孫 武，羅 靜， 李發(fā)弟，2，李萬宏，樂祥鵬*

(1. 蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室,蘭州大學農業(yè)農村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室,蘭州大學草地農業(yè)科技學院,蘭州 730020； 2. 甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，民勤 733300)

睪丸作為雄性哺乳動物特有的生殖器官，具有生成精子、分泌雄性激素等重要功能，其正常的結構和生理機能是繁殖活動的基礎。此外，公畜睪丸大小，一般以陰囊周長(scrotal circumference，SC)來表示，因其測量簡單，遺傳力高，選擇效果好等優(yōu)點成為遺傳改良公畜及其半同胞母畜的一個重要指標[1-3]。在不同的哺乳動物中，均發(fā)現(xiàn)睪丸大小與射精量、精子密度、精子活力等呈顯著正相關，與精子畸形率緊密負相關[1, 4-5]。鑒于睪丸大小的遺傳力高達0.67[6]，因此通過睪丸大小對種公畜進行選擇被認為是遺傳改良群體固有繁殖力最快和最有效的方法。睪丸的發(fā)育是一個高度復雜而精密的過程，涉及生殖細胞的增殖分化、支持細胞和間質細胞的發(fā)育與成熟等[7]，成為動物繁殖學領域的一項重大課題。

近些年來，隨著生物科學技術的不斷進步，各種組學技術日新月異，以mRNA、miRNA、lncRNA、piRNA等為主的轉錄組學研究得到了廣泛關注。研究證實它們在機體生長、發(fā)育和凋亡等過程中具有重要的調控意義[8]。同機體其它器官和組織一樣，睪丸的正常發(fā)育和精子生成也會受到蛋白編碼基因和非編碼RNA的嚴格調控。目前，哺乳動物睪丸發(fā)育相關mRNA、miRNA、lncRNA和piRNA等為主的測序以及對睪丸發(fā)育精子生成起調控作用的分子功能研究已經被廣泛報道。本文綜述了近年來睪丸發(fā)育相關mRNA、miRNA、lncRNA和piRNA等的研究進展，以期為后續(xù)科學研究以及生產實踐提供參考和理論依據(jù)。

