田雪，孫曉軍，劉存霞，黃兵，李玉峰，宋敏訓

（山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所 家禽疫病診斷與免疫重點實驗室，山東 濟南 250023）

隨著我國肉鴨養(yǎng)殖的快速發(fā)展，肉鴨各類傳染性疫病也呈逐漸增加趨勢。除了禽流感、鴨瘟、鴨病毒性肝炎、鴨坦布蘇病毒感染等病毒性疫病以外，鴨的細菌性疾病也同樣威脅著肉鴨生產(chǎn)。目前已知的鴨細菌類病原包括鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和鴨疫巴氏桿菌等，這些細菌常?；旌细腥净蛟谄渌≡腥竞笠鹄^發(fā)感染，還能作為條件性致病菌長期存在于鴨舍環(huán)境中。近年來，肉鴨關(guān)節(jié)炎發(fā)病較為普遍，病鴨表現(xiàn)跛行甚至癱瘓，主要癥狀為跗關(guān)節(jié)和/或指關(guān)節(jié)腫脹，我們從不同來源的表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀的北京鴨體內(nèi)分離到部分細菌，通過16s rDNA測序進行了種屬鑒定，并通過動物試驗對其致病性進行了分析。

1 材料與方法

1.1 試劑 pMD-18T克隆載體購自TAKARA公司；PCR擴增試劑盒、核酸提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司，酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂粉等細菌培養(yǎng)基及其他試劑購自上海生工公司。

1.2 引物 參照文獻[1]合成兩對細菌16S rDNA通用引物，其中8F和1492R配對使用，sgF和sgR配對使用，擴增片段長度均為1.5kb左右，由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物序列為：

8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' ；

sgF：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' ；

sgR：5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3' 。

1.3 細菌分離與培養(yǎng) 從表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀的北京鴨肝臟、脾臟、腦和關(guān)節(jié)液等器官或部位進行細菌分離，分別接種普通LB平板和血清平板，于普通培養(yǎng)箱和二氧化碳培養(yǎng)箱 （5%CO2）37℃培養(yǎng)18～24h，觀察記錄細菌生長狀況及菌落形態(tài)、顏色等，必要時進行二次純化培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)或純化后的單菌落，涂片進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.4 藥物敏感試驗 將100μl 0.5麥氏單位的純化菌液均勻涂布于M-H藥敏平板上，貼上藥敏紙片后37℃恒溫培養(yǎng) 24h，按照文獻[2]方法判定敏感、中敏或耐藥。

1.5 16S rDNA序列測定及分析 參照文獻[3]方法提取細菌基因組作為模板，按照如下比例配制反應體系：細菌基因組模板1～10ng，16S rDNA上下游引物 （10pM） 各 1μl，dNTP（10mM）0.5μl，Taq酶（5U/μl）0.5μl，10×PCR buffer 2.5μl，補充 去 離子水至 25μl，PCR反應條件為：95℃預變性 5min，95℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 2min，共進行 30 個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物電泳鑒定后，用DNA凝膠回收試劑盒回收陽性條帶，克隆至pMD-18T載體，鑒定陽性質(zhì)粒送上海生工公司進行測序。測定序列提交NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對以鑒定細菌種屬。

1.6 動物試驗 選取12個代表性分離菌株經(jīng)純化培養(yǎng)后涂布于5%血清瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)18h，將菌苔用玻璃棒刮下，用PBS緩沖液懸浮并稀釋至濃度為1×109CFU/ml待用。65只7日齡健康雛鴨隨機分成13組，每組5只，其中1～12組分別經(jīng)腿部肌肉注射稀釋后的菌液0.5ml，對照組腿部肌肉注射PBS緩沖液0.5ml，試驗鴨均飼養(yǎng)于隔離器中，每日觀察記錄試驗鴨精神狀態(tài)和發(fā)病情況，10d后逐只稱重，剖檢觀察器官病變，并從關(guān)節(jié)和肝臟重新分離細菌。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離及鑒定 從不同來源表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀的北京鴨體內(nèi)共分離到細菌23株，經(jīng)革蘭氏染色觀察，其中20株為革蘭氏陽性球菌或桿菌，3株為革蘭氏陰性桿菌，利用Blast將細菌的16S rDNA序列與GenBank中已知序列進行比對發(fā)現(xiàn)，12個革蘭氏陽性分離菌株屬葡萄球菌屬（Staphylococcus），7個革蘭氏陽性分離菌株屬棒狀桿菌屬 （Corynebacterium），3個革蘭氏陰性分離菌株屬大腸桿菌屬，另外有1個分離株Jeotgalicoccus schoeneichii尚不明分類地位，鑒定結(jié)果見表1。

