劉龍鎮(zhèn)，田相利,2**，王明陽，李海東，李 麗,2，董雙林,2，馬家好

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，山東 青島 266235；3.廣州金水動物保健品有限公司，廣東 廣州 510510)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦，因其具有環(huán)境適應(yīng)性強、生長速度快、抗病能力強等優(yōu)勢，成為我國養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量最高的對蝦種類[1]。凡納濱對蝦于1988年引進我國后，其養(yǎng)殖便迅速遍及全國[2]。然而，隨著對蝦集約化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖水環(huán)境惡化、病害頻發(fā)等諸多問題日益嚴峻，嚴重影響了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

目前，國際上將微生態(tài)制劑分成3個類型：益生菌(Probitics)、益生元(Prebiotics)和合生素(Synbiotics)[3]。益生菌是指一類對宿主有益的活性微生物，能在一定范圍內(nèi)增進動物健康的活體微生物制劑，其作為抗生素的替代品，近幾年已得到迅速發(fā)展[4-5]。研究表明，益生菌不僅能夠降低養(yǎng)殖水體的氨氮、亞硝酸氮含量，改善水質(zhì)[6-7]；還可以通過與有害微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)及生存繁殖空間等機制，抑制有害微生物的生長繁殖，從而維持機體腸道微生態(tài)平衡[5]。與此同時，益生菌還可有效提高養(yǎng)殖生物體有關(guān)免疫酶活性，促進養(yǎng)殖生物體對飼料中蛋白營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，增強抗病性，提高成活率及增長率。目前益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中備受廣大學(xué)者和養(yǎng)殖戶所青睞，被視為抗生素的有力替代品之一[8-9]。而一般認為，微生態(tài)制劑與酶制劑間具有一定的協(xié)同作用[10-11]。飼用酶制劑具有高效、安全、環(huán)保等特點，在飼料工業(yè)中受到越來越多的重視。復(fù)合酶一般由一種或幾種單一酶制劑為主體，加上其他單一酶制劑混合而成，或者由一種或幾種微生物發(fā)酵獲得[12]。復(fù)合酶制劑能夠彌補胃腸道內(nèi)源酶不足，促進養(yǎng)殖生物體對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，解除飼料中多種抗營養(yǎng)因子，進而提高飼料的利用率[13-15]。同時，還能夠改善胃腸機能，有效抑制腸道中病原菌的繁殖，并且能夠提高機體免疫力[16-17]。

微生態(tài)制劑已在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用。然而，由于益生菌和酶制劑無法耐受對蝦配合飼料制粒過程中的高溫，導(dǎo)致在常規(guī)對蝦制粒工藝中通常難以進行添加。而在實際使用中，手工或通過拌料機現(xiàn)場拌料的方式不僅操作麻煩，使用中也存在溶失嚴重的缺點。本研究比較了幾種不同復(fù)合微生態(tài)制劑添加形式對凡納濱對蝦的生長、血清非特異性免疫酶活性及抗病力的影響，以期為微生態(tài)制劑科學(xué)復(fù)配及其在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中合理應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微生態(tài)制劑添加方式設(shè)計

本研究分別設(shè)計了4個不同處理和1個對照，具體如下：

A為對照組，即基礎(chǔ)飼料組。僅投喂對蝦配合飼料(粗蛋白含量42%)，不添加任何微生態(tài)制劑。飼料為由某廠家提供的凡納濱對蝦全價配合飼料，粗蛋白含量42%，生產(chǎn)工藝為擠壓成型，后熟化調(diào)質(zhì)。主要成分見表1。

B為拌服復(fù)合菌制劑組，即將液體復(fù)合菌制劑均勻拌到基礎(chǔ)飼料中，于干燥通風(fēng)處自然陰干后儲存于4℃環(huán)境下備用。其中，復(fù)合菌由芽孢桿菌(Bacillusspp.)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、酪酸菌(Clostridiumbutyricum)等組成，均為活菌。

