這就說(shuō)明，高繁母豬的胚胎附植率更高[14-15]。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，為人們進(jìn)一步挖掘豬胚胎附植關(guān)鍵基因提供了新的途徑[16]。

本研究以梅山豬為試驗(yàn)動(dòng)物，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing, RNA-seq)分析豬胚胎附植卵巢中期和后期差異表達(dá)基因，獲得了一些有意義的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院梅山豬保種場(chǎng)，以胚胎附植期的梅山豬母豬(第5～7胎次)為研究對(duì)象，按豬場(chǎng)常規(guī)進(jìn)行飼喂和管理，同時(shí)在自由采食及飲水條件下，注意進(jìn)行疾病的防治和行為體況的觀察。在同場(chǎng)、相同管理?xiàng)l件下進(jìn)行單圈飼養(yǎng)，進(jìn)行同期發(fā)情處理，用相同種公豬配種兩次,以最后一次配種為0 d計(jì)，在妊娠第18(附植中期)和24 天(附植后期)進(jìn)行屠宰，各屠宰2頭，采集卵巢組織樣，立即放置于液氮保存。

1.2 RNA提取與檢測(cè)

采用TRIzol /氯仿方法[17]從豬卵巢組織中提取總RNA，之后用超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo NANODROP 2000 Spectrophotometer, USA)檢測(cè)RNA濃度，再用1.5%的瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性。RNA質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.2，OD260 nm/OD230 nm為1.7～2.2，RNA電泳出現(xiàn)18S和28S兩條帶，條帶清晰，無(wú)降解(圖略)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)流程

采用illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)的雙端100 bp 測(cè)序模式對(duì)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)引物與adaptor序列去除,最終保留高質(zhì)量的堿基片段。保留的序列(remained reads)片段用于后續(xù)RNA-Seq進(jìn)行模塊分析。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程：1)根 據(jù)堿基質(zhì)量控制與過(guò)濾及Read長(zhǎng)度范圍控制對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制篩查；2)與參考基因組(NCBI,SusscrofaScrofa11.1)進(jìn)行外顯子、內(nèi)含子、UTR非編碼區(qū)，上、下游調(diào)控區(qū)進(jìn)行基因組比對(duì)，進(jìn)而進(jìn)行基因表達(dá)量分析和基因差異表達(dá)分析。差異基因表達(dá)分析以后，又分成兩個(gè)流程：1)依次進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)識(shí)別、基因結(jié)構(gòu)模型的識(shí)別優(yōu)化、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量計(jì)算分析、轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)分析、轉(zhuǎn)錄本功能預(yù)測(cè)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析；2)生物通路(代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)分析預(yù)測(cè)、GO分子功能注釋和GO功能富集度分析，采用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes，www.genome.jp/kegg/)生物通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集度分析(enrichment analysis)。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)的基因組比對(duì)

將樣本預(yù)處理后，序列與參考基因組序列進(jìn)行全基因組序列比配，計(jì)算序列的全基因組覆蓋情況和RNA的表達(dá)量。序列比配需要考慮到RNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用Tophat軟件完成基因組比配。比配參數(shù)和比配的條件：1)允許2個(gè)錯(cuò)配堿基模式；2)允許每個(gè)read測(cè)序序列最多20個(gè)最優(yōu)比配記錄；3)考慮可變剪切情況，分割片段區(qū)域(segment) 的分段長(zhǎng)度設(shè)定等于read長(zhǎng)度的1/2；4)允許分段內(nèi)錯(cuò)配堿基數(shù)目最多2 bp；5)最大插入和刪除長(zhǎng)度設(shè)定為3 bp；6)可變剪接位置比配要求0錯(cuò)配，即保證完全比配；7)最小異構(gòu)體比例系數(shù)(min isoform-fraction)設(shè)定為0.15。該設(shè)置含義：如果有跨越2個(gè)外顯子的跳躍(junction)由S個(gè)測(cè)序片段所覆蓋，假設(shè)讓外顯子A的平均測(cè)序深度為D，比B的平均測(cè)序深度高。如果S/D<設(shè)定的最小異構(gòu)體比例系數(shù)(設(shè)置為0.15),則不認(rèn)為當(dāng)前存在外顯子跳躍(junction)存在。8)最小內(nèi)含子長(zhǎng)度(minimum intron length)設(shè)置為50 bp；9)最大內(nèi)含子長(zhǎng)度(maximum intron length)設(shè)置為50 kb； 10)對(duì)跳躍(junction)探測(cè)的比配條件允許最多40個(gè)最優(yōu)比配記錄，允許2 bp錯(cuò)配。