1 睪丸發(fā)育過程mRNA的鑒定及差異表達研究

揭示哺乳動物睪丸發(fā)育機制首要工作是得到其完整的睪丸mRNA表達譜。近幾年來，RNA-seq技術的發(fā)展對揭示各種生物發(fā)育過程mRNA的動態(tài)變化機制十分奏效，尤其是哺乳動物睪丸發(fā)育的研究。睪丸發(fā)育過程mRNA表達譜的鑒定主要集中于小鼠、人類、豬、牛。睪丸發(fā)育過程中比較重要的兩個階段是性成熟前包括胎兒期、幼年期和性成熟后[9]。性成熟前，睪丸組織的支持細胞、間質細胞和生精細胞都處于快速增殖分化狀態(tài)，而性成熟之后增殖狀態(tài)進入平臺期。Gong等[10]對6日齡、4周齡和10周齡小鼠睪丸組織進行RNA-seq研究，鑒定出18 837個基因，并且幼齡期睪丸基因表達模式顯著的區(qū)別于性成熟期和成年期，發(fā)現(xiàn)絕大部分差異表達基因均與睪丸發(fā)育及精子發(fā)生相關，其中篩選到的差異表達基因VIM(vimentin)隨著發(fā)育階段的推后表達量逐步降低，在小鼠、豬、人等物種中都發(fā)現(xiàn)類似的結論。該基因屬于支持細胞與間質細胞的細胞骨架成分，故推測其參與支持細胞-生精細胞間的物質和信息交流，對精子發(fā)生及維持支持細胞形態(tài)起重要作用[11]。在4周齡小鼠睪丸中超高表達的INSL3 (insulin-like factor 3)，是間質細胞產生的一種激素，與睪丸引帶發(fā)育和睪丸下降有關[12]。Pitia等[13]以牛、綿羊和山羊為研究對象，進一步探討INSL3基因對睪丸發(fā)育以及精子功能的影響，結果表明，正常公牛睪丸INSL3的表達水平顯著高于低繁殖力公牛(P<0.05)，并且通過HE染色進一步發(fā)現(xiàn)其在低繁殖力公牛精母細胞中表達水平顯著低于高繁殖力公牛(P<0.05)。這些證據(jù)表明，INSL3可以作為早期公畜選擇的候選基因。Ran等[14]分別對60和90胚齡豬胚胎、產后30和180日齡豬的睪丸組織進行RNA-Seq分析，鑒定出8 343個差異表達基因，通過GO富集分析得到了與睪丸發(fā)育相關的重要候選基因(SOX9、GATA4、FOG2、INHBA、Sry、SPAG6、RanBP9、TGF-β家族)以及調控睪丸發(fā)育、精子生成的一些重要通路(MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin、PI3K-Akt)。Song等[15]對產后60和180日齡大白豬的睪丸組織進行RNA-seq，鑒定出242個參與精子發(fā)生的關鍵基因，包括PIWIL、SPATA、KIT、INHBA、SPAG6、RanBP9等。大量研究證實[16]，INHBA基因在性成熟前表達量顯著地高于性成熟后，并且對生殖細胞和間質細胞的物質交流很重要。Parker等[17]利用GWAS方法揭示INHBA基因的一個SNP(rs6279141)與小鼠睪丸重量顯著關聯(lián)(P=4.51×10-18)，推測該基因可以顯著影響小鼠睪丸形態(tài)發(fā)生，睪丸細胞增殖和睪丸重量。這些研究暗示，INHBA基因可能是決定睪丸發(fā)育的重要候選分子。RanBP9基因對雄性生殖細胞發(fā)育和雄性生育能力有重要作用[18]。將RanBP9敲除后，RanBP9-/-雄性小鼠在發(fā)育過程中出現(xiàn)精原細胞的增殖能力顯著下降、生精小管管腔變小、生殖細胞迅速減少甚至消失等現(xiàn)象。

Li等[19]利用高通量測序技術(next generation sequencing, NGS)對兩個豬品種性成熟前后的睪丸組織進行轉錄組測序，得到了許多決定睪丸發(fā)育以及精子發(fā)生的候選基因，比如SMAD4、c-kit、GPR54等。SMAD4基因通過調節(jié)間質細胞和支持細胞的增殖分化進而調控公畜的生殖系統(tǒng)。c-kit作為生精過程中重要的信號傳遞受體，對生殖細胞(germ cell，GC)的存活、遷移和精原細胞的維持及分化起關鍵作用[20]。GPR54參與下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary gland axis，HPG)生殖調控，通過GnRH調控LH和FSH水平。GPR54基因敲除雄性小鼠表現(xiàn)出睪丸和陰莖不能正常發(fā)育，并且不能產生精子，由此推測，GPR54缺失和突變切斷了GnRH的脈沖性釋放，進而導致動物生殖功能的喪失[21]。

鐘金城等[22]通過RNA-seq對犏牛和牦牛睪丸組織做了比較研究，分別獲得18 529和17 784個蛋白編碼基因，其中共表達基因17 120個，新基因478個，同樣發(fā)現(xiàn)差異表達的基因均與精子發(fā)生相關，包括SPEF2、MBL2等。郭芳等[23]研究表明，SPEF2在初生和成年公牛睪丸組織中差異表達，并且其可變剪切體和功能性SNP位點與公牛精液品質密切相關。白井巖等[24]發(fā)現(xiàn)，公牛MBL2基因多態(tài)性與精液品質及后裔生產性能有顯著關聯(lián)性。同時，將牦牛和犏牛睪丸組織中獲得的差異表達基因進行KEGG分析發(fā)現(xiàn)，32條顯著富集的代謝通路(P< 0.01)，幾乎全部通路均與睪丸發(fā)育過程密切相關[22]。Chang等[25]對牛20日齡、8月齡、2周歲的睪丸組織進行NGS測序，在Y染色體雄性特異區(qū)鑒定到1 274個差異表達轉錄本，并呈現(xiàn)不同的表達模式，表明Y染色體基因可能在睪丸的發(fā)育和雄性繁殖力上起關鍵作用。以上研究表明，哺乳動物睪丸發(fā)育過程存在許多差異表達基因，并且它們存在階段依賴性，蛋白編碼基因可以通過多種作用方式對睪丸發(fā)育起到關鍵的調控作用，通過一些遺傳變異，包括單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)、拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)、插入缺失(insert and deletion, Indel)影響基因表達，進而影響了睪丸發(fā)育過程以及精子生成過程，這種調控作用在物種之間可能具有差異性，其原因推測，可能與哺乳動物的馴化、遷徙、基因滲透、生存環(huán)境顯著相關。

