柏海燕，師娟子

(西北婦女兒童醫(yī)院，西安 710003)

胚胎植入前遺傳學診斷/篩查(PGD/PGS)是在體外受精胚胎移植(IVF-ET)過程中，對形態(tài)學可用的胚胎進一步進行種植前活檢和遺傳學分析，選擇無遺傳學疾病的胚胎植入宮腔，從而獲得正常胎兒的診斷方法，其適應證包括染色體異常、單基因病、不明原因復發(fā)性自然流產、反復種植失敗、高齡等。目前，許多生殖中心在實施IVF-ET時并未將染色體核型分析列為常規(guī)術前檢測項目，有的不孕患者最初沒有PGD/PGS指征，在接受常規(guī)IVF助孕后產生了新的診斷，又符合PGD/PGS指征，進而要求對剩余凍存的胚胎進行PGD/PGS。如果我們把從開始計劃實施的PGD/PGS稱為計劃PGD/PGS，則可以把這種中途突發(fā)進行的PGD/PGS稱為中途PGD/PGS(Midway PGD/PGS)。本文通過對1例Midway PGD/PGS過程詳細報道，結合其他15例相似病例的治療結局，復習文獻，分析中途PGD/PGS與計劃PGD/PGS操作的不同之處及對結局的可能影響，以期為今后臨床實踐提供參考。

一、病例報道

患者28歲女性，既往早孕人流1次，不孕2年，造影提示雙側輸卵管阻塞，男方精液化驗正常。于2017年1月來西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET治療。采用經(jīng)典長方案，黃體中期起予短效曲普瑞林(GnRH-a，達必佳，輝凌，德國)0.1 mg進行垂體降調節(jié)，達降調效果后每天加用基因重組人FSH(rFSH，果納芬，默克雪蘭諾，瑞士)150 U促排。當3個以上卵泡直徑≥18 mm時，注射HCG(珠海麗珠)10 000 U誘導排卵，36 h后采卵，取卵當天起給予黃體酮60 mg/d肌肉注射。獲卵18枚，常規(guī)IVF受精，2PN 14個，序貫培養(yǎng)至D5，共形成7個可用囊胚(依據(jù)Garnder囊胚分級法)。移植一枚囊胚(4BB)后剩余6枚囊胚行玻璃化冷凍。移植后繼續(xù)黃體酮60 mg肌肉注射，12 d后測血清HCG 688 U/L，移植后28 d B超提示宮內單活胎，移植后52 d B超提示胚胎停育，行清宮術。術后3個月后再次解凍移植(FET)2枚囊胚(4BB、4BC)，結局仍為單胎孕早期自然流產。2次流產物均未送遺傳檢測。

對夫婦雙方進一步做復發(fā)性流產(RSA)相關檢查，包括雙方染色體核型分析、女方血漿D-2聚體、血同型半胱氨酸、血小板聚集度、抗凝血酶Ⅲ活性、抗心磷脂抗體、抗糖β2蛋白抗體、抗核抗體、抗dsDNA、淋巴細胞亞群、蛋白S、蛋白C。發(fā)現(xiàn)男方染色體核型為46，XY，t(5；13)(q22；q22)，其他檢測結果未見異常。該夫婦進行遺傳咨詢時被告知：男方為平衡的相互易位攜帶者，子代理論上有1/18幾率染色體完全正常、1/18幾率為相互平衡易位攜帶者，其余幾率為染色體不平衡，后者有發(fā)生胚胎種植失敗、流產、死胎、畸形等不良結局可能。夫婦雙方來生殖中心要求對剩余囊胚進行植入前遺傳學檢測。簽署知情同意書后對4枚冷凍囊胚解凍復蘇、透明帶打孔、活檢，活檢后囊胚再次玻璃化冷凍。我院遺傳中心對活檢細胞進行全基因組擴增、采用微陣列比較基因組雜交方法(array-CGH，Agilent平臺)行遺傳學檢測。結果回報2個為整倍體囊胚、2個為非整倍體囊胚。人工周期準備內膜，選擇1個整倍體囊胚進行FET，常規(guī)黃體支持用藥，移植后12 d測血清HCG 224 U/L，移植后28 d B超示宮內單胎存活，孕39周剖宮產一男嬰，體重3 000 g，發(fā)育正常。