1.5 已知基因表達(dá)量和差異性計(jì)算分析

采用將序列拼裝比配在基因組序列上，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法估算編碼RNA表達(dá)量及用于后續(xù)樣本差異表達(dá)量比較分析。通過(guò)Tophat軟件對(duì)cDNA、mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(RNA-Seq)reads的基因組比配，獲得可針對(duì)剪切位點(diǎn)比配的基因組比配數(shù)據(jù)(spliced alignments)。對(duì)于兩端測(cè)序片段(paired-end RNA-Seq)；通過(guò)參考基因區(qū)域內(nèi)比配read標(biāo)準(zhǔn)化算法(Cufflinks軟件，版本號(hào)：2.2.1)對(duì)每個(gè)片段做獨(dú)立比配處理，該算法在拼接過(guò)程中將疊加的比配片段進(jìn)行聯(lián)通，最后估計(jì)拼接轉(zhuǎn)錄本的豐度，即表達(dá)量。RNA表達(dá)量計(jì)算采用FPKM計(jì)算度量指標(biāo)(FPKM- fragments per kilobase of transcript extro per million fragments mapped)。FPKM含義：以每百萬(wàn)比配序列每1 kb長(zhǎng)度作RNA表達(dá)量指標(biāo)，其中轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度和總比配read數(shù)目用于歸一化表達(dá)量數(shù)值。在差異表達(dá)分析部分所計(jì)算的表達(dá)量，筆者采用的參數(shù)設(shè)置是考慮基于RNA注釋坐標(biāo)兼容并符合比配要求的read序列，即compatible-hits-norm模式(兼容比配表達(dá)量計(jì)算模式)。

筆者將試驗(yàn)樣本(條件)之間的lg ratio與其中某個(gè)條件表達(dá)量的lg值作比較。假設(shè)轉(zhuǎn)錄本a和b表達(dá)量的比值為Y (Y=FPKMa/FPKMb),兩條件下表達(dá)量的比值Y的對(duì)數(shù)值(lgY)可以作為檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，采用負(fù)伯努利分布計(jì)算檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量T(T=E (lgY)/Var (lgY), E為期望值，Var為變異方差),得出差異表達(dá)顯著值。此計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)方法和計(jì)算表達(dá)量的方法具有高度的靈敏性。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量系列評(píng)估結(jié)果表明，胚胎附植中期卵巢(卵_18 d)和后期卵巢(卵_24 d)的組織樣測(cè)定出的序列中，常見(jiàn)基因序列按照占比大小，卵_18 d樣品：外顯子編碼序列(CDS_exons，42.81%)、內(nèi)含子(introns，16.82%)、3′-外顯子非翻譯區(qū)(3′UTR_exons，8.03%)和5′-外顯子非翻譯區(qū)(5′UTR_exons 5.82%)，卵_24 d樣品：CDS_exons(47.60%)、3′UTR_exons (7.63%)、Introns (7.18%)和5′UTR_exons (5.93%)。

基因組各分段測(cè)序數(shù)量分布結(jié)果表明，兩個(gè)樣品(卵_18 d和卵_24 d)的曲線(xiàn)圖基本一致，都是先升高后降低，峰值出現(xiàn)的地方一致，測(cè)序數(shù)(read number)從基因全長(zhǎng)(5′→3′)5%左右陡增，在40%的時(shí)候有一個(gè)急速降低，隨之到70%的時(shí)候達(dá)到峰值，然后快速下降。即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序覆蓋了基因組95%(從5%～100%)的序列，且在覆蓋的基因組中，每一段的測(cè)序數(shù)量大都在200 000～350 000(圖1 A, B)。A、T、G、C 4堿基頻率結(jié)果表明，兩個(gè)樣品(卵_18 d和卵_24 d)所測(cè)序列前10個(gè)堿基的核苷酸頻率波動(dòng)比較大，之后趨于平穩(wěn)，其中卵_18 d的C和G兩堿基的核苷酸頻率始終高于A和T兩堿基，平均高于0.2(圖1 C)；卵_24 d的A、T、G和C堿基的核苷酸頻率則始終纏在一起，維持在0.24～0.26(圖1 D)。

