曹 忻,鄒云龍,陸會(huì)寧,高丹丹,周 平,石國(guó)慶,楊具田*

(1. 西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，蘭州 730030； 2. 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；3. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000)

Senger等[1]和Sirois和Edelman[2]在豚鼠、倉(cāng)鼠和小鼠中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是一種具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用的高度特異性生長(zhǎng)因子，當(dāng)血液循環(huán)不足，如在缺氧條件下，是將氧氣供應(yīng)恢復(fù)到組織中系統(tǒng)的一部分[3]。多集中于小鼠、大鼠和人醫(yī)學(xué)研究，而關(guān)于綿羊方面的研究報(bào)道很少[4-16]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(fms-like tyrosine kinase-1，F(xiàn)LT-1)是VEGF的受體[17]。Terman等[18]證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(kinase insert domain receptor，KDR)亦是VEGF的受體。除了與VEGF受體結(jié)合外，VEGF還與由神經(jīng)皮素(neuropilins，NRP)和VEGF受體組成的受體復(fù)合物結(jié)合，這種受體復(fù)合物能增加VEGF信號(hào)活性[19-20]。而NRP是種優(yōu)勢(shì)多形性受體，因此其他分子可能干擾NRP/VEGFR受體復(fù)合物的信號(hào)。例如，第3類信號(hào)素與VEGF165競(jìng)爭(zhēng)NRP結(jié)合，從而調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的血管生成[21]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在綿羊卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocytes complexes，COCs)體外成熟過(guò)程中同時(shí)促進(jìn)卵母細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟，以提供高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞[22-25]。VEGF是通過(guò)存在于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的兩個(gè)受體FLT-1和KDR相結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)作用[26]。本研究是對(duì)前期研究的持續(xù),屬于系列研究。本試驗(yàn)針對(duì)3種不同卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)方式下，外源添加VEGF作為試驗(yàn)組，未添加VEGF作為對(duì)照組，利用qPCR和Western blot測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間FLT-1 mRNA和蛋白分別在綿羊卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中表達(dá)變化。首次探究綿羊卵母細(xì)胞不同體外成熟培養(yǎng)方式下，VEGF對(duì)FLT-1分別在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)變化和具體影響，為后期明確VEGF在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育中的作用機(jī)制及路徑研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 綿羊卵巢采集

新疆石河子市牛羊定點(diǎn)屠宰場(chǎng)屠宰的母綿羊，無(wú)菌手術(shù)剪剪下雙側(cè)卵巢，保存于25～30 ℃生理鹽水中，3～4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室[27]。

1.2 3種不同培養(yǎng)方式及試驗(yàn)分組

采用剖切法采集卵母細(xì)胞，選取A、B級(jí)COCs，成熟液中清洗數(shù)遍后備用[27]。3種不同的體外成熟培養(yǎng)方式：①用移液器吹打COCs使顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離，用口吸管將卵母細(xì)胞吸出，作為裸卵單獨(dú)培養(yǎng)；②用移液器吹打COCs使顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離，用口吸管將卵母細(xì)胞吸出備用，將含有顆粒細(xì)胞的成熟液2 500 r·min-1離心5 min，將顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，隨即將之前準(zhǔn)備好的裸露卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至顆粒細(xì)胞上，作為顆粒細(xì)胞與裸卵共培養(yǎng)；③COCs直接轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，作為COCs培養(yǎng)。3種不同培養(yǎng)方式中，所有試驗(yàn)組添加5 ng·mL-1VEGF，對(duì)照組則不添加。5 ng·mL-1VEGF添加劑量根據(jù)前期研究結(jié)果確定[22-23]。

1.3 RNA提取與cDNA合成

用試劑盒對(duì)顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞進(jìn)行RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA[27]。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