C為后噴涂復(fù)合菌制劑組，即飼料制粒擠出經(jīng)干燥后，在<90℃溫度下，由后噴涂工藝將復(fù)合菌制劑均勻噴涂到基礎(chǔ)飼料中制成，干燥后水分含量<12%。復(fù)合菌組成和比例同上。其中，芽孢桿菌和酪酸菌為芽孢形式，嗜酸乳桿菌經(jīng)過包埋工藝處理。

D為復(fù)合菌酶顆粒制劑組，由復(fù)合菌與復(fù)合酶復(fù)配后經(jīng)低溫制粒而成(制粒時溫度<45℃，干燥后水分含量<12%)，與配合飼料粒徑、形態(tài)上均保持一致。其中，復(fù)合菌組成及比例同上。芽孢桿菌和酪酸菌為芽孢，嗜酸乳桿菌經(jīng)過包埋工藝處理；復(fù)合酶由消化酶和非淀粉多糖酶等組成，包括蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶等。使用時菌酶顆粒制劑添加比例為配合飼料的5%，簡單摻加即可。

E為固體發(fā)酵制劑組，即在凡納濱對蝦配合飼料配方組分中添加乳酸菌、酵母和芽孢桿菌等復(fù)合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)物，之后擠壓成型(<90℃)，但未經(jīng)后熟化調(diào)質(zhì)，為全價飼料。主要成分詳見表1。

B、C和D組最終投喂飼料中復(fù)合菌濃度為109cfu/g。

表 1 基礎(chǔ)飼料和添加固體發(fā)酵制劑的飼料主要成分Table 1 Composition of the basic and micro-ecological feed

1.2 實驗用蝦及日常養(yǎng)殖管理

本研究于青島瑞滋海珍品有限公司陽光棚進行。實驗所用凡納濱對蝦購于青島市寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司對蝦養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖用水鹽度17。實驗對蝦購買后暫養(yǎng)于400 L白色塑料桶中，進行馴化暫養(yǎng)，暫養(yǎng)時間為10天。暫養(yǎng)期間保持合適充氧，定時測定水溫、溶氧，定時投喂適量基礎(chǔ)飼料。同時，每天將養(yǎng)殖桶中用水的鹽度提升2，逐漸馴化直到鹽度升至青島瑞滋海珍品有限公司養(yǎng)殖用水的自然鹽度31。馴化暫養(yǎng)結(jié)束后穩(wěn)定3天，進行正式實驗。

馴化暫養(yǎng)結(jié)束后，將實驗用蝦饑餓一天。之后選取規(guī)格一致、無病無傷、健康活潑的凡納濱對蝦(2.66±0.02)g隨機放入15個相同規(guī)格的塑料桶(容積400 L)中，進行相關(guān)養(yǎng)殖實驗，每個水桶分別養(yǎng)殖80尾凡納濱對蝦蝦苗，每個處理分別設(shè)置了3個重復(fù)。整個養(yǎng)殖實驗一共持續(xù)54天。

每天上午8：30及下午5：00定時投喂，將飼料投喂到直徑為50 cm餌料盤中，日投喂量為對蝦體重的3%～5%(根據(jù)對蝦的攝食情況調(diào)節(jié)投喂量)。每次投喂前吸出并收集養(yǎng)殖桶和餌料盤中的殘餌和糞便，并換水1/3～2/3。每天檢查并記錄對蝦的攝食和死亡情況。

實驗期間，水溫平均在23 ℃左右，溶氧5mg/L以上，鹽度31，pH=8.0±0.1。

1.3 樣品的采集與處理

實驗結(jié)束后，將對蝦饑餓處理24 h，然后對每個養(yǎng)殖桶中的對蝦進行收獲、計數(shù)、稱重。

同時，每個養(yǎng)殖桶中隨機抽取15尾對蝦進行血清采集。首先，用1 mL無菌注射器從凡納濱對蝦腹部血竇中緩慢抽取血淋巴置于1.5 mL無菌離心管中。然后，于4 ℃環(huán)境下靜置過夜后，3000 r/min離心機中離心15 min。離心完畢，使用滅菌移液器將上層血清轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.4 指標測定

