孫蓓 曹璐 楊靈伊 李玲妹 劉昶煦 黃秋娟 王雅蕾 齊麗莎 曹文楓

肺癌是目前發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。肺腺癌（adenocarcinoma，ADC）是原發(fā)性肺癌最常見的組織學(xué)類型。肺癌患者的5年生存率低于其他癌癥患者，ADC發(fā)生的相關(guān)機(jī)制阻礙了肺癌的有效治療［1］。獲取治療ADC的分子靶點(diǎn)，并進(jìn)行靶向治療是目前研究的熱點(diǎn)。因此，研究ADC的特點(diǎn)及其惡化的機(jī)制具有重要意義。

無意義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制。該機(jī)制通過識(shí)別和降解含有提前終止密碼子（premature translational-termi?nation codon，PTC）的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物防止有潛在毒性的截短蛋白產(chǎn)生［2-3］。另外，在腫瘤研究中，NMD可通過靶向突變的基因蛋白發(fā)揮監(jiān)管機(jī)制［4-6］。然而，NMD在腫瘤細(xì)胞營養(yǎng)缺乏和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力高的情況下表達(dá)下調(diào)，說明腫瘤發(fā)生過程中可能抑制了NMD的發(fā)生［4］。NMD 的發(fā)生主要由UPF1、UPF2、UPF3、Y14、SMG1、SMG5、SMG6、SMG7等多種多肽發(fā)揮作用［7-8］，而上游移碼突變體1（up-frame shift mutant 1，UPF1）是NMD途徑中的關(guān)鍵參與者［9］。并且，UPF1表達(dá)的上、下調(diào)可以決定NMD過程的激活或者抑制［8，10］。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測定150例ADC患者的UPF1表達(dá)情況，探討UPF1的表達(dá)與ADC各個(gè)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，以及其表達(dá)與ADC患者整體生存期（overall survival，OS）與無病生存期（recu?nence-free survival，RFS）的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)新的分子靶點(diǎn)，指導(dǎo)臨床治療。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2011年1月至12月就診于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院未接受過化療或放療、臨床病理及隨訪資料完整并且均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)的ADC患者150例。其中男性75例，女性75例。年齡＜50歲21例，≥50歲129例。從未吸過煙的患者89例，有吸煙史61例。腫瘤直徑＜3 cm 72例，≥3 cm 78例。依照第8版AJCC分期，150例ADC患者中，TNMⅠ、TNMⅡ、TNMⅢ和TNMⅣ期分別為36、50、25和29例（表1）。本研究經(jīng)過天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 將組織在10%中性緩沖的福爾馬林中固定24 h，石蠟包埋，4 μm切片厚度，常規(guī)H&E染色。使用Olympus BX51顯微鏡觀察。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法（SP法） 1）載玻片預(yù)處理。2）UPF1表達(dá)檢測：切片置于二甲苯60℃脫蠟2次。切片逐級乙醇脫水，PBS洗3次。抗原修復(fù)液修復(fù)后等待切片自然冷卻，PBS洗3次。加一抗，陰性對照以PBS代替，4℃冰箱過夜，PBS沖洗3次；加生物素化二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37℃水浴箱孵育30 min。PBS沖洗3次；DAB顯色，顯微鏡下控制顯色；封片后光鏡Olympus數(shù)碼相機(jī)照相。陽性對照由abcam公司提供。3）結(jié)果判定在光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為UPF1表達(dá)細(xì)胞。兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立對UPF1的表達(dá)進(jìn)行評估。采用染色陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和染色范圍得分相乘評法，總分為0～6分。陽性細(xì)胞比例為（0%～25%）評分為0，陽性細(xì)胞比例為（26%～50%）評分為1，陽性細(xì)胞比例為（＞50%）評分為2；不顯色或顯色模糊者評分為0（無染色），淺黃色者評分為1（弱染色），棕黃色者評分為2（中等染色），棕褐色者評分為3（強(qiáng)染色）?？偡郑?和≤3表示UPF1的低表達(dá)，總分≥4分為UPF1高表達(dá)，0分為UPF1陰性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)評估UPF1的表達(dá)水平與不同臨床病理特征（包含年齡、原發(fā)腫瘤大小、組織學(xué)類型、TNM分期、淋巴和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等）之間的相關(guān)性。采用Kaplane-Mei?er分析UPF1的表達(dá)與生存期之間的關(guān)系。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 150例ADC患者臨床病理資料