根據(jù)NCBI提供的mRNA序列，采用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物。FLT-1(114 bp)上游引物：5′-TGGCACAAAGACCCAAAAGA-3′;下游引物：5′-GGCGTTGAGCGGAATGTAG-3′。GAPDH(119 bp)上游引物：5′-CCTGCCAAGTATGATGAGAT-3′；下游引物：5′-TGAGTGTCGCTGTTGAAGT-3′。其中GAPDH為內(nèi)參。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

采用480Ⅱ qPCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，退火溫度為60 ℃[27]。mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔCT進(jìn)行計(jì)算。

1.5 Western blot檢測(cè)

采用濕轉(zhuǎn)法對(duì)處理過(guò)的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育后，用ECL對(duì)含有目的蛋白的PVDF膜處理后，用X光曝光，再用相關(guān)軟件進(jìn)行分析[27]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016及SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.01表示差異極顯著；P>0.05表示差異不顯著。Origin 2018作圖。

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)方式下外源添加VEGF對(duì)顆粒細(xì)胞FLT-1 mRNA表達(dá)的影響

圖1結(jié)果表明，在共培養(yǎng)及COCs培養(yǎng)兩種方式下，除顆粒細(xì)胞與裸卵共培養(yǎng)方式中未能在24 h檢測(cè)到顆粒細(xì)胞FLT-1 mRNA表達(dá)外，其余不同培養(yǎng)時(shí)間下的試驗(yàn)組和對(duì)照組的顆粒細(xì)胞中均有FLT-1 mRNA表達(dá)。兩種不同培養(yǎng)方式中，共培養(yǎng)對(duì)照組中顆粒細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量呈先降后升再降，0～8 h下降，8～20 h上升，其中16～20 h上升速率最快，在20 h時(shí)最高(3.31×10-1±1.32×10-3)，20～24 h急速下降至0；共培養(yǎng)試驗(yàn)組中顆粒細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量從0～4 h開(kāi)始上升，4～8 h略有下降，8～20 h又開(kāi)始上升至最高(9.21×10-2±6.39×10-4)，20～24 h急速下降至0；COCs對(duì)照組中顆粒細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量從0～12 h開(kāi)始急速上升至最高(1.26×10-2±1.01×10-4)，12～24 開(kāi)始下降，其中16～20 h降速最快；COCs試驗(yàn)組中顆粒細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量在0～4 h階段急速下降，4～24 h平穩(wěn)下降至24 h最低(1.13×10-6±1.20×10-8)。12 和16 h各組間顆粒細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)。

2.2 不同培養(yǎng)方式下外源添加VEGF對(duì)卵母細(xì)胞FLT-1 mRNA表達(dá)的影響

圖2結(jié)果表明，3種不同培養(yǎng)方式下，卵母細(xì)胞中均有FLT-1 mRNA表達(dá)。裸卵對(duì)照組中卵母細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量在0～24 h呈先降后升，在12 h降至最低(1.18×10-2±4.72×10-5)，24 h最高(2.14×10-2±2.27×10-4)；裸卵試驗(yàn)組中卵母細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量呈先升后降趨勢(shì)，其中20 h升至最高(7.97×10-2±9.60×10-4)；共培養(yǎng)對(duì)照組中卵母細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量總體呈上升趨勢(shì)，其中16～24 h上升較快，尤其是20～24 h上升速率最大，24 h表達(dá)量最高(6.16×10-2±8.55×10-4)；共培養(yǎng)試驗(yàn)組中卵母細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量在0～20 h總體呈波動(dòng)性上升趨勢(shì)，20～24 h急速上升至最高(4.26×10-2±3.42×10-4)；COCs不論是對(duì)照組還是試驗(yàn)組中卵母細(xì)胞的FLT-1 mRNA表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，其中0～8 h下降較快，尤其是0～4 h下降速率最大，在24 h表達(dá)量最低，對(duì)照組(4.18×10-5±3.86×10-7)，試驗(yàn)組(3.21×10-5±2.56×10-7)。12 h時(shí)各組中FLT-1 mRNA表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)。20 h時(shí)裸卵試驗(yàn)組中的FLT-1 mRNA表達(dá)量為各時(shí)期各組中最高(7.97×10-2±9.60×10-4)。

