金 鑫，田偉君,2**，喬凱麗，龔曉希，趙 婧，劉淑惠

(1.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100)

膠州灣濕地是山東半島面積最大的河口海灣型濕地，濕地總面積約17.76萬hm2，具有重要的生態(tài)、水文與環(huán)境功能[1]。然而，膠州灣周圍加速的城市化和工業(yè)化使大量污染物進(jìn)入濕地生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致其污染不斷加劇。因來源豐富、毒性強、難降解，多環(huán)芳烴(PAHs)已經(jīng)成為沿岸濕地中最主要的污染物之一。膠州灣濕地土壤中PAHs(16種被美國環(huán)保署列為優(yōu)先污染物的PAHs)的含量明顯高于黃河三角洲土壤中PAHs 含量(27.45～128.97 ng·g-1)[2]，而苯并[a]芘(BaP)含量又是致癌性PAHs中含量最高的一種[3]。

BaP是一種毒性大，具有致癌、致畸、致突變效應(yīng)[4]的五環(huán)PAHs。它是第一種被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境化學(xué)致癌物，1997年被美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)列為了優(yōu)先控制PAHs。作為一種高環(huán)PAH，BaP的水溶性低，且由于濕地中降解BaP的微生物活性較低且老化了的BaP的生物有效性也較低，所以BaP在濕地中的自然降解過程十分緩慢[5-6]。本文分別以苯并[a]芘或芘和苯并[a]芘為唯一碳源和能源，用梯度馴化法從膠州灣濕地的石油污染土壤中篩選出2株BaP降解菌，以改性煤渣和聚乙烯醇(PVA)為載體材料將其制成固定化生物煤渣粒，并添加到種植了蘆葦?shù)氖茉囃寥乐?，以達(dá)到強化BaP降解的目的。此外，添加生物煤渣粒對土壤中微生物群落多樣性的影響也在文中被分析。

1 材料與方法

1.1 BaP降解菌的篩選及鑒定

采集膠州灣濕地受石油污染的土壤，分別以BaP或芘和BaP為唯一碳源和能源，經(jīng)梯度馴化法從土壤中篩選BaP降解菌。以BaP為唯一碳源時，BaP的濃度梯度為5、25、50、75、100 mg/L；以芘和BaP為唯一碳源時，芘和BaP的濃度梯度各為2.5、12.5、25、37.5、50 mg/L。其中，MSM的組成為：0.5 g (NH4)2SO4; 0.5 g NaNO3; 0.02 g CaCl2; 0.2 g MgSO4·7H2O; 1.0 g KH2PO4; 1.0 g NaH2PO4; 0.005 g FeSO4·7H2O; 1 mL 微量元素混合溶液(35 mg (NH4)6Mo7O24·4H2O; 40 mg MnSO4·H2O; 43 mg ZnSO4·H2O，無菌水定容至1 L)，無菌水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0。

為了確定篩選出的菌株對BaP的降解能力，在液體體系中進(jìn)行了菌株對BaP的降解實驗。將篩選出的兩株菌分別加到Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中，并在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至OD600為1.0。準(zhǔn)備若干滅菌的三角瓶，向各三角瓶中加入等量的BaP和18 mL無機鹽液體培養(yǎng)基，使BaP的初始濃度為40 mg/L。然后將三角瓶分為三組，第一組中加入2 mL以BaP為唯一碳源和能源篩選出的菌液，第二組加入2 mL以芘和BaP為唯一碳源和能源篩選出的菌液，第三組不加菌，而加入2 mL Luria-Bertani液體培養(yǎng)基作為空白對照組。將所有三角瓶置于30 ℃、150 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)，采用整瓶批次采樣[7]的方式每2 d取樣，用GC-MS測定各組三角瓶中BaP的剩余濃度。