1.4.1 生長指標 實驗開始前稱重并記錄每個養(yǎng)殖桶中對蝦的初始重量。養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，清點、記錄對蝦的末數(shù)量，并稱重、記錄每個養(yǎng)殖桶中對蝦的末重量。在養(yǎng)殖過程中記錄各處理組每天的投餌量、收集記錄殘餌量、記錄死蝦的數(shù)量和重量。部分生長相關(guān)指標計算如下：

成活率=(實驗結(jié)束時蝦的末數(shù)量/實驗開始前蝦的初數(shù)量)×100%；

特定生長率(SGR)= [(lnW末- lnW初) /t]×100%；

餌料系數(shù)=M/(W初+WS-W末)。

式中：W初、W末、WS分別為對蝦平均初體重、對蝦平均末體重、養(yǎng)殖過程中死亡的對蝦的質(zhì)量；t為養(yǎng)殖時間；M為養(yǎng)殖過程中投餌量。

1.4.2 血清中非特異性免疫指標 對各處理對蝦血清中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutse，SOD)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)、溶菌酶(Lysozyme，LSZ)、總一氧化氮合酶(Total Nitric Oxide Synthase，TNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)活性進行相關(guān)測定。以南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒進行具體測定，參照試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 攻毒實驗 養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，保持養(yǎng)殖條件不變，將取樣后剩余的對蝦正常飼喂3天后進行副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)攻毒實驗。其中，每個處理分別設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)15尾蝦。所用副溶血弧菌由中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所提供。副溶血弧菌經(jīng)活化后接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，在28℃條件下振蕩培養(yǎng)18～24 h。之后，顯微鏡下血球計數(shù)板計算有效活菌數(shù)。最后，將一定量培養(yǎng)菌液離心5min，用滅菌海水重懸后潑灑到各處理組養(yǎng)殖桶中。攻毒過程中保證各處理組養(yǎng)殖桶中副溶血弧菌的終濃度為1×108cfu/mL。

攻毒實驗持續(xù)2周，攻毒期間養(yǎng)殖條件不變。每天觀察記錄對蝦的活力、攝食及死亡情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan's多重比較進行差異顯著性檢驗，以P<0.05為差異顯著水平，統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標準誤(Mean ± S.E.)表示。

2 結(jié)果

2.1 生長指標

不同處理對蝦的生長情況見表2?？梢钥闯?，各處理組對蝦成活率在實驗期間差異不大(P>0.05)。與對照相比，除拌服復(fù)合菌制劑組外，其余3個處理組均能夠顯著提高對蝦的增重率和特定生長率(P<0.05)。其中，固體發(fā)酵制劑組對蝦的增重率及特定生長率均最高。后噴涂復(fù)合菌制劑組、復(fù)合菌酶顆粒制劑組和固體發(fā)酵制劑組餌料系數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05)，但拌服復(fù)合菌制劑組餌料系數(shù)與對照組差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦生長的影響Table 2 Growth performance of L.vannamei fed with different omnibiotics

注：A為對照組，B為拌服復(fù)合菌制劑組，C為后噴涂復(fù)合菌制劑組，D為復(fù)合菌酶顆粒制劑組，E為固體發(fā)酵制劑組。表中同一列數(shù)據(jù)中不同字母間表示顯著差異(P<0.05)。
Note:A is the control group，B is hand-mixed composite probiotics group，C is spray coating techniques group，D is compound probiotics and enzyme preparation group，E is micro-ecological feed group.Data with different letters at the same column mean significant difference each other (P< 0.05).

2.2 非特異性免疫指標

2.2.1 超氧化物歧化酶 由圖1看出，復(fù)合菌酶制劑和固體發(fā)酵制劑組對蝦血清的超氧化物歧化酶(SOD)活性均顯著高于對照組(P<0.05)，但拌服與后噴涂復(fù)合微生態(tài)制劑處理組與對照組差異均不顯著(P>0.05)。不同處理組相比較，以生態(tài)飼料組對蝦SOD活性最高。

(A為對照組，B為拌服復(fù)合菌制劑組，C為后噴涂復(fù)合菌制劑組，D為復(fù)合菌酶制劑組，E為固體發(fā)酵制劑組。圖中不同字母間表示顯著差異(P<0.05)。下同。A is the control group，B is hand-mixed composite probiotics group，C is spray coating techniques group，D is compound probiotics and enzyme preparation group，E is micro-ecological feed group.Data with different letters at the same column mean significant difference each other (P< 0.05).The same as below.)