2 結(jié)果

2.1 UPF1表達(dá)水平與ADC各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，UPF1在ADC組織的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，ADC組織中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為UPF1表達(dá)細(xì)胞。如表2所示，150例ADC樣本中，85例（56.9%）UPF1表達(dá)陰性或弱陽性，65例（43.1%）UPF1表達(dá)陽性。UPF1表達(dá)量與患者性別、年齡、是否吸煙或腫物大小無顯著相關(guān)性，與組織學(xué)類型（P＜0.001）、TNM分期（P=0.014）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.016）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.035）密切相關(guān)。另外，在微乳頭為主型樣本中，UPF1均為陰性或低表達(dá)所占比例為100.0%（19/19）；在實(shí)性為主型的組織中比例為69.6%（16/23），乳頭狀癌中為40.0%（4/10），伏壁型為51.1%（23/45），腺泡狀癌為39.6%（21/53）（圖1）。由此可見，在實(shí)性為主型和微乳頭為主型的惡性程度較高的ADC類型中，UPF1低表達(dá)率顯著高于其他組織學(xué)類型。此外，UPF1表達(dá)水平還與TNM分期有關(guān)。在45例（45/64，70.3%）晚期腫瘤（TNMⅢ和Ⅳ期）和42例（42/86，48.8%）早期腫瘤（TNMⅠ和Ⅱ期）患者中發(fā)現(xiàn)UPF1陰性表達(dá)或低表達(dá)。ADC出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，UPF1陰性表達(dá)或低表達(dá)占67.7%（42/62，67.7%）；ADC出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中，UPF1陰性表達(dá)或低表達(dá)共占68.0%（31/45，68.0%）。UPF1陰性表達(dá)或低表達(dá)患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率（42/62，67.7%）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率（31/45，68.0%）遠(yuǎn)高于UPF1高表達(dá)患者（20/62，32.3%）和（14/45，31.1%）。150例病例中UPF1的表達(dá)情況與EGFR和K-RAS基因突變的關(guān)系如表2所示，UPF1高表達(dá)病例有41.2%（35/85，41.2%）發(fā)生EGFR基因突變；UPF1高表達(dá)病例中有4.70%（4/85，4.70%）發(fā)生K-RAS基因突變。UPF1蛋白的高低表達(dá)情況和EGFR基因突變（P=0.201）和KRAS基因突變（P=0.650）差異無統(tǒng)計(jì)意義。

2.2 UPF1的表達(dá)與ADC患者的生存期的關(guān)系

采用Kaplane-Meier分析UPF1的表達(dá)與患者生存的關(guān)系。UPF1的表達(dá)水平與患者的OS呈顯著相關(guān)性，UPF1不表達(dá)或低表達(dá)的ADC患者OS遠(yuǎn)低于UPF1高表達(dá)的患者，UPF1低表達(dá)會(huì)顯著縮短患者的OS（圖2A）。UPF1的表達(dá)水平與患者的RFS存在顯著相關(guān)性，UPF1不表達(dá)或低表達(dá)的ADC患者RFS遠(yuǎn)低于UPF1高表達(dá)的患者，UPF1低表達(dá)者RFS較短（圖2B）。

圖1 UPF1在不同類型ADC中的表達(dá)（SP×200）

表2 150例ADC患者臨床病理特征與UPF1表達(dá)水平之間的關(guān)系

表2 150例肺腺癌患者臨床病理特征與UPF1表達(dá)水平之間的關(guān)系（續(xù)表2）

圖2 ADCUPF1高表達(dá)組和低表達(dá)組患者生存的比較

2.3 單因素及多因素分析

選取TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、UPF1表達(dá)和病理類型對150例ADC患者OS進(jìn)行單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)。單因素分析中，TNM分期（P=0.029）、UPF1表達(dá)情況（P=0.009）以及伏壁型與微乳頭型病理類型（P=0.021）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選取以上進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)，UPF1表達(dá)情況（P=0.007）對患者生存有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 150例ADC患者OS單因素與多因素分析