表1 分離菌株鑒定結(jié)果

2.2 藥物敏感試驗 結(jié)果顯示，阿莫西林對分離菌株具有較好的抑制作用，所有菌株均在中敏以上，沒有出現(xiàn)耐藥菌株；其次為阿米卡星，僅有2個分離菌株對其表現(xiàn)為低敏；再次為頭孢噻肟，僅有4個分離菌株對其表現(xiàn)低敏；抑菌效果較差的藥物是氟苯尼考、阿奇霉素和恩諾沙星，除3個大腸桿菌分離株對其敏感以外，其余大多數(shù)分離菌株對三種藥物均有不同程度耐藥。分離菌株Jeotgalicoccusschoeneichii（D3)僅對阿莫西林敏感，對供試的其他藥物均表現(xiàn)為耐藥。3株大腸桿菌除其中2株對強力霉素表現(xiàn)耐藥以外，對其他藥物均在中敏以上。其余分離菌株對供試藥物均表現(xiàn)為不同程度耐藥，結(jié)果見表2。

表2 藥物敏感試驗結(jié)果

2.3 將 12 個代表菌 株 （D3、D4、D5、D6、D7、D9、D11、D12、D13、D17、D19 和 D20）培養(yǎng)物接種試驗鴨，連續(xù)觀察10d，各組試驗鴨精神、采食均正常，未表現(xiàn)跛行或癱瘓等發(fā)病癥狀，各試驗組鴨體重與對照組沒有顯著差異，從關(guān)節(jié)和肝臟也沒有重新分離到接種細菌。

3 討論

3.1 肉鴨關(guān)節(jié)炎目前在生產(chǎn)中較為常見，種鴨發(fā)病率較高，病鴨多表現(xiàn)跗關(guān)節(jié)或指關(guān)節(jié)等處腫脹，剖檢可見肌腱腫脹、出血，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有積液，甚至有干酪樣物，有的病例可見關(guān)節(jié)軟骨壞死。同時，病鴨經(jīng)常伴有肝脾腫大，心肌出血，氣囊炎和腸炎等內(nèi)臟病變。一般認為，肉鴨關(guān)節(jié)炎多由細菌感染引起，病原包括金黃色葡萄球菌、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和鏈球菌等。但是，從本文的分離情況來看，除大腸桿菌以外，其他致病菌并未分離到，說明這些細菌并不是本文病例的致病因素，反而其他葡萄球菌和某些棒狀桿菌分離率較高。本文分離到的葡萄球菌包括松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）、 阿 爾 萊 特 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus arlettae）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii），棒狀桿菌包括停滯棒狀桿菌（Corynebacterium stationis）、乳酪棒狀桿 菌 （Corynebacterium casei）和 （Corynebacterium falsenii）。松鼠葡萄球菌在人、畜以及水生動物身上均能發(fā)現(xiàn)，且能夠造成人尿路感染、腦膜炎和豬皮炎、山羊淋巴結(jié)炎等病癥[4-8]。 趙紅利、楊軍等[9，10]報道從鴨分離到金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、科氏葡萄球菌、偽中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌、溶血葡萄球菌和阿涅蒂斯葡萄球菌等共8種葡萄球菌，其中金黃色葡萄球菌對鴨致病力最強，可以造成多數(shù)試驗鴨發(fā)病死亡，其他葡萄球菌僅造成短期食欲和飲水量下降，而無明顯發(fā)病癥狀。木糖葡萄球菌和阿爾萊特葡萄球菌能夠造成人和動物的化膿性感染或慢性感染，但未見在鴨上的分離報道[11-14]。