圖1 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響
Fig.1 Effects of different omnibiotics on the activity of superoxide dismutase (SOD) in the serum ofL.vannamei

2.2.2 堿性磷酸酶 由圖2可以看出，復(fù)合菌酶制劑和固體發(fā)酵制劑組對蝦血清堿性磷酸酶(AKP)活性顯著高于對照組(P<0.05)，但拌服與后噴涂復(fù)合微生態(tài)制劑處理組與對照組差異均不顯著(P>0.05)。不同處理組相比較，復(fù)合菌酶制劑和固體發(fā)酵制劑組對蝦血清AKP活性差異不大(P>0.05)，但均顯著高于其他處理組(P<0.05)。

2.2.3 酸性磷酸酶 由圖3可以看出，固體發(fā)酵制劑組和復(fù)合菌酶制劑組對蝦血清酸性磷酸酶(ACP)活性顯著高于對照組(P<0.05)，但拌服與后噴涂復(fù)合微生態(tài)制劑處理組與對照組差異均不顯著(P>0.05)。不同處理組相比較，復(fù)合菌酶制劑和固體發(fā)酵制劑組對蝦血清ACP活性差異不大(P>0.05)，但顯著高于后噴涂復(fù)合微生態(tài)制劑處理組(P<0.05)。

圖2 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦血清堿性磷酸酶(AKP)活性的影響Fig.2 Effects of different omnibiotics on the activity of alkaline phosphatase(AKP)in the serum of L.vannamei

圖3 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦血清酸性磷酸酶(ACP)活性的影響Fig.3 Effects of different omnibiotics on the activity of acid phosphatase (ACP) in the serum of L.vannamei

2.2.4 溶菌酶 由圖4可以看出，各處理組對蝦血清溶菌酶(LSZ)活性均顯著高于對照組(P<0.05)。不同處理組之間相比較，以固體發(fā)酵制劑組對蝦LSZ活性最高，但其他處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.5 總一氧化氮合酶(TNOS) 由圖5可以看出，后噴涂微生態(tài)制劑組與固體發(fā)酵制劑組對蝦血清總一氧化氮合酶(TNOS)活性顯著高于對照組(P<0.05)，但其他2個處理組與對照差異不大(P>0.05)。不同處理組相比較，以拌服復(fù)合菌制劑組對蝦TNOS活性最低，顯著低于其他處理組(P<0.05)。

2.2.6 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 由圖6可以看出，除拌服復(fù)合菌制劑組以外，其他各處理組對蝦血清誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性均顯著高于對照組(P<0.05)。不同處理組之間相比較，以固體發(fā)酵制劑組對蝦血清iNOS活性最高，而后噴涂復(fù)合菌制劑組和復(fù)合菌酶制劑組之間差異不大(P>0.05)，但均顯著高于拌服復(fù)合菌制劑組(P<0.05)。

圖4 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦血清溶菌酶(LSZ)的影響Fig.4 Effects of different omnibiotics on the activity of lysozyme (LSZ) in the serum of L.vannamei

圖5 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦血清總一氧化氮合酶(TNOS)的影響Fig.5 Effects of different omnibiotics on the activity of total nitric oxide synthase (TNOS) in the serum of L.vannamei

圖6 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦血清誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性的影響Fig.6 Effects of different omnibiotics on the activity of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the serum of L.vannamei

2.3 攻毒結(jié)果

潑灑副溶血弧菌后，被感染的對蝦表現(xiàn)為攝食量下降、附肢發(fā)紅、空胃、肝胰腺腫大、不好動或沿養(yǎng)殖桶壁漫游，活力弱，直至最后死亡。

圖7顯示了潑灑副溶血弧菌后各處理組對蝦的累積死亡率情況。從圖7中可看出，各處理組對蝦在攻毒后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，持續(xù)不同時間之后又逐漸停止死亡。其中，各處理組在攻毒開始后3～4天對蝦開始出現(xiàn)死亡，而對照組在第2天即出現(xiàn)死亡。固體發(fā)酵制劑組對蝦在攻毒后第7天停止死亡，其他處理組對蝦在第9～10天逐漸停止死亡。