標(biāo)注相同大寫字母表示培養(yǎng)相同時(shí)間各組間差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)注不同大寫字母表示培養(yǎng)相同時(shí)間各組間差異極顯著(P<0.01)。下同The same capital letters indicate no significant difference in same culture time among different groups (P>0.05)； The different capital letters indicate extremely significant differences in same culture time among different groups (P<0.01). The same as below圖1 不同培養(yǎng)方式下顆粒細(xì)胞FLT-1 mRNA表達(dá)水平Fig.1 FLT-1 mRNA expression level in granule cells in different culture ways

圖2 不同培養(yǎng)方式下卵母細(xì)胞FLT-1 mRNA表達(dá)水平Fig.2 FLT-1 mRNA expression level in oocytes in different culture ways

2.3 不同培養(yǎng)方式下外源添加VEGF對(duì)顆粒細(xì)胞FLT-1蛋白表達(dá)的影響

圖3結(jié)果表明，除24 h在共培養(yǎng)對(duì)照組和試驗(yàn)組中未檢測(cè)到顆粒細(xì)胞FLT-1蛋白表達(dá)外，其余各時(shí)間點(diǎn)不論是共培養(yǎng)還是COCs培養(yǎng)，顆粒細(xì)胞中均有FLT-1蛋白表達(dá)(圖3A)。兩種不同培養(yǎng)方式中，共培養(yǎng)對(duì)照組和COCs對(duì)照組中顆粒細(xì)胞的FLT-1蛋白表達(dá)量均呈先升后降趨勢(shì)，其中共培養(yǎng)對(duì)照組在8 h時(shí)最高(15 859)，COCs對(duì)照組在12 h最高(14 510);共培養(yǎng)試驗(yàn)組和COCs試驗(yàn)組顆粒細(xì)胞的FLT-1蛋白表達(dá)呈波動(dòng)性下降趨勢(shì)。不論是COCs對(duì)照組還是試驗(yàn)組顆粒細(xì)胞中FLT-1蛋白表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均高于同期共培養(yǎng)試驗(yàn)組(圖3B)。

2.4 不同培養(yǎng)方式下外源添加VEGF對(duì)卵母細(xì)胞FLT-1蛋白表達(dá)的影響

圖4結(jié)果表明，3種不同培養(yǎng)方式中，卵母細(xì)胞中均有FLT-1蛋白表達(dá)(圖4A)。3種不同培養(yǎng)方式中，除裸卵試驗(yàn)組在20～24 h有一個(gè)急劇拉升外，其余所有組中FLT-1蛋白表達(dá)量總體均呈波動(dòng)性下降趨勢(shì);裸卵對(duì)照組、共培養(yǎng)對(duì)照組、共培養(yǎng)試驗(yàn)組、COCs對(duì)照組以及COCs試驗(yàn)組中卵母細(xì)胞FLT-1蛋白含量均在24 h檢測(cè)到最低值，分別為10 548、8 303、13 827、6 714和6 681;卵母細(xì)胞中FLT-1蛋白表達(dá)量在各組中的關(guān)系：裸卵試驗(yàn)組>共培養(yǎng)試驗(yàn)組>裸卵對(duì)照組>共培養(yǎng)對(duì)照組>COCs對(duì)照組>COCs試驗(yàn)組(圖4B)。

A. Western blot檢測(cè)；B. 灰度值分析A. Western blot test; B. Grayscale analysis圖3 不同培養(yǎng)方式下顆粒細(xì)胞FLT-1蛋白表達(dá)水平Fig.3 FLT-1 protein expression level in granule cells in different culture ways

A. Western blot檢測(cè)；B. 灰度值分析A. Western blot test; B. Grayscale analysis圖4 不同培養(yǎng)方式下卵母細(xì)胞FLT-1蛋白表達(dá)水平Fig.4 FLT-1 protein expression level in oocytes in different culture ways