2 睪丸發(fā)育過程miRNA的鑒定及調控

microRNA是一種內源性的非編碼小RNA，通常與靶基因的3′UTR、CDS和5′UTR相結合來負調節(jié)靶基因的轉錄[26-29]。miRNA在不同哺乳動物睪丸發(fā)育及精子發(fā)生過程中扮演重要角色，并且其表達還具有種屬特異性和時間特異性。Sree等[30]對8、16、24日齡小鼠睪丸組織進行NGS測序，并且構建miRNA-mRNA調控網(wǎng)絡，找到一些樞紐miRNA，如miR-34c、miR-221、miR-222、miR-20和miR-106a等。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34c主要表達于粗線期精母細胞和圓形精子細胞，并且可以和精子發(fā)生重要轉錄因子TGIF2和NOTCH2互作，共同調控精子發(fā)生的進程[31]。因此，推測miR-34c是精子發(fā)生的一個關鍵調節(jié)器，miR-34c能夠下調p53通路下游RARG、STRA8與c-MYC的表達，進而抑制奶山羊雄性生殖干細胞的增殖[32-33]。miR-221和miR-222在轉錄后水平負調控c-kit的表達，同時miR-221和miR-222過表達會誘導未分化的精原干細胞轉變?yōu)閏-kit陽性分化的精原細胞[34]。miR-20和miR-106a存在于精原干細胞(spermatogonial stem cell, SSC)，并且通過在轉錄后水平靶向STAT3和Ccnd1參與SSC自我更新和精原細胞的分化[35]。

在豬上，Huang等[36]發(fā)現(xiàn)miR-375和miR-499在軍牧1號白豬1和6月齡睪丸組織存在差異表達；進一步通過雙熒光素酶報告基因法、實時熒光定量和蛋白免疫印跡等方法發(fā)現(xiàn)miR-375和miR-499可分別負向調控靶基因DIAPH2和QKI[37-38]，結合睪丸組織發(fā)育HE染色切片，推測不同發(fā)育階段的miR-375/499及其各自的靶基因的差異表達可能和睪丸組織發(fā)育程度有關。隨后，許多學者在不同發(fā)育階段豬睪丸組織中鑒定到大批差異表達mRNA和miRNA，并通過構建miRNA-mRNA互作調控網(wǎng)路篩選出了許多核心miRNA，包括miR-18、miR-21、miR-135a 等[14, 39-40]。miR-18在精子發(fā)生過程中以熱休克因子2(heat shock factor 2，HSF2)為靶目標，而HSF2是一個廣泛影響發(fā)育過程的重要轉錄因子；輸精管中miR-18下調會增加HSF2 mRNA的表達，進而改變HSF2蛋白表達水平[41]。miR-135a和miR-21可以分別通過靶向FoxO1和ETV5，從而促進SSC的增值和維持SSC數(shù)量[42-43]。

廖珂[44]進行牦牛、普通牛、犏牛睪丸組織的miRNA鑒定及生物學功能研究發(fā)現(xiàn)，差異表達miRNA(bta-miR-125a、bta-miR-125b、bta-miR-26a、bta-miR-26b)調控的靶基因涉及細胞凋亡機制，可能與犏牛精子發(fā)生阻滯相關。綜上所述，miRNA表達模式在哺乳動物體內是固定的，但由于物種、組織的不同，這種固定表達模式也隨之變化；miRNA表達譜鑒定以及miRNA與mRNA調控網(wǎng)絡的互作分析對于解析哺乳動物的睪丸發(fā)育以及精子發(fā)生過程遺傳機制提供了一定的理論基礎。