對菌株JB1和JB2分別進(jìn)行基于16S rDNA基因的測序分析，將測得的細(xì)菌序列通過Blast在GenBank中進(jìn)行相似性檢索。

1.2 BaP降解菌的固定化

首先將菌株JB1、JB2混合置于LB液體培養(yǎng)基中于30 ℃、150 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)期，之后以改性煤渣和改性PVA為載體材料，通過包埋的方式將JB1 JB2固定化[8]，具體操作如下：首先將100目煤渣置于6 mol/L鹽酸中浸泡24 h后，反復(fù)沖洗至pH達(dá)到6～7，以去除煤渣中存在的對微生物有害的金屬如Al、Cr、Cu、As、Hg、Cd、Pb等[9]。將經(jīng)滅菌的改性煤渣、改性PVA和生長至對數(shù)期的BaP降解菌充分混合，三者比例為18∶15∶2(g,mL,mL)，制成直徑為6～8 mm的球。制成的固定化微生物小球先于4% CaCl2溶液中浸泡12 h，充分交聯(lián)，再在無菌水中浸泡3 d，最后在增值培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)3 d，每日續(xù)加增殖培養(yǎng)基。

采用李婧[10]的方法測定固定化小球的直徑、密度、傳質(zhì)性能、機械性能。參照Chunk和Okabe的方法[11]利用掃描電鏡(JSM-840,日本)觀察固定化煤渣粒的微觀結(jié)構(gòu)及其中包埋的菌的生長情況。分別使用BET儀(ST-08A)和EDS能譜分析儀(FEI Quanta 200FEG)測定載體煤渣的比表面積和主要元素組成。

1.3 蘆葦—固定化微生物聯(lián)合降解BaP

設(shè)置4個相同的濕地模擬裝置A-D，向各裝置中加入等量的污染土壤，并分別對各裝置中的土進(jìn)行如下處理：

Plot A：不做任何處理，作為空白對照組；

Plot B：在距離土壤表層10 cm深處添加300 g生物煤渣粒(包埋菌量為0.6×109～1.2×109cells)；

Plot C：種植4株蘆葦；

Plot D：種植4株蘆葦并在距離土壤表層10 cm深處添加300 g生物煤渣粒(包埋菌量為0.6×109～1.2×109cells)。

將濕地模擬裝置放置在室外自然環(huán)境下，并使土壤含水量保持在30%～40%。分別于0、2、4、6、10、14、20、30、42、60 d采集土壤樣品，將采集的土壤樣品放置在低溫避光條件下風(fēng)干。使用超聲萃取法[3]提取土樣中的PAHs，并用GC-MS進(jìn)行定量分析。在第0、2、4、6、10、14、20 d同一時間采集Plot C和Plot D組中蘆葦?shù)母捣置谖铮瑯悠方?jīng)0.22 μm濾膜過濾，用離子色譜(ICS-5000)測定其中氨基酸、可溶性糖及低分子量有機酸的含量。

1.4 生物煤渣粒對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

為了判斷生物煤渣粒的加入對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，選取模擬實驗開始后第0、42、60天從濕地模擬裝置D中采集的土壤樣品為研究對象，使用Power Soil DNA提取試劑盒提取土壤中微生物的DNA，并進(jìn)行基于16S rDNA的高通量測序。根據(jù)對測序結(jié)果的分析，得出土壤中微生物的多樣性及群落結(jié)構(gòu)方面的信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 BaP降解菌及其性能分析

以BaP或芘和BaP為唯一碳源和能源，經(jīng)梯度馴化從污染土壤中篩選出了2株BaP降解菌，分別命名為JB1和JB2。對JB1(登錄號為KU199711)和JB2(登錄號為KU199712)菌株的16S rDNA基因進(jìn)行測序，將兩菌株的基因序列通過NCBI的BLAST程序比對，發(fā)現(xiàn)兩株菌均與假單胞菌屬的多個菌株具有相似性。其中，JB1與Pseudomonasveronii同源性最高，同源率達(dá)到97.9%，JB2與Pseudomonasplecoglossicida相似度最高，達(dá)到97.0%。JB1、JB2的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。結(jié)合菌株形態(tài)及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹位置，確定JB1和JB2為假單胞菌(Pseudomonas)。