3 討論

ADC發(fā)病率近年來迅速上升，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是ADC治療失敗的主要原因。研究ADC發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制是近年來ADC的研究熱點(diǎn)［11-13］。NMD途徑作為一種有效的mRNA降解機(jī)制，其核心分子UPF1表達(dá)的高低可以直接促進(jìn)或抑制NMD的發(fā)生［4］。有報(bào)道稱，UPF1在其他腫瘤中作為抑癌基因，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切的相關(guān)性［14-15］。UPF1在肝細(xì)胞腫瘤和結(jié)直腸腫瘤中的研究較多，但在ADC中鮮見報(bào)道。

在本研究中，首先使用免疫組織化學(xué)分析了150例患者ADC組織樣品，發(fā)現(xiàn)UPF1在ADC組織中的表達(dá)低于正常肺組織。此外，UPF1的表達(dá)與ADC的組織學(xué)類型（P＜0.001）、TNM分期（P=0.014）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.016）以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.035）有顯著相關(guān)性，而與年齡、性別、是否吸煙及腫物大小無相關(guān)性。這些研究結(jié)果表明UPF1可能是一種潛在的腫瘤抑制基因，其在ADC進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。另外，本研究顯示，UPF1低表達(dá)的ADC患者OS較其他患者更短，術(shù)后復(fù)發(fā)率更高，且其表達(dá)情況與ADC的病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈顯著相關(guān)性。以上研究結(jié)果表明，UPF1可以作為ADC治療及預(yù)后評估的參考指標(biāo)，并且UPF1有可能成為新的ADC藥物治療靶點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過建立模擬腫瘤生存微環(huán)境如缺氧、營養(yǎng)缺乏、活性氧增加等，腫瘤細(xì)胞的UPF1表達(dá)被明顯下調(diào)，NMD過程被抑制［13-15］。一些mRNA的表達(dá)上調(diào)，許多利于細(xì)胞適應(yīng)這種惡劣環(huán)境的生物分子量增加［16］。反過來說，UPF1表達(dá)下調(diào)抑制NMD的過程，可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞對惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力。腫瘤生長過程中，瘤組織紊亂的供血系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的缺氧，營養(yǎng)缺乏，另外腫瘤細(xì)胞的代謝會(huì)有活性氧的產(chǎn)生［17-18］。腫瘤細(xì)胞的生長經(jīng)常處于低氧、營養(yǎng)缺乏的狀態(tài)，猜測腫瘤細(xì)胞中的NMD過程可能經(jīng)常處于被抑制狀態(tài)。傳統(tǒng)的ADC的治療方法主要以手術(shù)及術(shù)后輔助治療為主。隨著對ADC發(fā)生、發(fā)展機(jī)理認(rèn)識(shí)的不斷加深，越來越多的研究集中于新的抑瘤靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及分子靶向藥物的開發(fā)。

近年來，通過對EGFR等相關(guān)信號(hào)通路的研究及對EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）療效及安全性的探索，證實(shí)了EGFR-TKIs在EGFR突變的肺癌患者中取得的確切療效。K-RAS基因定位于人類染色體12p12.1，編碼一種具有GTP酶活性的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，是EGFR功能信號(hào)的下游分子，在膜受體到腺苷環(huán)化酶信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，相關(guān)研究證實(shí)，K-RAS基因狀態(tài)與EGFR-TKIs和抗EGFR單抗治療ADC的療效密切相關(guān)［16-18］。本研究分析了UPF1的表達(dá)和EGFR基因突變以及K-RAS基因突變的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)UPF1的表達(dá)和EGFR基因突變兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)意義。關(guān)于EG?FR突變和K-RAS基因突變與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系的報(bào)道不一，這可能由檢測方法不同、樣本量大小不同等原因造成。EGFR突變以及K-RAS基因突變與患者UPF1表達(dá)的關(guān)系以及與患者預(yù)后的關(guān)系如何，仍需進(jìn)一步的多中心臨床隨訪研究。

作為NMD的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，UPF1低表達(dá)可能使NMD在ADC組織中被抑制。這引起了臨床對NMD如何在腫瘤組織中受到抑制從而使腫瘤惡化、進(jìn)展的質(zhì)疑，關(guān)于其中的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。