3 睪丸發(fā)育過程lncRNA的鑒定及調控

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度>200 nt的非編碼RNA，其來源于基因組，并且占有很大的比例，是最近幾年研究的一個熱點[45]。LncRNA在睪丸發(fā)育和雄性生殖細胞增殖中起到很重要的作用。Nishant等[46]發(fā)現(xiàn)了一個長度為2.4 kb的Mrhl-lncRNA，其在小鼠GC1期精原細胞的核仁中特異性表達，通過與p68蛋白相互作用阻斷Wnt信號通路，從而調控精子發(fā)生過程。Anguera等[47]發(fā)現(xiàn)，Tsx-lncRNA在粗線期精母細胞中特異性表達，暗示Tsx在生殖細胞減數(shù)分裂起調節(jié)作用。Sun等[48]以6日齡和8周齡小鼠的睪丸組織為研究對象，篩選出8 265個lncRNA，其中3 025個差異表達。同時，發(fā)現(xiàn)大量lncRNA(Ovol1、Ovol2、Lhx1、Sox3、Sox9、Plzf、c-Kit、Wt1、Sycp2、Prm1和Prm2)跟一些關鍵轉錄因子相互毗鄰，共同參與精子發(fā)生過程。

Ran等[49]對豬30和180日齡的睪丸組織進行了lncRNA測序，共鑒定出777個lncRNA，其中735個為共有l(wèi)ncRNA，并且篩選到101個差異表達lncRNA，其中，20個在幼年睪丸特異性表達，22個在成年睪丸中特異性表達；33個GO條目和7個通路被顯著富集，主要通路有TNF、AMPK和Estrogen。韓聰[50]發(fā)現(xiàn)，幼齡陜北白絨山羊睪丸組織lncRNA表達顯著區(qū)別于性成熟期和成年期，差異表達的lncRNA可能通過各種途徑調控生精細胞的發(fā)育。綜上， lncRNA作為一種調節(jié)分子已證實與機體發(fā)育[51-52]、X染色體失活[53-54]、基因組印記[55]及疾病[56-57]等方面至關重要，但它到底是如何調控哺乳動物睪丸的發(fā)育，還有待進一步深入研究，因此闡明lncRNA對睪丸組織發(fā)育及精子生成過程的影響對分子育種具有重要科學意義。

4 睪丸發(fā)育過程piRNA的鑒定及調控

piRNA是一類特異性在動物生殖細胞中表達的非編碼小分子RNA，和Piwi蛋白特異性結合在一起，參與生殖干細胞和生殖細胞發(fā)育的調控[58]。在精子發(fā)生的各個不同階段，該分子通過與PIWI亞家族蛋白的3個成員偶聯(lián)發(fā)揮其調控作用。piRNA分子首次在小鼠睪丸組織被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)在人、大鼠、豬、馬等[59]哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)了piRNA的存在。Yang等[60]在正常人睪丸組織中鑒定到20 121個piRNA，其序列的來源基因包含TDRG1和CYP19A1。TDRG1屬于睪丸特異性表達基因，階段性的調控精子發(fā)生進程[61]；CYP19A1是將雄激素轉化為雌激素的關鍵酶，也是性別分化相關miRNAs的一個重要潛在靶基因[62]。