為了進(jìn)一步確定菌株JB1、JB2對BaP的降解能力，在液體體系中分別進(jìn)行了JB1和JB2對BaP的降解實驗，結(jié)果在BaP初始濃度為40 mg/L的情況下，經(jīng)過24 d的降解，JB1、JB2對BaP的降解率分別達(dá)到65.2%和61.0%(見圖2)。這說明菌株JB1、JB2對BaP具有較強的降解能力。已有的研究也已證實一些假單胞菌屬的細(xì)菌能夠降解包括BaP在內(nèi)的PAHs[12-15]。

2.2 生物煤渣粒及其理化性質(zhì)

以改性煤渣和改性PVA為載體，通過包埋的方式將生長至對數(shù)期的JB1和JB2混合菌株固定化，得到固定化生物煤渣粒。固定化煤渣粒的直徑為6～8 mm，密度為1.5～2 g/cm3。其機械程度高，經(jīng)48 h的機械震蕩(轉(zhuǎn)速為300 r/min)，全部都完好無損，說明固定化煤渣粒能夠抵抗外界一定的環(huán)境壓力[16]。傳質(zhì)性能以公式(1)進(jìn)行表征，生物煤渣粒吸附了92.8%的亞甲基藍(lán)，表明它的傳質(zhì)性能較好，微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和排出的代謝廢物能夠自由進(jìn)出，不受限制，進(jìn)而起到高效降解作用。

圖1 菌株JB1(a)和JB2(b)基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on bacterial 16S rDNA sequences of the isolate JB1 (a) and JB2 (b)

圖2 無機鹽培養(yǎng)基中JB1和JB2對BaP的降解曲線Fig.2 Biodegradation curve of benzo[a]pyrene by JB1 and JB2 in MSM

A=(A0-A1)/A0

(1)

用掃描電鏡對生物煤渣粒進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3所示。固定在煤渣內(nèi)部的菌長約1～2 μm，寬約0.5 μm，其大于煤渣的孔徑，故菌能夠穩(wěn)定存在于煤渣球內(nèi)部，從而避免了外界不利環(huán)境條件的影響。同時，煤渣疏松多孔，能有效地與外界進(jìn)行氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的交換，從而有助于微生物的生長及對污染物的降解，這與煤渣粒傳質(zhì)性能的測試結(jié)果相一致。

對載體材料比表面積和元素組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，改性煤渣作為一種載體材料，能為微生物的生長和代謝提供營養(yǎng)，促進(jìn)微生物對污染物的降解。一方面，載體煤渣的比表面積為26.14 m2/g，而經(jīng)改性后的煤渣的比表面積增加到了37.74 m2/g，較大的比表面積和較多的孔徑有利于煤渣粒吸收營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣[17]，并且可以增加生物煤渣粒與污染物質(zhì)的接觸面積，起到加速BaP降解的作用。另一方面，煤渣的主要組成元素為C、O、N、Si、Fe、Ca、Mg、Al、Cr、Cu、As、Hg、Cd、Pb等。其中，Al、Cr、Cu、As、Hg、Cd、Pb等金屬元素對微生物和環(huán)境是有害的。而煤渣經(jīng)鹽酸改性后，有害金屬元素則大幅度去除，C、O成為最主要的元素，分別占55.10%和26.08%，此外還有Si、Fe、N等元素，這些元素可以作為微生物的營養(yǎng)物質(zhì)，且煤渣上的大量含氧官能團(tuán)還有利于其與土壤中污染物的結(jié)合與反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)BaP的降解。

圖3 包埋菌株JB1和JB2的固定化煤渣粒的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy (SEM) micrographs of srain JB1 and JB2 immobilized in the coal cinder beads

