邢雅欣，解其貴，楊志勇，劉玉兵，王玲，千日成*

(1.南通大學醫(yī)學院，南通 226000；2.上海市第十人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海 200072)

在過去的十幾年中，胚胎培養(yǎng)體系得到了很大的改善，但它還是沒有完全模擬體內(nèi)的環(huán)境條件，由此體外培養(yǎng)形成的胚胎質量還是不如體內(nèi)形成的胚胎質量。然而體外條件下，種植前的胚胎會分泌一些因子來對抗不利的培養(yǎng)條件，因此很多研究在胚胎培養(yǎng)液中添加一些胚胎分泌的因子以改善培養(yǎng)條件，以提高體外培養(yǎng)胚胎質量[1]。

HCG是胚胎最早分泌的分子信號之一[2-3]，受精后第2天即可檢測到HCG mRNA的表達以及分泌[4]。并且植入前胚胎分泌HCG的量與胚胎質量相關[5]。HCG和黃體生成素(LH)結構功能相近，同屬糖蛋白超家族，與相同的受體(LHCGR)結合引起下游反應。LHCGR是一種膜受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族。Dinopoulou等[6]研究發(fā)現(xiàn)LHCGR表達于小鼠卵母細胞體外成熟(IVM)的各個階段以及體外受精之后合子、胚胎早期發(fā)育的各個時期。研究還發(fā)現(xiàn)除了在IVM培養(yǎng)液中添加HCG可以促進卵母細胞體外成熟之外，在受精和胚胎發(fā)育培養(yǎng)液中添加HCG對卵母細胞體外受精和胚胎發(fā)育有益。但是該研究未進行更深一步的分子生物學驗證，也未觀察HCG對常規(guī)體內(nèi)成熟卵母細胞的體外受精及胚胎發(fā)育是否有影響。

本研究以小鼠體內(nèi)成熟卵母細胞為研究對象，通過在體外受精及胚胎培養(yǎng)液中加入與Dinopoulou研究中相同濃度的HCG(1 500 U/L)進行體外受精和胚胎培養(yǎng)后，對其受精率、卵裂率和囊胚形成率以及囊胚內(nèi)細胞團(ICM)、滋養(yǎng)層(TE)以及囊胚細胞總數(shù)，囊胚質量相關基因[基因多能性八聚體結合蛋白4(Oct4)、分化相關基因尾端型同源盒2(Cdx2)、氧化應激相關基因錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、侵襲相關基因基質金屬蛋白酶9(Mmp9)]的表達情況進行了比較，為探討HCG在受精及胚胎發(fā)育過程中的作用，為進一步研究胚胎發(fā)育機制、優(yōu)化胚胎體外培養(yǎng)體系提供理論和實驗依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1.實驗動物：雌性4～6周、雄性8～10周ICR小鼠，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。在穩(wěn)定、標準化的實驗動物環(huán)境中飼養(yǎng)：溫度20～26℃，濕度40%～70%，光照/黑夜12/12 h，自由進食飲水。動物實驗通過上海市第十人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。

2.試劑和儀器：孕馬血清促性腺激素(PMSG，赤峰博恩藥業(yè))，HCG(珠海麗珠)，受精液(HTF)、胚胎培養(yǎng)液(KSOM)、精子獲能液(TYH)(南京愛貝生物)，胎牛血清(FBS)、M2操作液、礦物油(Sigma，美國)，35 mm胚胎培養(yǎng)皿(Corning，美國)，微量RNA抽提試劑盒、微量反轉錄試劑盒、Real time RT-PCR試劑盒(QIAGEN，美國)，小鼠Cdx2抗體(Biogenex，美國)，Alexa Fluor 488標記的兔抗小鼠二抗(Invitrogen，美國)，DAPI染色液(上海碧云天)，7900熒光定量PCR儀(ABI，Prism，美國)，C2激光共聚焦顯微鏡(Nikon，日本)。

二、研究方法

1.實驗分組：依據(jù)培養(yǎng)液中HCG濃度分為對照組和HCG組，對照組的受精液HTF和胚胎培養(yǎng)液KSOM中HCG濃度為0 U/L，HCG組的受精液HTF和胚胎培養(yǎng)液KSOM中HCG濃度為1 500 U/L。配制的培養(yǎng)液需在培養(yǎng)箱(37℃、6% CO2、5%O2)中平衡過夜。

2.小鼠IVF：4～6周齡ICR雌性小鼠，每只腹腔注射10 U PMSG，48 h后注射10 U HCG，16～18 h后頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，無菌條件下取出雙側輸卵管于M2操作液中，體視顯微鏡下用1 ml無菌注射器針頭劃破輸卵管膨大處，使卵冠丘復合物(COCs)完全釋放出來，立即轉入HTF受精液中，加入提前在TYH獲能液中孵育1 h的精子。受精6 h后用HTF液洗滌受精卵，記錄受精情況，將形態(tài)正常的受精卵在KSOM液中繼續(xù)培養(yǎng)，在24 h和96 h觀察并計算2-細胞、囊胚的發(fā)育情況。

