， ， ，

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.吉林大學(xué) 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130022)

羥脯氨酸是脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物[1]，它有四種立體異構(gòu)體，分別為順式-3-羥脯氨酸、反式-3-羥脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸和反式-4-羥脯氨酸，其中反式-4-羥脯氨酸(文中均稱為L-羥脯氨酸)在自然界中較為常見，并且被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品和美容等行業(yè).L-羥脯氨酸可以用于合成消炎藥、碳青霉烯類等化學(xué)藥物的合成[2-3]；可以作為手性催化劑催化許多不對稱反應(yīng)[4]；還可以作為化妝品添加劑用來改善飲料風(fēng)味.目前國內(nèi)生產(chǎn)L-羥脯氨酸的主要方法是從膠原中提取，但生物提取法具有成本高、收率低和污染嚴(yán)重等弊端[5]；化學(xué)合成法同樣具有成本高的缺點(diǎn)[6].隨著代謝工程等技術(shù)的不斷發(fā)展，以及微生物發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸所展現(xiàn)出來的優(yōu)勢[7-8]，使得發(fā)酵法成為一種最具前景的L-羥脯氨酸生產(chǎn)方法.

采用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸時(shí)，溶氧是限制大腸桿菌高密度發(fā)酵的一個(gè)關(guān)鍵因素，不適宜的溶氧水平會(huì)對菌體代謝產(chǎn)生影響，從而影響目的產(chǎn)物的積累.L-羥脯氨酸發(fā)酵生產(chǎn)需要消耗大量的氧氣[9]，過低的溶氧水平會(huì)限制L-羥脯氨酸的高效生產(chǎn)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸的大量積累，對菌體生長和蛋白表達(dá)產(chǎn)生抑制作用.而過高的氧含量會(huì)加快細(xì)胞內(nèi)部酶的氧化過程，造成菌體提前衰老，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降.因此，研究了不同溶氧水平對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響，并提出一種分階段溶氧控制策略，對L-羥脯氨酸工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 菌 種

Escherichiacoli4HYP，由天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.4 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L.

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖30 g/L，酵母粉6 g/L，檸檬酸0.5 g/L，(NH4)2SO41 g/L，KH2PO42 g/L，VB11 mg/L，VH0.3 mg/L.

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，(NH4)2SO41 g/L，酵母粉3 g/L，檸檬酸0.5 g/L，KH2PO44 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，VB15 mg/L，VH0.2 mg/L.

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌種活化

在無菌條件下，用接種環(huán)取2環(huán)菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后，將其接種于250 mL茄形瓶中，37 ℃培養(yǎng)12 h.

1.3.2 種子培養(yǎng)

在無菌條件下，用無菌水將活化好的菌種進(jìn)行懸浮，再將其接種于5 L發(fā)酵罐中，自動(dòng)控制溫度為37 ℃，pH 7.0～7.2，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量控制溶氧在25%～30%，待菌體OD600大約達(dá)到15時(shí)，準(zhǔn)備接入發(fā)酵培養(yǎng)基.

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

在30 L發(fā)酵罐中，以發(fā)酵培養(yǎng)基10%的接種量進(jìn)行接種，接種后發(fā)酵液體積為14 L.控制培養(yǎng)溫度為37 ℃，通過自動(dòng)流加25%的氨水溶液控制pH為7.0～7.2，通過對攪拌轉(zhuǎn)速、通風(fēng)量和罐壓的調(diào)節(jié)使溶氧保持在相應(yīng)的水平，當(dāng)培養(yǎng)基中底糖耗盡時(shí)，以一定的脈沖比自動(dòng)流加80%的葡萄糖溶液，將發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛瓤刂圃?%左右.發(fā)酵過程中，每隔2 h取樣、測樣、記錄數(shù)據(jù).

1.4 分析方法

1.4.1 溶氧及pH的檢測

溶氧是采用發(fā)酵罐連接的溶氧電極進(jìn)行檢測；pH是采用發(fā)酵罐連接的pH電極和精密pH試紙(6.4～8.0)進(jìn)行檢測[10].

1.4.2 菌體濃度的檢測

見參考文獻(xiàn)[11].

1.4.3 L-羥脯氨酸和乙酸含量的檢測

見參考文獻(xiàn)[12].

1.4.4 糖酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算方法

糖酸轉(zhuǎn)化率=

2 結(jié)果與分析

為了研究不同溶氧水平對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響，分別使發(fā)酵溶氧維持在10%～20%，20%～30%和30%～40%，對發(fā)酵過程中菌體生長情況、L-羥脯氨酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率和副產(chǎn)物乙酸積累量進(jìn)行考察，確定L-羥脯氨酸發(fā)酵的最佳供氧方式.

2.1 溶氧對菌體生長和L-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響

在不同的溶氧水平下進(jìn)行L-羥脯氨酸的發(fā)酵，發(fā)酵過程中菌體生長情況如圖1所示，L-羥脯氨酸產(chǎn)量如圖2所示.