3 討 論

綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中顆粒細(xì)胞作為營(yíng)養(yǎng)因子的傳輸者，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中起重要作用。而VEGF已經(jīng)被證明能夠在體外刺激細(xì)胞分裂和細(xì)胞遷移[28-29]。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)LT-1 mRNA的表達(dá)量在綿羊卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中并非恒定不變，在不同的時(shí)間點(diǎn)有不同的表達(dá)量，表達(dá)量的升降隨著時(shí)間的變化貫穿培養(yǎng)過(guò)程始終，即在不同培養(yǎng)階段表達(dá)量不同，體現(xiàn)出了一種階段性； mRNA作為一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)信息源，很容易就會(huì)被降解，只有當(dāng)同一mRNA產(chǎn)生的速度與降解的速度相一致時(shí)，才能維持同一mRNA總量的不變，而本試驗(yàn)中，F(xiàn)LT-1 mRNA的表達(dá)量在某些時(shí)間段是急劇下降的，表明在該時(shí)間段內(nèi)，F(xiàn)LT-1 mRNA產(chǎn)生的量遠(yuǎn)小于被降解的量，具有一定的時(shí)效性；在3種培養(yǎng)方式中，F(xiàn)LT-1 mRNA的表達(dá)有呈下降趨勢(shì)的(COCs試驗(yàn)組顆粒細(xì)胞和COCs組卵母細(xì)胞)，有呈上升趨勢(shì)的(共培養(yǎng)組卵母細(xì)胞)，有呈先降后升趨勢(shì)的(裸卵對(duì)照組卵母細(xì)胞)，有呈先降后升再降趨勢(shì)的(共培養(yǎng)對(duì)照組顆粒細(xì)胞)，以及先升后降趨勢(shì)的(共培養(yǎng)試驗(yàn)組顆粒細(xì)胞、COCs對(duì)照組顆粒細(xì)胞和裸卵試驗(yàn)組卵母細(xì)胞)，造成以上不同趨勢(shì)表達(dá)的原因除了顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的不同接觸方式外，還因?yàn)橛型庠碫EGF的添加與否，從而導(dǎo)致了不同培養(yǎng)方式下FLT-1 mRNA的不同表達(dá)模式。在裸卵單獨(dú)培養(yǎng)方式下，對(duì)照組卵母細(xì)胞FLT-1的mRNA和蛋白都有表達(dá)，說(shuō)明卵母細(xì)胞中存在FLT-1的自分泌。FLT基因是屬于酪氨酸家族的原癌基因，與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化密切相關(guān)[30]，這也驗(yàn)證了FLT-1存在于卵母細(xì)胞中的合理性，但要想其能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)以影響卵母細(xì)胞的成熟，F(xiàn)LT-1必須要與VEGF相結(jié)合，推斷VEGF在卵母細(xì)胞中也存在自分泌。在體內(nèi)檢測(cè)了VEGF及其受體FLT-1在金黃地鼠植入前胚胎中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在交配后第3～7天 胚胎中，均檢測(cè)到VEGF及其受體FLT-1蛋白的表達(dá)，并隨著發(fā)育過(guò)程表現(xiàn)不同變化規(guī)律。另外伴隨外源VEGF的添加在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)FLT-1 mRNA表現(xiàn)出活躍的表達(dá)量增加(除了24 h外)，但其蛋白水平的表達(dá)量下降(除了24 h外)，說(shuō)明在體外培養(yǎng)環(huán)境下外源添加VEGF有效的激活了FLT-1 mRNA表達(dá)，但同時(shí)結(jié)合FLT-1蛋白以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的生物學(xué)效應(yīng)，從而減少了FLT-1蛋白的表達(dá)，添加VEGF是提高卵母細(xì)胞成熟效率的有效手段之一，這與筆者前期研究外源VEGF可提高卵母細(xì)胞成熟率結(jié)果相互印證。而24 h的mRNA下降和蛋白水平的提升，推斷是與添加VEGF試驗(yàn)組的卵母細(xì)胞大部分已經(jīng)完成了成熟過(guò)程有關(guān)，這與筆者前期研究發(fā)現(xiàn)VEGF添加試驗(yàn)組在20 h已成熟卵母細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組結(jié)果相吻合[26]。