整個攻毒實驗期間，固體發(fā)酵制劑組、后噴涂微生態(tài)制劑組和復(fù)合菌酶制劑組對蝦累積死亡率分別為25.0%、37.5%和50.0%，均顯著低于對照組(75%)(P<0.05)，而拌服微生態(tài)制劑組對蝦累積死亡率(68.8%)則與對照組差異不大(P>0.05)。各處理組之間比較，固體發(fā)酵制劑組對蝦累積死亡率為最低，拌服微生態(tài)制劑組最高。

圖7 潑灑副溶血弧菌后各處理組凡納濱對蝦的累計死亡率Fig.7 The cumulative mortality of L.vannamei challenged with V.parahaemolvticus

3 討論

3.1 不同復(fù)合微生態(tài)制劑及其添加方式對凡納濱對蝦生長的影響

目前，微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已得到廣泛應(yīng)用。研究表明，益生菌及其代謝產(chǎn)物可改善動物腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強動物腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，從而能夠有效促進動物的生長[18-19]。例如，王子彥等發(fā)現(xiàn)，微生物添加劑可顯著提高養(yǎng)殖魚類腸道淀粉酶和蛋白酶的活性[3,20-21]。丁賢等的研究表明，飼喂芽孢桿菌可顯著促進凡納濱對蝦腸道蛋白酶活性，提高對蝦成活率[22]。然而，目前關(guān)于微生態(tài)制劑的不同添加形式對其作用效果的影響少見報道。本研究比較了常用的液體拌服與飼料制粒后噴涂工藝兩種方式對同種復(fù)合菌制劑作用效果的影響?？梢钥闯觯后w拌服處理組對蝦增重率和特定生長率與對照組之間差異不顯著(P>0.05)，而飼料后噴涂工藝處理組均顯著高于液體拌服工藝處理組和對照組(P<0.05)。究其原因，可能主要與拌服不均勻，且由于附著性差，易使益生菌在水體中溶失而導(dǎo)致對蝦無法有效攝食有關(guān)。而采取飼料制粒后噴涂工藝，既可避免飼料在制粒過程中高溫、高濕對菌活性產(chǎn)生的破壞[9]，也可將益生菌更均勻的噴灑并滲透到飼料內(nèi)部，避免有效成分的溶失和配方失效[23]，從而能夠使益生菌更有效地被對蝦所攝食。

酶制劑作為外源性酶制劑添加到飼料中可彌補消化道內(nèi)源性酶的不足。一方面，幼齡動物消化道發(fā)育尚不完善，酶的分泌能力相對較弱，適量補充一些消化酶，對此階段的生長有突出的促進作用[24]。另一方面，外源性地補充動物自身不能分泌的非淀粉多糖酶(甘露聚糖酶、葡聚糖酶、木聚糖酶等)，可以消除日糧中植物細胞壁的“屏蔽效應(yīng)”，釋放養(yǎng)分[14]，還可以有效消除飼料中抗營養(yǎng)因子和某些毒素的有害作用[25]，從而提高對飼料中各種養(yǎng)分的消化率和吸收率，降低餌料系數(shù)[26]。例如，周小秋等發(fā)現(xiàn)，在鯉魚(Cyprinuscarpio)飼料中添加復(fù)合酶制劑能夠明顯促進鯉魚生長，降低餌料系數(shù)[27]。研究表明，酶制劑可以作為一種益生協(xié)同劑，可與益生菌聯(lián)合使用，二者具有良好的協(xié)同性[28]。在本研究中，復(fù)合菌酶制劑由芽孢桿菌、酪酸菌和嗜酸乳桿菌等益生菌以及蛋白酶、淀粉酶等消化酶和甘露聚糖酶、木聚糖酶等非淀粉多糖酶等酶制劑復(fù)配后經(jīng)低溫制粒工藝而制成。可以看出，與對照組相比，低溫制粒的復(fù)合菌酶制劑可顯著提高對蝦的增重率和特定生長率，顯著降低餌料系數(shù)(P<0.05)，效果優(yōu)于拌服復(fù)合菌制劑組。尹君等研究表明，微生態(tài)制劑與酶制劑共同作用提高了異育銀鯉的消化酶活性[3]。因此，推測酶與菌制劑協(xié)同使用有效提高了對蝦對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，促進了對蝦的生長。