3.RT-qPCR檢測囊胚中相關基因的表達：采用RT-qPCR檢測HCG組和對照組囊胚相關基因mRNA表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參。各基因引物序列如表1所示。將HCG組、對照組囊胚吸出，PBS中洗滌后按照微量RNA提取試劑盒說明書提取各組總RNA后，立即用微量反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，用于RT-qPCR，體系如下：QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix(2×)10 μl、QN ROX Reference Dye 2 μl、Primer Forward(10 μmol/L)1.4 μl、Primer Reverse(10 μmol/L)1.4 μl、cDNA 2 μl，余下用ddH2O補齊至20 μl。反應條件：兩步法PCR擴增標準程序：預變性95℃ 2 min，PCR反應95℃ 5 s、60℃ 30 s，共40個循環(huán)。待反應結束后確認擴增曲線和融解曲線。將目的基因與內(nèi)參的所得結果相比，所得的比值為目的基因的相對表達量，結果以2-△△Ct表示。每20枚囊胚為一份樣本，每組各收集3份，共6份樣本。

4.囊胚免疫熒光標記：(1)在室溫條件下，將囊胚用1% BSA-PBS洗3次，每次10 min，然后移入4%多聚甲醛液中固定30 min；(2)固定完成后1% BSA-PBS中洗2次；(3)將固定后的囊胚移入含有 0.15%～0.25% Triton X100的1% BSA-PBS室溫1 h，1% BSA-PBS中洗滌2次；(4)將囊胚移入小鼠Cdx2抗體稀釋液中(稀釋比為1∶100)，4℃過夜，1% BSA-PBS中洗滌2次；(5)將囊胚移入Alexa Fluor 488標記的二抗稀釋液(稀釋比為1∶500)，室溫遮光1 h，1% BSA-PBS中洗滌2次；(6)將囊胚移入DAPI染色液滴中，室溫遮光孵育5 min，1% BSA-PBS中清洗；(7)在玻璃底的培養(yǎng)皿內(nèi)做若干 1% BSA-PBS 的液滴，并用礦物油覆蓋，將染色完成的胚胎移入皿中，激光共聚焦顯微鏡下進行觀察計數(shù)并拍照。觀察囊胚ICM、TE數(shù)以及囊胚細胞總數(shù)。

5.觀察指標：受精率=雙原核1-細胞數(shù)/成熟卵母細胞數(shù)×100%，2-細胞率=2-細胞總數(shù)/1-細胞總數(shù)×100%，囊胚形成率=囊胚數(shù)/1-細胞總數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。目的基因mRNA表達以(±s)表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有極顯著統(tǒng)計學意義。

結 果

一、對照組和HCG組胚胎體外發(fā)育情況

對照組和HCG組小鼠卵母細胞體外受精6 h后去除周圍的顆粒細胞及精子，觀察雙原核細胞數(shù)量，24 h、96 h觀察胚胎發(fā)育情況，并計算受精率、2-細胞率、囊胚形成率。結果顯示，HCG組的受精率、2-細胞率以及囊胚形成率與對照組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 小鼠胚胎體外發(fā)育情況[n(%)]

二、兩組囊胚質量相關基因mRNA的表達相對水平比較

HCG組相關基因Cdx2、MnSODmRNA的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，HCG組Mmp9基因mRNA的表達水平上調(diào)，具有極顯著性差異(P<0.01)；兩組的Oct4基因mRNA表達水平無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

兩組相比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 對照組和HCG組相關基因mRNA的表達

三、囊胚計數(shù)

采用免疫熒光法，對兩組囊胚進行Cdx2蛋白標記，以及DAPI染色?？笴dx2蛋白抗體將囊胚TE標記為綠色，DAPI將囊胚細胞核染成藍色(圖2)，ICM細胞數(shù)為兩者差值。結果顯示HCG組囊胚細胞總數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，HCG組ICM細胞數(shù)及TE 細胞數(shù)多于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組ICM/TE值相比較，差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表3)。

Cdx2標記的外滋養(yǎng)層細胞(綠色)；DAPI標記的細胞總數(shù)(藍色)；Merge為兩種標記的合圖圖2 小鼠囊胚差異性染色結果(免疫熒光染色，×200)

組 別囊胚細胞總數(shù) ICM細胞數(shù)TE細胞數(shù)ICM/TE值對照組52.3±9.113.2±3.939.1±7.80.3HCG組61.7±16.3*15.4±3.846.2±13.10.3