二、相似病例Midway PGD/PGS

我院近年來共完成16例Midway PGD/PGS檢測，其中7例是因為后發(fā)生的RSA診斷，6例為不良孕史(包括流產物微缺失微重復檢測異常1例、胎兒多發(fā)畸形引產2例、胎兒/出生兒21三體3例)，3例為遲檢測到的染色體核型異常。共活檢了57個冷凍復蘇囊胚，均采用array-CGH方法檢測。結果非整倍體胚胎31個、整倍體胚胎24個、無信號胚胎2個，可用胚胎率為42.1%。11人有可用囊胚，其中10人共FET 13周期，結果6周期未孕、1周期自然流產、4周期繼續(xù)妊娠隨訪中，2周期足月產(表1)?？捎门咛ヂ屎团R床妊娠率均相似于我中心同期計劃PGD/PGS(分別為42.1% vs.28.57%，53.8% vs.57.38%)[1]。

表116例Midway PGD/PGS病例一般情況及治療結果

三、討論

計劃PGD/PGS在胚胎實驗室的流程為：取卵→ICSI受精→D3胚胎期打孔→D5囊胚活檢→囊胚冷凍→對回報可用囊胚擇期行解凍移植。而在Midway PGD/PGS，實驗室流程被動變?yōu)槿÷选鶬VF受精→囊胚冷凍→囊胚解凍復蘇→囊胚打孔、活檢→再次囊胚冷凍→對回報可用囊胚擇期再次行解凍移植。那么以下問題就需要探討：(1)PGD/PGS能否采取IVF受精？(2)囊胚期打孔是否可行？(3)反復凍融對胚胎發(fā)育有無影響？為此我們復習了多項PGD/PGS指南，包括2004年PGD國際協(xié)會頒布的PGD技術指南及于2008年修正的PGD操作流程及實驗室質量保障指南[2]、歐洲人類生殖與胚胎協(xié)會(ESHRE)PGD聯(lián)盟就PGD實驗室的設立及相關的3項技術——DNA擴增技術、熒光原位雜交(FISH)技術和胚胎活檢——建立的相關指南[3-5]、2015年Tur-Kaspa等[6]提出的用于HLA配型的PGD指南及Girardet等[7]2016年提出的囊性纖維瘤PGD指南、加拿大婦產科醫(yī)生協(xié)會2015年發(fā)布的胚胎植入前基因診斷和篩查技術指南[8]，以及其他相關文獻，以期回答上述問題。

1.PGS/PGD受精采用ICSI還是IVF：選擇ICSI的理由包括：(1)增加2PN率，提高卵子利用效率；(2)避免精子來源的污染。因此目前所有指南對包含PCR步驟的PGS/PGD均推薦使用ICSI，目的即是減少來自黏附于囊胚透明帶的父系精子DNA污染；熒光原位雜交(FISH)則IVF和ICSI受精兩者均可[5，9]。進一步細分，所有PGD中授精步驟均推薦使用ICSI而非常規(guī)授精[4，10]；而對于PGS，目前美國CooperGenomics公司采用IVF受精，并將此寫入其認證的操作流程。他們的依據(jù)在于，對多達50條的精子進行擴增后并無DNA產物，因此無需擔心粘附于透明帶上的精子污染。但對PGD病例仍要求采用ICSI授精，尤其是采用短串聯(lián)重復序列多態(tài)性連鎖分析(STR-PCR)擴增進行單基因PGD時，因為細胞裂解過程可放大精子物質。由于所用擴增方法不同，導致精子DNA擴增程度也不同，因此采用何種受精方式建議參考各實驗室流程、單細胞擴增技術和驗證流程。此外，還需要關注另一種污染，即卵丘細胞污染。有一例胚胎PGD診斷結果為46，XX，但新生兒出生為46，XY，其DNA指紋顯示為母體來源。推測原因可能是把一團粘附的濾泡細胞誤認為是脫出的滋養(yǎng)層細胞進行了“活檢”。不管采用哪種受精方法都有發(fā)生這種污染的可能，因此操作人員在活檢過程中仔細識別活檢材料非常重要。