2.3 BaP的生物降解效果分析

經(jīng)42 d的降解，四個濕地模擬裝置中土壤的BaP含量均有不同程度的降解。Plot A-D組土壤中BaP的降解率分別為15.1%、54.6%、28.9%和69.3%。添加生物煤渣粒(Plot B)、種植蘆葦(Plot C)、添加煤渣粒并種植蘆葦(Plot D)的濕地模擬裝置中的土壤中BaP的降解率均高于對照組(Plot A)，且固定化微生物和蘆葦共同作用的結(jié)果比生物煤渣?；蛱J葦單獨作用的效果好，這說明兩者能在一定程度上對BaP的凈化起到協(xié)同作用。這種協(xié)同作用在Toyama等的研究中也有所體現(xiàn)。Toyama等[18]發(fā)現(xiàn)分枝桿菌與蘆葦根系分泌物之間的相互作用能夠加速蘆葦根際沉積物中芘和苯并[a]芘的生物降解。

本文中Plot D裝置中BaP降解效果最好的原因如下。一方面，蘆葦能夠吸收轉(zhuǎn)化一部分PAHs，蘆葦根際分泌物能夠增強微生物活性[19-22]，微生物對BaP的降解又促使蘆葦產(chǎn)生更多的根系分泌物。在整個實驗期間，檢出的蘆葦根系分泌物主要有精氨酸、海藻糖、馬來酸、琥珀酸和乙酸，如圖4。種植蘆葦并添加生物煤渣粒的Plot D中的精氨酸含量整體上低于只種植蘆葦(Plot C)中的含量，且隨著降解的進(jìn)行，精氨酸含量不斷減少，說明精氨酸可能作為營養(yǎng)物質(zhì)或苯并[a]芘的共代謝物[23]而被微生物所利用，進(jìn)而促進(jìn)BaP的降解。Plot D中海藻糖的含量也低于Plot C，但隨著降解的進(jìn)行，其含量不斷增多，說明海藻糖不僅可以作為營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)BaP的降解，還可以作為細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)[24]，在植物和微生物生長的刺激下不斷分泌。而Plot D中低分子量有機酸(馬來酸、琥珀酸、乙酸等)的含量則高于Plot C，說明低分子量有機酸在生物煤渣粒的刺激下得以更多的分泌。有研究表明，低分子量有機酸作為植物根系分泌物的主要組成成分，不僅可以使吸附在土壤有機質(zhì)上的污染物釋放出來[25-29]，還可以影響微生物的表面[30]，加強降解菌與污染物的聯(lián)系[31]，進(jìn)而促進(jìn)其降解。另一方面，生物煤渣粒增加了接種微生物的數(shù)量及其穩(wěn)定性，加快了微生物降解BaP的反應(yīng)啟動速度[32-33]；如前文所述，其載體材料煤渣疏松多孔，比表面積大，富含多種營養(yǎng)元素，能夠保證固定化生物煤渣粒和外界高效地進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及代謝廢物的傳輸，增加微生物與BaP接觸的面積，從而促進(jìn)BaP的降解。

圖4 濕地模擬裝置中蘆葦和菌株JB1、JB2聯(lián)合作用對苯并[a]芘的去除曲線Fig.4 Wetland simulator studies on BaP depletion in BaP-contaminated soil by reeds and strains JB1 and JB2 immobilized in cinder beads as a function of time

圖5 Plot C和Plot D中根系分泌物的含量變化Fig.5 Root exudates detected in plots experiments and their change in Plot C and Plot D

2.4 固定化生物煤渣粒對土壤微生物群落多樣性的影響

選擇Plot D組在實驗第0、42、60 d的土樣為研究對象，編號為S1-S3。提取土樣中微生物的DNA，并進(jìn)行高通量測序分析，根據(jù)分析結(jié)果計算各土樣的Shannon指數(shù)，以此分析添加固定化生物煤渣粒對土壤微生物群落多樣性的影響。樣品S1、S2的Shannon指數(shù)分別為9.1、4.9，說明添加固定化微生物后，對土壤中土著微生物產(chǎn)生了較大的影響，使土壤中微生物群落的多樣性明顯減小，這與類似的研究結(jié)果相一致。Huang等[8]采用蘆葦—固定化微生物對土壤中芘和茚并(1,2,3-cd)芘進(jìn)行凈化后，土壤中微生物群落的多樣性也大幅減少，Shannon指數(shù)由實驗開始時的9.3減至5.3。本文又分析了實驗第60 d的土壤樣品S3的Shannon指數(shù)，結(jié)果表明在BaP的降解結(jié)束后，土壤經(jīng)過一段時間的恢復(fù)，其中微生物群落的多樣性也有所恢復(fù)，Shannon指數(shù)又回升至7.2。這說明向土壤中添加固定化生物煤渣粒不會對土壤造成不可逆的負(fù)面影響。