A、B. 卵_18 d和卵_24 d基因組各分段測(cè)序數(shù)量分布；C、D. 卵_18 d和卵_24 d基因測(cè)序序列A、T、G和C 4堿基頻率A, B.Quantity distribution of reads for genome of ovary_18 d and ovary_24 d；C, D.Frequency of A, T, G, C for reads of ovary_18 d and ovary_24 d圖1 質(zhì)量控制分析Fig.1 Results of quality control analysis

2.2 外顯子和內(nèi)含子測(cè)序比配

RNA-seq可以獲得基因組序列的類(lèi)別：正義外顯子、反義外顯子、正義內(nèi)含子、反義內(nèi)含子、正義3′-非編碼區(qū)、反義3′-非編碼區(qū)、正義5′-非編碼區(qū)、反義5′-非編碼區(qū)、正義編碼序列、反義編碼序列、正義下游1 kb、反義下游1 kb、正義上游1 kb和反義上游1 kb，14類(lèi)別在餅形圖中按順時(shí)針依次排列(圖2 A, B)。表明，胚胎附植中期卵巢(卵_18 d)和后期卵巢(卵_24 d)兩個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果中，各類(lèi)別所占比例有相同，也有不同。其中，相同點(diǎn)：正義外顯子和反義外顯子類(lèi)別所占比例最大，且份額基本相等，二者之和(全部外顯子)約占總類(lèi)別1/3，其次為反義編碼序列和正義編碼序列；不同點(diǎn)：卵_18 d的正義內(nèi)含子和反義內(nèi)含子所占比例(10%，9%)比卵_24 d的(7%，7%)大，同時(shí)卵_18 d的正義上游1 kb和反義上游1 kb所占比例(4%，3%)比卵_24 d的大(3%，3%)。

RNA-seq分別獲得胚胎附植中期卵巢(卵_18 d)和后期卵巢(卵_24 d)組織樣14 579 752和13 119 531個(gè)測(cè)序序列(reads)。其中卵_18 d在6號(hào)染色體中得到的reads最多，其次是14、1、7、16、M、2號(hào)染色體；卵_24 d在1號(hào)染色體中得到的reads最多，其次是7、14、M、2、4、6號(hào)染色體(圖2 C, D)，這說(shuō)明卵巢在豬胚胎附植兩個(gè)時(shí)期reads所在位置有較大的差異，即兩個(gè)時(shí)期的表達(dá)基因存在較大的差異。正義序列(sense reads)指的是基因組正義鏈中的比配序列數(shù)量，反義序列(antisense reads)指的是基因組反義鏈中的比配序列數(shù)。結(jié)果表明，胚胎附植期卵_18 d和卵_24 d兩個(gè)組織樣的表達(dá)基因檢測(cè)到的外顯子序列最多，即大部分檢測(cè)的基因都在豬胚胎附植中期和后期發(fā)揮著作用，且附植中期的主效調(diào)控基因可能位于6號(hào)染色體，附植后期的主效調(diào)控基因可能位于1號(hào)染色體。

A、C.卵_18 d；B、D.卵_24 dA, C. Ovary_18 d; B,D.ovary_24 d圖2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的基因組序列分類(lèi)(A、B)和在基因組各染色體測(cè)到的序列數(shù)量(C、D)Fig.2 Classification (A,B)of genomic sequence and genome alignment counts distribution(C,D) in each chromosome by RNA-seq

2.3 豬胚胎附植中期和后期卵巢基因表達(dá)量檢測(cè)

豬胚胎附植中期卵巢(卵_18 d)和后期卵巢(卵_24 d)兩個(gè)組織樣分別檢測(cè)出16 159個(gè)和16 373個(gè)有表達(dá)量的基因，卵_18 d和卵_24 d的基因表達(dá)量最高值分別為2.96×106和2.97×106，基因表達(dá)量最低值分別為3.44×10-231和1.05×10-260，平均值分別為955.31和1 075.62。這些結(jié)果表明，豬胚胎附植后期卵巢(卵_24 d) 相較于中期卵巢(卵_18 d)，有更多的基因表達(dá)，且基因的表達(dá)量更高(無(wú)論是平均數(shù)還是峰值)；卵_18 d有1 198個(gè)基因的表達(dá)量高于100，卵_24 d的為1 357個(gè)；卵_18 d有316個(gè)基因的表達(dá)量高于500，卵_24 d的為394個(gè)；卵_18 d有159個(gè)基因的表達(dá)量高于1 000，卵_24 d的為209個(gè)；卵_18 d有46個(gè)基因的表達(dá)量高于1 000，卵_24 d的為53個(gè)。