2.解凍囊胚打孔(zona breaching)：針對囊胚期活檢，指南中推薦在胚胎期打孔、在囊胚期對從孔中突出的滋養(yǎng)外胚層細胞進行活檢[1]。但也有缺點：若后期形成的內細胞團位于打孔處，則活檢操作可能損傷已分化的內細胞，影響后續(xù)胚胎發(fā)育[11-13]；效率低——打孔的胚胎不一定都能發(fā)育成囊胚。也有文獻嘗試在囊胚期打孔[14]。相較卵裂期打孔，囊胚期打孔優(yōu)點在于：(1)打孔位置可選擇，可避開內細胞團附著處；(2)避免對囊胚發(fā)育過程的干擾。但該方法需要先對囊胚進行皺縮、等到囊胚再次復張并孵出才能活檢，部分情況下當天是無法完成活檢。本研究中為解凍囊胚，操作時可以選擇合適時機，即在囊胚解凍后尚有一定程度皺縮狀態(tài)下、選取遠離內細胞團處、透明帶薄、且和滋養(yǎng)外胚層有一定間隙處打孔，然后放置培養(yǎng)箱孵育，待有滋養(yǎng)外胚層細胞從打孔處突出時取活檢，則可以最大限度避免對滋養(yǎng)外胚層細胞的損傷。

3.反復凍融對胚胎發(fā)育的影響：冷凍技術是PGD/PGS過程中一項重要步驟，為囊胚活檢后的遺傳檢測贏得了時間。目前采用的玻璃化冷凍技術經(jīng)20多年的發(fā)展，目前已廣泛用于人類卵母細胞、原核期胚胎、卵裂期胚胎和囊胚的冷凍，獲得了較高的解凍復蘇率，很多文獻報道凍融胚胎和凍融囊胚移植是可行和安全的[15-17]。但目前尚缺乏對玻璃化胚胎出生嬰兒終生隨訪的全面資料，胚胎反復凍融其臨床有效性、安全性更需人們關注。臨床工作中胚胎反復凍融大都為特殊情況下的非常態(tài)操作，相關的研究較少。2015年的一項研究顯示，重復冷凍組的胚胎種植率、臨床妊娠率比單次冷凍組低[18]；最新的一篇文獻也顯示反復凍融組自然流產率高于對照組而活產率低于對照組[19]。二次凍融影響妊娠結局可能與多個因素相關。首先，多次玻璃化冷凍過程中使用較高濃度的冷凍保護劑可使細胞發(fā)生毒性效應和滲透性休克?，F(xiàn)普遍認為，乙二醇是人胚胎、受精卵、卵母細胞玻璃化冷凍最有效的低毒性冷凍保護劑，凍融后存活率高，但其與胚胎接觸時間過長(>2 min)、溫度過高(>25℃)時，其細胞毒性作用增強。其次，盡管認為玻璃化冷凍中極少有胞內冰晶形成，但當預平衡或暴露于玻璃化溶液中時間過短時，會發(fā)生細胞脫水和冷凍保護劑置換不充分，此時會產生胞內冰晶，對細胞造成損傷。反復冷凍情況下這些不良事件發(fā)生概率增加、不利影響累加，最終可能影響到胚胎發(fā)育潛能。這就要求胚胎學家操作嚴格按照流程進行，同時也要求我們工作中盡可能個體化處理、準確預判，任何情況下都要盡可能避免對胚胎反復凍融。

總之，中途行PGD/PGS與計劃行PGD/PGS在操作程序有諸多不同，現(xiàn)有指南未涉及，目前無指導性建議。其中IVF受精、反復凍融有可能影響PGD準確率和胚胎進一步發(fā)育潛能，如何評價其效果有待進一步積累經(jīng)驗。