近年來，微生物發(fā)酵培養(yǎng)物的功能受到廣泛關(guān)注，例如，酵母培養(yǎng)物目前已在畜禽行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[29-30]。本研究中的固體發(fā)酵制劑組在飼料中適量添加了部分由乳酸菌、酵母和芽孢桿菌等菌種復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)物。由于此飼料擠壓成型溫度低于90℃，且未經(jīng)后熟化調(diào)質(zhì)，因此在它的成分里，不僅含有部分存活的芽孢桿菌芽孢，還含有乳酸菌、酵母和芽孢桿菌等微生物細胞內(nèi)的營養(yǎng)物，以及發(fā)酵后產(chǎn)生的微生物代謝產(chǎn)物，甚至很多未知活性因子。從養(yǎng)殖實驗結(jié)果看，盡管生態(tài)飼料蛋白含量(36%)較對照組基礎(chǔ)飼料蛋白含量低(42%)，但對蝦的增重率和特定生長率卻顯著高于其他處理和對照組(P<0.05)，顯示了最優(yōu)的養(yǎng)殖效果。推測這可能與添加的微生物復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)物可更有效地改善對蝦腸道的微生態(tài)環(huán)境、增強腸道消化吸收功能、促進對蝦的健康生長有關(guān)。

3.2 不同復(fù)合微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦非特異性免疫指標及抗病力的影響

與脊椎動物不同，凡納濱對蝦不具有獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)作為抵御細菌和疾病的保護屏障，維持機體的正常生理平衡[31]。隋大鵬等研究認為，對蝦的溶酶體酶主要來源于血細胞和血淋巴，在對蝦的體液免疫中發(fā)揮重要作用[32]。其中，血淋巴中超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LSZ)、總一氧化氮合酶(TNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等活性是主要的評價指標[33]。

研究表明，益生菌及其代謝物可以作為良好的免疫激活劑，通過激發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫來增強機體免疫機能[4]，其作用機理可能是通過細菌本身或細胞壁成分刺激非特異性免疫系統(tǒng)使其發(fā)揮作用，從而提高動物免疫力[25]。本研究中，不同復(fù)合微生態(tài)制劑添加形式對凡納濱對蝦血清非特異免疫能力影響有所差別。其中，拌服復(fù)合菌制劑僅對蝦血清LSZ活性有提高作用，后噴涂復(fù)合菌制劑顯著提高了血清SOD、LSZ、TNOS和iNOS活性，而飼料中添加復(fù)合菌酶制劑則能夠顯著提高SOD、AKP、ACP、LSZ和iNOS的活性。而相比較，固體發(fā)酵制劑組在所有非特異免疫指標中幾乎都顯示出最佳的效果。分析其原因，后噴涂工藝使復(fù)合菌有效滲入飼料內(nèi)部，避免了益生菌在水體中的溶失，促進了對蝦對益生菌的有效攝入，從而體現(xiàn)出比拌服較好的效果。復(fù)合菌酶制劑的作用效果則表明了益生菌和酶制劑之間的協(xié)同作用可能對增強凡納濱對蝦的非特異性免疫能力具有更佳的效果。而固體發(fā)酵制劑組的效果則可能與多方面有關(guān)。一方面，固體發(fā)酵培養(yǎng)物中含有芽孢桿菌等益生菌，也含有多種微生物菌體營養(yǎng)物以及發(fā)酵產(chǎn)生的復(fù)雜代謝產(chǎn)物，這些均可能更為有效地提高對蝦的機體免疫力；另一方面，相對于普通的高蛋白飼料(粗蛋白含量42%，C/N 6.4)，添加固體發(fā)酵物的飼料蛋白含量較低(粗蛋白含量36%)、C/N較高(7.4)，可能更有助于促進腸道土著有益微生物的生長繁殖，從而有效改善腸道的微生態(tài)環(huán)境和腸道功能，提高機體免疫力。當(dāng)然，鑒于發(fā)酵培養(yǎng)物成分組成非常復(fù)雜，關(guān)于這一功能制劑的作用機理尚需進一步深入研究。