3種培養(yǎng)方式試驗(yàn)結(jié)果表明，卵母細(xì)胞中FLT-1 mRNA和蛋白的表達(dá)與外圍顆粒細(xì)胞的存在與否、數(shù)量的多少以及包裹方式息息相關(guān)。在COCs組中，添加VEGF無(wú)論是在顆粒細(xì)胞內(nèi)還是在卵母細(xì)胞內(nèi)都顯著降低了4～8 h FLT-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。說(shuō)明顆粒細(xì)胞的存在抑制或者減少了FLT-1的表達(dá)，也許是由于顆粒細(xì)胞的旁分泌作用抑制了FLT-1 mRNA的表達(dá)，但外源添加的VEGF有效結(jié)合了FLT-1導(dǎo)致其蛋白表達(dá)量下降。除4～8 h顆粒細(xì)胞FLT-1 mRNA外，共培養(yǎng)方式下的各組FLT-1 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著高于COCs培養(yǎng)方式下的各組(顆粒細(xì)胞中FLT-1蛋白表達(dá)除外，且這兩種培養(yǎng)方式下其表達(dá)量變化趨勢(shì)相似)，說(shuō)明COCs培養(yǎng)方式下，VEGF和其受體FLT-1作為營(yíng)養(yǎng)因子在顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間的互作更活躍，這也充分說(shuō)明了顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞成熟發(fā)育的重要作用，而COCs方式下，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的接觸面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)共培養(yǎng)方式下的，這大大促進(jìn)了VEGF和FLT-1的有效結(jié)合，從而令檢測(cè)到的FLT-1 mRNA和蛋白表達(dá)量下降。在各培養(yǎng)方式下，未添加VEGF對(duì)照組FLT-1蛋白都在4～8 h左右呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，尤其以兩對(duì)照組顆粒細(xì)胞中FLT-1蛋白表達(dá)結(jié)果明顯，推斷這與生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)的發(fā)生有關(guān)，而顆粒細(xì)胞組中的結(jié)果判斷與顆粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要。具有發(fā)育潛能的卵母細(xì)胞要首先獲得生發(fā)泡破裂的能力，才能逐漸獲得完成成熟分裂的能力，以產(chǎn)生高質(zhì)量的、具有受精能力的卵母細(xì)胞[31]，而前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加VEGF有效促進(jìn)了綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中GVBD的完成[26]。外源添加VEGF對(duì)4～12 h顆粒細(xì)胞FLT-1蛋白表達(dá)和20～24 h卵母細(xì)胞FLT-1蛋白表達(dá)影響最明顯。說(shuō)明外源添加VEGF對(duì)FLT-1的影響主要發(fā)生在卵母細(xì)胞成熟前期的顆粒細(xì)胞中和卵母細(xì)胞成熟后期的卵母細(xì)胞中[22]。表明，顆粒細(xì)胞中FLT-1表達(dá)對(duì)GVBD的完成至關(guān)重要，而卵母細(xì)胞中FLT-1表達(dá)對(duì)卵母細(xì)胞成熟后期的影響巨大。