兩個(gè)組織樣中最高表達(dá)量的基因是同一個(gè)基因，為EN19669，位于線(xiàn)粒體中(序列位點(diǎn)：6 443～6 509)，該基因在卵_18 d和卵_24 d中的表達(dá)量：2.96×106和2.97×106。兩個(gè)組織樣中表達(dá)量最高的已知基因也相同:MT-ATP8，位于線(xiàn)粒體染色體中(序列位點(diǎn)：8 958～9 162)，在卵_18 d和卵_24 d中的表達(dá)量：129 142和104 391。卵_18 d組織樣中表達(dá)量排前13位的基因均位于線(xiàn)粒體中，表達(dá)量第14位(染色體中第1位)的位于14號(hào)染色體中，為EN11278(序列位點(diǎn)：79 769 815～79 769 890)，表達(dá)量前50位的基因中，有35個(gè)基因位于線(xiàn)粒體中。卵_24 d組織樣中表達(dá)量排前12位的基因均位于線(xiàn)粒體中，表達(dá)量第13位(染色體中第1位)的位于14號(hào)染色體中，為EN11278基因(與卵_18 d相同)，表達(dá)量前50位的基因中，有34個(gè)基因位于線(xiàn)粒體中。兩個(gè)時(shí)期卵巢組織樣中表達(dá)量前50位的基因中，線(xiàn)粒體基因占了≥60%，即線(xiàn)粒體基因很可能在豬胚胎附植調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

2.4 豬胚胎附植中期和后期卵巢差異表達(dá)基因

分析豬胚胎附植中期卵巢(卵_18 d)和后期卵巢(卵_24 d)兩個(gè)組織樣之間有2 682個(gè)顯著差異表達(dá)基因(P<0.05)，包含1 998個(gè)上調(diào)基因和684個(gè)下調(diào)基因(圖3A)；顯著差異表達(dá)基因中又包含684個(gè)極顯著差異表達(dá)基因(P<0.01,q<0.05),分別為581個(gè)上調(diào)基因和103個(gè)下調(diào)基因(卵_24 d相較于卵_18 d) (圖3A, B, D)。圖3C中卵_18 d和卵_24 d樣品檢測(cè)出差異表達(dá)基因的表達(dá)量均呈中間大、兩頭小的分布，且前者的平均表達(dá)量低于后者?；鹕綀D表明，卵_18 d和卵_24 d之間有比較多的顯著差異表達(dá)基因(紅點(diǎn))(圖3 D)，熱圖表明豬胚胎附植卵巢中期和后期差異表達(dá)基因的mRNA表達(dá)量大多為10～100(101～102)(圖3 E)。

卵_18 d和卵_24 d之間差異最大的基因?yàn)镋N19684，位于線(xiàn)粒體中(序列位點(diǎn)：12 805～12 864)，差異最大的染色體基因?yàn)镋N11278，位于14號(hào)染色體中(序列位點(diǎn)：79 769 815～79 769 890)，差異最大的已知基因?yàn)門(mén)IMP1，位于X染色體中(序列位點(diǎn)：42 058 788～42 110 182)。

2.5 豬胚胎附植中期和后期卵巢差異表達(dá)基因GO功能富集分析

對(duì)胚胎中期和后期的卵巢組織差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集，生物學(xué)過(guò)程結(jié)果表明(圖4A)：卵巢兩個(gè)時(shí)期之間的差異表達(dá)基因有2 954個(gè)富集的生物學(xué)過(guò)程(BP)，其中前38個(gè)為顯著富集(P<0.05)，前12位(P=0)顯著富集的生物學(xué)過(guò)程分別為內(nèi)皮細(xì)胞活化、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性的調(diào)節(jié)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖分解代謝過(guò)程、建立平面極性的蛋白質(zhì)定位、膜組件、維持蛋白質(zhì)在質(zhì)膜中的位置、長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝過(guò)程、過(guò)氧化物酶體的長(zhǎng)鏈脂肪酸輸入、雙鏈斷裂修復(fù)的正調(diào)控、蛋白多糖的分解代謝過(guò)程、硫化合物分解代謝過(guò)程和維持蛋白質(zhì)在膜中的位置。