3.3 不同復(fù)合微生態(tài)制劑作用效果綜合比較

關(guān)于微生態(tài)制劑的作用機理，目前有很多不同解釋[34]。然而，由于微生態(tài)制劑組成、工藝等諸多方面存在的差異，不同的微生態(tài)制劑的實際作用機制可能更復(fù)雜。從本研究的結(jié)果看，與對照組相比，不同微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦生長性能改善程度的排序為固體發(fā)酵制劑組>復(fù)合菌酶制劑組>后噴涂復(fù)合菌制劑組>拌服復(fù)合菌制劑組，基本上與其對蝦血清非特異性免疫酶活性提高效果是一致的。但副溶血弧菌攻毒的實驗結(jié)果則存在一定的差異。副溶血弧菌是發(fā)現(xiàn)最早的對蝦EMS主要致病菌之一，被感染的對蝦可能出現(xiàn)紅腿病、紅體病和敗血癥等，發(fā)病迅速[35-36]。在本研究攻毒實驗中，固體發(fā)酵制劑組對蝦對副溶血弧菌的抗病力最強，后噴涂復(fù)合菌制劑次之，再次為復(fù)合菌酶制劑組，但拌服復(fù)合菌制劑組則與對照組相比差異不大。綜合來看，固體發(fā)酵制劑組在各方面均顯示出了最佳的效果。

除了幾種復(fù)合微生態(tài)制劑在成分組成的差別，其添加形式和生產(chǎn)工藝存在的差異也值得關(guān)注。本研究設(shè)置的4種不同的微生態(tài)制劑，實際上不同程度涉及了微生態(tài)制劑在添加形式和生產(chǎn)工藝等方面存在的不同，也反映了目前微生態(tài)制劑行業(yè)在產(chǎn)品使用、設(shè)計思路和工藝路線上存在的諸多差異。拌服是微生態(tài)制劑最常見的使用方式，不僅麻煩，由于溶失嚴重，其效果也難以保證。本研究結(jié)果在一定程度上驗證了這一缺陷。相比較，飼料生產(chǎn)后噴涂工藝則是一種添加微生態(tài)制劑的較好選擇。這種工藝過程規(guī)范，噴涂均勻，但對噴涂設(shè)備和干燥工藝要求相對較高。復(fù)合菌酶制劑在成分組成上具有較大的創(chuàng)新，使用上也比較方便，簡單摻合混勻即可。其成分配伍、顆粒形狀、規(guī)格等完全模仿配合飼料，對蝦在攝食上也不存在明顯的差異。但由于采用低溫制粒工藝，對生產(chǎn)設(shè)備和工藝要求也較高。一般來講，由于益生菌和酶制劑等無法耐受對蝦飼料加工過程的高溫，因此無法直接添加在飼料原料中制粒。在本研究中，飼料中添加了以死亡微生物菌體和微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物為主的復(fù)合微生物發(fā)酵培養(yǎng)物，大大降低了飼料生產(chǎn)的工藝難度。從養(yǎng)殖實驗結(jié)果看，不僅在較低的蛋白水平下獲得了較高生長速率，而且對免疫和抗病能力的影響也最佳，甚至養(yǎng)殖水體的水質(zhì)也明顯改善(未發(fā)表數(shù)據(jù))。盡管這一功能飼料的作用機理尚需進一步深入研究，但這一產(chǎn)品的配伍及生產(chǎn)工藝思路值得關(guān)注。

4 結(jié)論

飼料中合理添加復(fù)合菌制劑、復(fù)合菌酶制劑及復(fù)合菌培養(yǎng)物能有效促進凡納濱對蝦的生長，提高對蝦血清的非特異性免疫酶活性，增強對蝦對副溶血弧菌的抗病力。總體比較，后噴涂添加復(fù)合菌制劑、復(fù)合菌酶顆粒制劑效果優(yōu)于拌服復(fù)合菌制劑，而添加復(fù)合菌培養(yǎng)物的飼料效果最佳。