相關研究分別對性成熟前后豬睪丸組織的差異piRNA進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)它們毗鄰的mRNA都參與精子發(fā)生、能量代謝、細胞生長調節(jié)、細胞黏附、信號轉導、細胞-細胞連接等繁殖相關的生物學過程，證實了piRNA對睪丸發(fā)育及精子發(fā)生有調控作用[63-64]。此外道楞[65]對性成熟前后蒙古馬睪丸組織進行NGS發(fā)現(xiàn)，性成熟前睪丸組織比性成熟后睪丸組織piRNA的種類更加豐富，這一結論與小鼠[66]、人[60]、豬[19]等物種上的報道相似，暗示piRNA在哺乳動物睪丸發(fā)育以及精子發(fā)生過程中扮演著重要角色。此外，道楞[65]獲得的差異表達piRNA來源基因包含PIWIL1和PIWIL2，其中PIWIL1和piRNA 在馬睪丸中的表達量隨著個體的發(fā)育而增加，在狗中也發(fā)現(xiàn)相同的結果[67]。PIWIL1基因是在人中最早發(fā)現(xiàn)在睪丸組織特異性表達的PIWI家族蛋白，已經在人、恒河猴等物種中證實，在精母細胞和成熟精子中高表達，并階段性調控生精過程[68]。因此可推測,piRNA與PIWI同源蛋白PIWIL1相互作用共同調控精子的發(fā)生過程。PIWIL2參與維持生殖干細胞自我更新、甲基化介導轉座子抑制、染色質重組等生物過程，并在piRNA的前體起源及轉錄調控中發(fā)揮著重要作用。顧垚[69]研究表明，PIWIL2基因在黃牛和牦牛睪丸組織中特異性表達，并且該基因5′UTR區(qū)域的甲基化狀態(tài)與犏牛精子發(fā)生障礙、雄性不育密切相關。

由于piRNA在雄性生殖系統(tǒng)中起著多種重要的作用，被視為哺乳動物生殖系統(tǒng)發(fā)育的關鍵調控因子之一，隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)顯示，piRNA以多種不同機制參與精子發(fā)生相關基因的表達調控，為人們深入理解哺乳動物睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的分子機制及調控網(wǎng)絡提供了一個很好的視角。

5 存在的問題與展望

5.1 存在的問題

本文綜述了睪丸發(fā)育的轉錄組學研究進展，包括睪丸發(fā)育相關mRNA、miRNA、lncRNA、piRNA。轉錄組學在動物睪丸發(fā)育以及精子發(fā)生中取得了很大的進展，但目前的研究仍然存在一定的局限性。1)mRNA、miRNA、lncRNA、piRNA組學的研究比較獨立，沒有得到有效的整合分析，使得大量的測序數(shù)據(jù)沒有得到有效利用。2)目前，哺乳動物Y染色體鑒定的基因很有限，主要是Y染色體大量的重復序列導致測序難度很大；3)研究主要集中在人以及小鼠、豬等模式動物，而對于馴化家畜睪丸轉錄組學的研究很有限；4)利用NGS技術確實篩選到了許多差異基因、差異miRNA、差異lncRNA、差異piRNA，但是對這些候選分子的功能驗證還很有限。需進一步對候選分子進行后功能基因組組學研究，篩選出睪丸發(fā)育相關候選分子，并在細胞水平或結合體內、體外驗證試驗，從而較全面的、精確地解析候選基因對睪丸發(fā)育的調控過程。

5.2 展望

睪丸的正常發(fā)育對哺乳動物繁殖力的提高和優(yōu)良種公畜精液的充分利用具有十分重要的作用。睪丸發(fā)育過程極其復雜，受到遺傳因素和環(huán)境因素共同作用。特異性表達mRNA、miRNA、lncRNA、piRNA在睪丸組織發(fā)育和精子生成的各個階段均發(fā)揮重要作用，因此，對這些調控分子的研究意義重大。

睪丸發(fā)育研究作為生物繁殖學領域的重要課題。通過對睪丸發(fā)育轉錄組學的研究，探討特異性表達基因與睪丸發(fā)育的相關性，極大地提高了人們對睪丸發(fā)育、生精過程等重要生理過程的認識，可以更全面地了解睪丸發(fā)育過程中重要基因的表達模式、轉錄因子及RNA結合蛋白活化模式及激素調節(jié)方式，一方面，可以為探索人以及犏牛等哺乳動物雄性不育、睪丸發(fā)育不完全綜合征等疾病的遺傳機制奠定理論基礎，另一方面，對于牛、羊、豬等優(yōu)秀種公畜的早期選育提供一定的理論參考依據(jù)。