細(xì)胞學(xué)分區(qū)結(jié)果表明(圖4)，卵巢兩個(gè)時(shí)期(胚胎附植中期和后期)之間的差異表達(dá)基因有381個(gè)富集的細(xì)胞學(xué)分區(qū)(CC)，其中前19個(gè)為顯著富集(P<0.05)，前13位(P=0)顯著富集的細(xì)胞學(xué)分區(qū)：含液泡膜的共生體、含液膜的共生體、宿主細(xì)胞質(zhì)、宿主細(xì)胞部分、宿主細(xì)胞內(nèi)部分、宿主細(xì)胞質(zhì)部分、體外空間、宿主細(xì)胞內(nèi)區(qū)域、宿主細(xì)胞、其他有機(jī)體、其他有機(jī)體細(xì)胞和其他有機(jī)體部分。分子功能結(jié)果表明，卵巢兩個(gè)時(shí)期之間的差異表達(dá)基因有630個(gè)富集的分子功能(MF)，其中前16個(gè)為顯著富集(P<0.05)，前6位(P=0)顯著富集的分子功能分別為FAD-AMP裂解酶(環(huán)化)活性、三磷酸酶活性、過(guò)氧化物酶體脂肪?；?CoA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、脂肪?；D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和脂肪?；?CoA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。

2.6 豬胚胎附植中期和后期卵巢差異表達(dá)基因Pathway分析

Pathway (生物通路)分析采用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes，www.genome.jp/kegg/)生物通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集度分析(enrichment analysis)。對(duì)卵巢組織胚胎中期和后期的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物通路(pathway)分析，結(jié)果表明(圖5)，卵巢兩個(gè)時(shí)期(胚胎附植中期和后期)之間的差異表達(dá)基因在185條生物通路上存在差異，其中有7條生物通路上存在極顯著差異(P<0.01)，它們依次為PI3K-Akt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、晝夜周期、乙型肝炎通路、2-氧代羧酸代謝、HIF-1信號(hào)通路和化學(xué)致癌作用系統(tǒng)，接下來(lái)(0.3

A～E.上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)、差異基因mRNA表達(dá)量散點(diǎn)圖、盒形圖、火山圖和熱圖A-E.Number of up-regulated DEGs and down-regulated DEGs,scatter plots of DEGs mRNA expression intensity, box plots,volcano, heat maps圖3 豬胚胎附植中期(卵_18 d)和后期(卵_24 d)卵巢組織差異表達(dá)基因分布Fig.3 Distribution of differentially expressed genes (DEGs) between ovary_18 d and ovary_24 d

3 討 論

提高胚胎附植時(shí)期胚胎存活率是提高豬產(chǎn)仔數(shù)的一個(gè)重要措施[14-15]，另外豬的胚胎附植階段比人長(zhǎng)很多，且沒(méi)有侵入子宮上皮細(xì)胞，這使豬成為一個(gè)很好的模式動(dòng)物，用于研究人的胚胎附植期相關(guān)疾病[18]。研究胚胎附植需要找到這一繁殖活動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)控基因，RNA-seq(轉(zhuǎn)錄組測(cè)序)技術(shù)為這個(gè)研究提供了新的機(jī)會(huì)[19]。豬的胚胎附植開(kāi)始于妊娠第13～14 天，妊娠第18～24 天附植完成[5，8]。本研究中，成功測(cè)定了梅山豬妊娠第18 天(胚胎附植中期)和第24 天(胚胎附植后期)卵巢組織樣中的差異表達(dá)基因，這些結(jié)果可以幫助人們了解關(guān)鍵基因調(diào)控豬胚胎著床，發(fā)現(xiàn)更多的影響胎仔數(shù)的候選基因，這些基因可以用于動(dòng)物育種中的標(biāo)記輔助選擇(MAS)[20]。

圖4 豬胚胎附植中期(Day 18)和后期(Day 24)卵巢組織差異表達(dá)基因的GO注釋分布Fig.4 GO annotation distribution of differential expression genes between ovary_18 d and ovary_24 d detected by RNA-seq

圖5 豬胚胎附植中期(Day 18)和后期(Day 24)卵巢組織差異表達(dá)基因的生物通路注釋Fig.5 Pathway annotation distribution of differential expression genes between tissues of ovary_18 d and ovary_24 d detected by RNA-seq