在屬水平上分析了S1-S3各土壤樣品中物種的相對豐度，如圖5。未添加固定化微生物的S1土壤樣品中，約有90%的數(shù)據(jù)信息不能在屬水平上進(jìn)行準(zhǔn)確分類，大多數(shù)的屬所占比例不到1%，占比超過1%的屬有Pseudomonassp.、Rhodoplanessp.、Kaistobactersp.、CandidatusSolibactersp.、A4和Bacillussp.，分別占1.99%、1.78%、1.75%、1.22%、1.03%和1.00%，各屬分布較平均，含量前十中最低的屬也占到0.20%。在添加固定化微生物42 d后，土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，Pseudomonassp.是明顯的優(yōu)勢種，占到了20.23%，說明其在BaP的降解中占據(jù)絕對優(yōu)勢，能表現(xiàn)出較高的活性[34]。Mycobacteriumsp.和Achromobactersp.也是S2土壤樣品中的優(yōu)勢種，它們也是常見的PAHs降解菌[35-37]，會對BaP的降解起到促進(jìn)作用。在添加固定化微生物60 d后，因為降解已經(jīng)停止，經(jīng)過一段時間的恢復(fù)，土壤中微生物的多樣性得到一定的恢復(fù)，盡管Pseudomonassp.仍占據(jù)優(yōu)勢，但其占比相對于S2土樣已經(jīng)明顯降低，各屬微生物的占比也趨向均勻化。高通量測序結(jié)果表明，向土壤中添加固定化微生物對BaP降解進(jìn)行降解時，土壤中主要以降解PAHs的細(xì)菌群落為主，降解結(jié)束后，土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)則可以緩慢恢復(fù)。

圖6 屬水平上各樣品物種相對豐度的變化Fig.6 Composition and relative abundance of bacterial classes in phylum Proteobacteria based 16S rDNA sequences

3 結(jié)語

分別以苯并[a]芘、芘和苯并[a]芘為唯一碳源，從膠州灣濕地污染土壤中篩選出了兩株BaP高效降解菌，分別命名為JB1和JB2。在BaP初始濃度為40 mg/L的條件下，經(jīng)過24 d的降解，BaP分別被去除了65.2%和61.0%。菌株JB1和JB2的測序結(jié)果表明二者均是假單胞菌(Pseudomonassp.)。以改性煤渣、改性PVA為載體，將JB1和JB2的混合菌株以包埋的方式固定化為生物煤渣粒，該固定化煤渣粒機械強度及傳質(zhì)性能高且疏松多孔，有利于微生物與外界環(huán)境進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和代謝廢物的交換。載體煤渣富含多種元素、比表面積大，可為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)并增加微生物與BaP的接觸面積。濕地模擬實驗表明，種植蘆葦并投加固定化生物煤渣粒情況下，BaP的去除率高于蘆葦或固定化生物煤渣粒單獨作用的結(jié)果，蘆葦和生物煤渣?？梢詤f(xié)同降解BaP。此外，向土壤添加固定化微生物后，隨著微生物對BaP的降解，土壤中微生物的多樣性明顯降低，群落結(jié)構(gòu)趨向于以降解PAHs的細(xì)菌為主，如Pseudomonassp.，Mycobacteriumsp.，Achromobactersp.；降解結(jié)束18 d后，土壤中微生物的多樣性明顯提高，群落結(jié)構(gòu)也在一定程度上得到恢復(fù)。進(jìn)而說明用蘆葦-生物煤渣粒聯(lián)合修復(fù)濕地的PAHs污染不會對濕地土壤造成不可逆的負(fù)面影響。