本研究結(jié)果顯示，添加VEGF能夠有效穩(wěn)定FLT-1蛋白表達(dá)波動(dòng)幅度，即添加VEGF能夠促使卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中FLT-1蛋白更穩(wěn)定的表達(dá)。FLT-1作為VEGFA、VEGFB和PGF的細(xì)胞表面受體，在胚胎血管形成、血管生成、細(xì)胞存活、細(xì)胞遷移、巨噬細(xì)胞功能、趨化、癌細(xì)胞侵襲等方面發(fā)揮著重要作用[32]。通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度增殖，可以作為胚胎血管生成的負(fù)調(diào)節(jié)因子發(fā)揮重要作用[33]。對(duì)VEGFA和相對(duì)低活性蛋白激酶有很高的親和力；可作為VEGFA信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子，限制游離VEGFA數(shù)量，并阻止其與KDR結(jié)合[34]。推測(cè)本試驗(yàn)卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中，對(duì)照組FLT-1蛋白的下降跟FLT-1與游離VEGF結(jié)合有關(guān)。另一方面，一些缺乏跨膜域的亞型，如：亞型2、亞型3和亞型4，可以作為VEGFA的誘變受體，從KDR中分離VEGF(這在胚胎的血管生成中尤為重要)[35]，通過(guò)與KDR形成異質(zhì)二聚體來(lái)調(diào)制KDR信號(hào)[36-38]，KDR蛋白在整個(gè)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中都有表達(dá)，在未成熟的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的膜表面也有表達(dá)[26]，推測(cè)FLT-1蛋白下降跟KDR結(jié)合也密不可分。配體結(jié)合導(dǎo)致了幾個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)激活，PLCG活化導(dǎo)致了細(xì)胞信號(hào)分子二?；视秃图〈?，4，5-三磷酸和蛋白激酶C(PKC)激活。外源添加VEGF能夠令對(duì)照組中前16 h的PKC表達(dá)趨勢(shì)提前2 h，即PKC在外源VEGF的作用下被提前激活[26]。PKC可介導(dǎo)磷脂酰肌醇3-激酶受體1(phosphatidylinositol 3-kinase receptor 1，PIK3R1)的磷酸化，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PIK3)亞基的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致磷脂酰肌醇激酶和下游信號(hào)通路的活化，協(xié)調(diào)激活MAPK1/ERK2、MAPK3/ERK1和MAP激酶信號(hào)通路，以及AKT1信號(hào)通路[39-42]。筆者對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的研究表明，外源添加VEGF提前激活PKC能夠提高卵母細(xì)胞中MAPK的表達(dá)[26]，推斷FLT-1跨膜域亞型與KDR形成異質(zhì)二聚體調(diào)節(jié)KDR信號(hào)被進(jìn)一步放大，從而導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路被進(jìn)一步激活， MAPK表達(dá)量增加，而FLT-1與KDR的結(jié)合也是導(dǎo)致FLT-1表達(dá)量下降的原因之一。卵母細(xì)胞中FLT-1蛋白表達(dá)量在24 h時(shí)，卵母細(xì)胞中FLT-1蛋白表達(dá)量在各組中的關(guān)系：裸卵試驗(yàn)組>共 培養(yǎng)試驗(yàn)組>裸卵對(duì)照組>共培養(yǎng)對(duì)照組> COCs對(duì)照組>COCs試驗(yàn)組。

綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程。VEGF對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟方面有著積極促進(jìn)作用[22-23, 25-26]，這種促進(jìn)作用同時(shí)也影響著FLT-1 mRNA和蛋白在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中的表達(dá)。其中顆粒細(xì)胞中FLT-1蛋白在卵母細(xì)胞成熟前期的低表達(dá)有助于卵母細(xì)胞GVBD的完成，而卵母細(xì)胞中FLT-1蛋白穩(wěn)定下降也有助于卵母細(xì)胞的成熟。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究綿羊卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程VEGF和其受體間的交互作用及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中存在FLT-1的自分泌和旁分泌作用，其表達(dá)具有階段性、時(shí)效性和模式性；卵母細(xì)胞中FLT-1 mRNA和蛋白的表達(dá)與外圍顆粒細(xì)胞的存在與否、數(shù)量的多少以及包裹方式息息相關(guān)；在體外培養(yǎng)環(huán)境下外源添加VEGF有效地激活了FLT-1 mRNA表達(dá)，但同時(shí)結(jié)合FLT-1蛋白以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的生物學(xué)效應(yīng)，從而減少了FLT-1蛋白的表達(dá)。