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

HCG作用廣泛，被稱為當今科學界的奇跡[7]。HCG 作為糖蛋白激素家族中的一員，同 LH 都是通過 LH/HCG 受體發(fā)揮生物學作用[8-9]。LHCGR是一種跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，主要通過 cAMP-磷脂酶 C/三磷酸肌醇途徑介導的信號通路發(fā)揮其生物學功能[10]。HCG 和卵巢細胞膜上的 LHCGR 相結合，激活腺氨酸環(huán)化酶系統(tǒng)刺激甾體激素的合成，進而介導受精卵著床、性腺發(fā)育及功能活動的調(diào)節(jié)等哺乳動物的生殖過程中：取卵前用HCG扳機提高卵母細胞成熟率、卵母細胞體外發(fā)育潛能及臨床妊娠率[11]；HCG促進哺乳動物卵母細胞體外成熟、受精及早期胚胎發(fā)育[12-13]；胚胎植入過程中，HCG是母胎界面分子交流最重要的信號分子[14]，胚胎滋養(yǎng)層分泌的HCG以自分泌的形式刺激其侵入子宮內(nèi)膜[15]，改善子宮內(nèi)膜容受性(ER)、延長種植窗口期，有利于胚胎著床，還可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的免疫耐受性；懷孕期間HCG通過卵巢黃體細胞合成孕激素，阻止月經(jīng)來潮，維持妊娠等。

胚胎體外發(fā)育過程中，最早在2-細胞期即可檢測到HCG分泌；從卵母細胞到合子、各細胞期胚胎均有HCG mRNA及其受體的表達。之前很多研究分析了胚胎分泌的HCG對子宮內(nèi)膜的作用，但很少研究胚胎分泌的HCG對胚胎本身的作用。而且，僅僅依靠形態(tài)學來評價胚胎質量是不夠的。本研究采用雙重染色方法分別計數(shù)ICM和TE，結果表明，胚胎培養(yǎng)液中加入HCG，雖然對小鼠囊胚ICM、TE細胞數(shù)增多作用并不明顯，但是小鼠囊胚細胞總數(shù)整體水平顯著提高，提示了HCG對改善小鼠囊胚質量的重要作用。

本研究不僅從形態(tài)學及囊胚細胞計數(shù)方面觀察到HCG對改善囊胚質量的作用，而且發(fā)現(xiàn)胚胎培養(yǎng)液中添加HCG刺激體外形成的小鼠胚胎發(fā)育質量相關的基因mRNA[16-19]的表達發(fā)生變化。

相關基因Cdx2蛋白是一個重要的轉錄因子，在哺乳動物囊胚中僅存在于外滋養(yǎng)層細胞。胚胎Cdx2基因在8細胞期開始表達，并逐漸開始在外滋養(yǎng)層表達上調(diào)，是外滋養(yǎng)層特異性表達因子[20]，也是胚胎分化的重要相關基因[21]。本研究中，在胚胎培養(yǎng)液中加入HCG后，Cdx2基因表達明顯上調(diào)，可能預示著HCG促進體外囊胚細胞分化良好。Oct4特異性表達于ICM，與種植前胚胎發(fā)育和多能性相關[22]。本研究結果表明，HCG組Oct4基因表達上調(diào)不明顯，可能與胚胎體外發(fā)育過程中ICM增殖速度沒有TE快，與囊胚差異性染色結果相符[23]。通常認為胚胎培養(yǎng)過程中細胞內(nèi)產(chǎn)生過度的活性氧對胚胎不利。氧化應激被認為是胚胎發(fā)育不良的原因之一。MnSOD存在于哺乳動物線粒體中，是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑[24]。Rizos等[25-26]研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)發(fā)育形成的胚胎MnSODmRNA表達水平比體外條件下更高。本研究中，HCG組MnSODmRNA表達水平比對照組顯著增高，說明在培養(yǎng)液中加入HCG使胚胎培養(yǎng)體系更接近體內(nèi)環(huán)境。胚胎成功植入子宮內(nèi)膜是輔助生殖技術中最重要的環(huán)節(jié)之一[27]，基質金屬蛋白酶9(MMP9)被認為是著床過程中水解細胞外基質最重要的蛋白水解酶[28]，在哺乳動物生殖過程中與胚胎遷移、侵襲和組織重建相關[29-30]。研究顯示胚胎分泌的MMP9的量與胚胎質量成正比。而胚胎分泌的HCG可以促進胚胎和子宮內(nèi)膜MMP9的分泌[31-32]。本研究結果也顯示在胚胎培養(yǎng)液中添加HCG后Mmp9 mRNA表達量極顯著增加，有利于胚胎的植入。

綜上所述，在受精培養(yǎng)液中添加HCG對小鼠卵母細胞體外受精情況沒有影響，但是在胚胎培養(yǎng)液中添加HCG增加囊胚細胞總數(shù)，使胚胎質量相關基因表達上調(diào)，有潛力成為改善胚胎體外培養(yǎng)質量、優(yōu)化胚胎體外培養(yǎng)體系的重要因子。至于HCG在此過程中的具體機制還有待進一步研究。