圖1 不同溶氧水平對菌體生長的影響Fig.1 Effect of different levels of dissolved oxygen on the growth of bacteria

圖2 不同溶氧水平對L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of different levels of dissolved oxygen on L-hydroxyproline production

溶氧對氨基酸發(fā)酵有很大影響，溶氧過高會(huì)抑制菌體生長，并加速菌體衰老，過低也會(huì)對菌體代謝產(chǎn)生影響[13].由圖1和圖2可知:采用不同的溶氧水平進(jìn)行L-羥脯氨酸發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵過程中菌體生長和產(chǎn)物積累情況差異明顯.從菌體生長情況來看，當(dāng)發(fā)酵過程中溶氧維持在10%～20%時(shí)，菌體OD600為115.1，隨著溶氧提高到20%～30%，菌體OD600顯著提高，達(dá)到了125.4，而將溶氧繼續(xù)提高至30%～40%后，菌體OD600大幅下降，僅為96.4，與溶氧水平在20%～30%的OD600相比，降低了23.1%.從L-羥脯氨酸積累情況來看，10%～20%的溶氧水平難以滿足菌體產(chǎn)酸需要，此時(shí)，L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度只有32.4 g/L；當(dāng)發(fā)酵溶氧維持在30%～40%時(shí)，發(fā)酵前24 h，菌體表現(xiàn)出較高的產(chǎn)酸能力，但24 h之后，由于較高的溶氧使菌體早衰，導(dǎo)致產(chǎn)酸速率下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度為36.5 g/L；當(dāng)采用20%～30%的溶氧進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度最高，達(dá)到42.0 g/L，較10%～20%溶氧下的質(zhì)量濃度提高了29.6%.

2.2 溶氧對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸積累量的影響

重組大腸桿菌發(fā)酵過程中，乙酸是主要的代謝副產(chǎn)物，它的積累會(huì)抑制菌體生長和重組蛋白的表達(dá)，而供氧不足是乙酸產(chǎn)生的一個(gè)主要原因[14].實(shí)驗(yàn)過程中，不同溶氧水平對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸質(zhì)量濃度的影響如圖3所示.

圖3 不同溶氧水平對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of different levels of dissolved oxygen on the glucose conversion rate and accumulation of acetic acid

由圖3可知：分別采用10%～20%，20%～30%和30%～40%的溶氧進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，當(dāng)溶氧在20%～30%時(shí)，糖酸轉(zhuǎn)化率最高，為19.8%，此條件下的乙酸質(zhì)量濃度為2.8 g/L；當(dāng)溶氧為10%～20%時(shí)，因溶氧無法滿足菌體生長和產(chǎn)酸需要，糖酸轉(zhuǎn)化率有所下降，與20%～30%溶氧條件下的糖酸轉(zhuǎn)化率相比，下降了6.7%，并且此時(shí)較低的溶氧限制了菌體的呼吸，使得乙酸質(zhì)量濃度達(dá)到5.4 g/L；當(dāng)溶氧為30%～40%時(shí)，乙酸質(zhì)量濃度最低，僅有1.4 g/L，但該溶氧條件下的糖酸轉(zhuǎn)化率最低，為16.3%.因此，在三種不同的溶氧水平范圍內(nèi)，20%～30%的溶氧最有利于L-羥脯氨酸發(fā)酵.

2.3 分階段溶氧控制策略的提出及驗(yàn)證

微生物發(fā)酵的目的在于使底物的消耗盡可能多的轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物[15].為了提高整個(gè)發(fā)酵過程中L-羥脯氨酸的產(chǎn)率，在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出分階段溶氧控制策略，即在發(fā)酵前期(0～8 h)，將溶氧維持在20%～30%；發(fā)酵中期(8～24 h)，菌體快速增殖和產(chǎn)酸需要消耗大量的氧氣，此階段將溶氧控制在30%～40%；發(fā)酵后期(24～32 h)，菌體代謝減弱，耗氧量減少，將溶氧降至20%～30%.按照該溶氧控制策略進(jìn)行發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，5所示.

由圖4可知：采用分階段溶氧控制策略進(jìn)行L-羥脯氨酸發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵32 h，菌體OD600達(dá)到128.7，與溶氧為20%～30%的恒定供氧發(fā)酵相比，菌體總量稍有增長，L-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)45.3 g/L，提高了7.9%.由圖5可知：分階段供氧下糖酸轉(zhuǎn)化率為20.7%，乙酸積累量為1.7 g/L，與20%～30%的恒定供氧發(fā)酵相比，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了4.5%，乙酸積累量減少了39.3%.可見，采用分階段溶氧控制策略既有利于菌體生長，促進(jìn)產(chǎn)物高效合成，又能夠有效降低副產(chǎn)物乙酸的形成，使整個(gè)發(fā)酵過程表現(xiàn)出良好的狀態(tài).

圖4 分階段溶氧控制策略下OD600和L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度Fig.4 The OD600and L-hydroxyproline production under the strategy of staged dissolved oxygen control

圖5 不同溶氧控制方法對糖酸轉(zhuǎn)化率和乙酸質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of different dissolved oxygen control methods on the glucose conversion rate and accumulation of acetic acid

3 結(jié) 論

溶氧對氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要影響，發(fā)酵液中溶氧水平的高低會(huì)直接影響微生物體內(nèi)的酶活和代謝，進(jìn)而影響菌體生長和產(chǎn)物積累[16].研究了不同溶氧水平對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響，結(jié)果表明：10%～20%的溶氧水平不能滿足L-羥脯氨酸的發(fā)酵需要，并且會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸的大量積累；30%～40%的溶氧較高，會(huì)使菌體提前衰老，導(dǎo)致L-羥脯氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率偏低；而將溶氧維持在20%～30%時(shí)，菌體OD600、L-羥脯氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率較高.在確定了不同溶氧水平下的發(fā)酵情況后，提出一種分階段溶氧控制策略，即發(fā)酵前期(0～8 h)，溶氧維持在20%～30%；發(fā)酵中期(8～24 h)，溶氧控制在30%～40%；發(fā)酵后期(24～32 h)，溶氧維持在20%～30%.結(jié)果表明：采用分階段溶氧控制策略使L-羥脯氨酸發(fā)酵整個(gè)過程表現(xiàn)出良好的狀態(tài)，發(fā)酵32 h，菌體OD600為128.7，L-羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)45.3 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到20.7%，乙酸積累量僅有1.7 g/L.