外顯子和內(nèi)含子測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，胚胎附植期卵_18 d和卵_24 d兩個(gè)組織樣的表達(dá)基因檢測(cè)到的外顯子序列最多，即大部分檢測(cè)的基因都在豬胚胎附植中期和后期發(fā)揮著作用，且附植中期的主效調(diào)控基因有可能在6號(hào)染色體，附植后期的主效調(diào)控基因有可能在1號(hào)染色體。研究表明，在豬6號(hào)染色體上可能存在影響窩產(chǎn)仔數(shù)的QTL[21]和一個(gè)可終止胎兒發(fā)育的基因或基因群[22]；影響豬產(chǎn)仔數(shù)的雌激素受體基因(ESR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF1R)均位于1號(hào)染色體上[23]，且ESR與IGF1R基因的表達(dá)量與排卵數(shù)呈顯著相關(guān)[24]。

基因表達(dá)量結(jié)果表明，豬胚胎附植后期卵巢(卵_24 d) 相較于中期卵巢(卵_18 d)，有更多的基因表達(dá)，且基因的表達(dá)量更高；兩個(gè)時(shí)期卵巢組織中表達(dá)量前50位的基因中，線(xiàn)粒體基因占了60%以上，即線(xiàn)粒體基因在豬胚胎附植調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。兩個(gè)組織樣中最高表達(dá)量的基因是同一個(gè)基因，為EN19669，表達(dá)量最高的已知基因也相同，為MT-ATP8，兩個(gè)基因均位于線(xiàn)粒體中。MT-ATP8的功能為參與ATP的合成從而為細(xì)胞發(fā)育提供能量[25]。線(xiàn)粒體是哺乳動(dòng)物卵子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育中的發(fā)育調(diào)節(jié)的一個(gè)連接點(diǎn)[26]，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體在胚胎植入前和胚胎干細(xì)胞中發(fā)揮作用[27]。在小鼠中，高水平的線(xiàn)粒體代謝對(duì)頭部發(fā)育至關(guān)重要[28]。差異表達(dá)基因分析結(jié)果表明，豬胚胎附植中期卵巢(卵_18 d)和后期卵巢(卵_24 d)兩個(gè)組織樣之間有2 682個(gè)顯著差異表達(dá)基因(P< 0.05)，包含1 998個(gè)上調(diào)基因和684個(gè)下調(diào)基因；顯著差異表達(dá)基因中又包含684個(gè)極顯著差異表達(dá)基因(P<0.05,Q<0.05),包含581個(gè)上調(diào)基因和103個(gè)下調(diào)基因。這說(shuō)明附植中期和后期卵巢組織同一基因的表達(dá)量出現(xiàn)了很大的變化，85%的基因表達(dá)上調(diào)，這些上調(diào)的基因很可能與母豬妊娠建立有關(guān)[16]。

前3位顯著富集的生物學(xué)過(guò)程：內(nèi)皮細(xì)胞活化、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性的調(diào)節(jié)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖分解代謝過(guò)程，研究表明，這幾種生物學(xué)過(guò)程對(duì)胚胎植入過(guò)程中的胚胎生長(zhǎng)和母體組織重構(gòu)是必不可少的[29-30]；細(xì)胞學(xué)區(qū)分為宿主細(xì)胞質(zhì)、宿主細(xì)胞部分、宿主細(xì)胞內(nèi)部分，這與豬卵巢內(nèi)卵泡成熟和排卵的生理活動(dòng)相一致；分子功能：FAD-AMP裂解酶(環(huán)化)活性、三磷酸酶活性、過(guò)氧化物酶體脂肪?；?CoA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。胚胎附植是一種磷脂酸結(jié)合過(guò)程，由各種激素調(diào)節(jié)胎兒發(fā)育和改變母體的生理機(jī)能，以支持懷孕[31]。卵巢兩個(gè)時(shí)期(胚胎附植中期和后期)之間的差異表達(dá)基因在185條 生物通路上存在差異，其中前3位極顯著差異的生物通路依次為PI3K-Akt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、晝夜周期。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，豬胚胎附植中期的主效調(diào)控基因有19%位于6號(hào)染色體，附植后期的主效調(diào)控基因有14%位于1號(hào)染色體；相對(duì)于附植中期，卵巢更側(cè)重于胚胎附植后期的調(diào)控；線(xiàn)粒體基因在豬胚胎附植調(diào)控中發(fā)揮著重要作用；卵巢附植中期和后期差異表達(dá)基因功能以?xún)?nèi)皮細(xì)胞活化為主，生物通路以PI3K-Akt信號(hào)通路為主。