棒狀桿菌是人和動物皮膚、粘膜等處的常在寄生菌，除少數(shù)成員如白喉棒狀桿菌以外，其他一般被認為是條件性致病菌[15，16]，對于羊、豬等動物而言，某些棒狀桿菌可以造成淋巴結(jié)腫大以及內(nèi)臟的出血和化膿癥狀[17，18]。棒狀桿菌在自然環(huán)境中分布較為廣泛，在雞、鴨等家禽腸道、糞便及禽舍中也能夠分離到[19-21]，Mohan等[22]曾報道從多發(fā)性關(guān)節(jié)炎病雞中分離到疑似棒狀桿菌，但未見鴨感染棒狀桿菌的報道。

除以上葡萄球菌、棒狀桿菌和部分大腸桿菌以外，我們還分離到一株Jeotgalicoccus schoeneichii，該菌為革蘭氏陽性，不運動，不形成芽孢的球菌，Glaeser等[23]報道曾從豬舍的廢氣中分離到該菌，可能是環(huán)境中的常在細菌。肉鴨關(guān)節(jié)炎病因較為復雜，除細菌性因素外，其他病原如呼腸孤病毒、支原體以及霉菌毒素等也可能造成發(fā)病。雖然動物試驗顯示以上分離菌單獨對鴨沒有致病作用，但這些細菌作為條件性致病菌，在應激、霉菌毒素中毒或其他病原混合感染的情況下，有可能作為協(xié)同因素使病情更加嚴重。

3.2 由于我國家禽養(yǎng)殖業(yè)是從低水平粗放型養(yǎng)殖模式逐步發(fā)展而來，從業(yè)者為了預防和控制各類疫病而頻繁大量使用藥物，造成細菌性病原耐藥性嚴重。從表2可以看出，23個菌株針對供試藥物具有不同程度的耐藥性，其中對氟苯尼考具有耐藥性的有18個菌株，對強力霉素和恩諾沙星具有耐藥性的各有15個菌株，對阿奇霉素具有耐藥性的有12個菌株，抑菌效果相對較好的藥物是頭孢噻肟和阿米卡星，各有4個和2個耐藥菌株，抑菌效果最好的藥物是阿莫西林，對所有分離菌株均在中敏以上。耐藥性最強的分離菌株為Jeotgalicoccusschoeneichii，該菌對供試的7種藥物中的6種均不敏感。雖然細菌耐藥性和致病性之間并不存在直接聯(lián)系，但耐藥性會增強細菌的適應性，引起更加嚴重的感染，提高治療的難度和成本，還有可能通過食物鏈傳遞給人，造成公共衛(wèi)生隱患。家禽養(yǎng)殖場中細菌耐藥性的形成無疑與藥物的濫用有關(guān)，為了解決這個問題，除了有選擇地合理用藥以外，還應當積極改變養(yǎng)殖模式，通過衛(wèi)生和消毒措施減少細菌性病原的感染幾率。

3.3 細菌核糖體RNA亞基按照沉降系數(shù)分為5S、16S和23S三種，16S rDNA是編碼16S亞基的基因，該基因序列中具有多個保守區(qū)和可變區(qū)，可以根據(jù)保守區(qū)域設計出針對所有細菌的通用引物，又可以根據(jù)可變區(qū)的差異區(qū)分不同種屬的細菌，因此16SrDNA作為一種有效的分子標記，逐步被應用到細菌的分類鑒定和遺傳分析中。通過對16S rDNA的PCR擴增、序列測定和比對即可確定細菌分類地位，特別是對于一些難以分離和純化的細菌而言，相對于生化試驗耗時較長、工作量較大的缺陷，這種方法具有無可比擬的優(yōu)勢。但部分細菌由于種間差異較小，僅僅利用16S rDNA測序不能鑒定到種，這種情況下仍需要利用生化試驗或16S～23S rDNA間隔序列分析進行確定。本文利用16S rDNA分析鑒定了23株鴨源分離菌，與GenBank中相近菌株的同源性為88%～100%，說明本方法可用于快速確定細菌的屬種，是細菌學分析的有力工具。