李鳳艷，王凱，朱鵬，孫國(guó)平*

(1.深圳市坪山區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518118；2.河南大學(xué)護(hù)理與健康學(xué)院，河南 開封 475000)

銀杏葉總黃酮具有調(diào)節(jié)血糖血脂，增加胰島素敏感性，改善肝功能；能夠提高抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化，增加抗氧化酶活性的作用；有效地抑制血小板凝聚，在抗菌、腫瘤、抗癌和神經(jīng)系統(tǒng)也有保護(hù)作用顯示較好的生物活性[1]。目前，銀杏葉總黃酮的提取工藝主要有傳統(tǒng)的水提取、有機(jī)溶劑提取和新技術(shù)輔助提取法，如微波輔助提取、超聲波輔助提取、閃式提取、超臨界流體萃取、酶輔助提取等提取技術(shù)[2-3]。其中，酶法提取技術(shù)近年來受到關(guān)注，與傳統(tǒng)提取方法相比，酶制劑能有效地破壞植物細(xì)胞壁的纖維組織，破壞細(xì)胞壁完整性，加快植物中的成分溶出，提高生產(chǎn)效率。較多文獻(xiàn)[4-10]僅探討某一種酶對(duì)總黃酮提取率的影響，對(duì)復(fù)合酶的應(yīng)用也只是簡(jiǎn)單的組合進(jìn)行探討[11]。因此，本研究將選擇三種酶(纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶)通過正交試驗(yàn)，以總黃酮提取率為指標(biāo)，探討三種酶組合的配比，并對(duì)組合后的復(fù)合酶的最佳提取工藝進(jìn)行深入研究，為銀杏葉總黃酮的提取工藝改進(jìn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、試劑與方法

1.1 材料與試劑

銀杏葉，2017年10月采摘于廣西壯族自治區(qū)桂林，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所寧德生助理研究員鑒定為正品銀杏葉Ginkgobiloba；蘆丁對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度為99.99%；纖維素酶、半纖維酶、果膠酶，均購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、甲醇、乙醇等試劑均為分析純，購(gòu)自西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XS205型、XS225A-SCS型賽多利斯電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；HHW-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 采摘后的銀杏葉經(jīng)分選后，放入烘箱，于105 ℃殺青15 mim，后于70 ℃烘干至恒重，然后放入中草藥粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，即得銀杏葉粉末。

1.3.2 對(duì)照品制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品2.46 mg，置于5 mL容量瓶中，加入乙醇超聲溶解，定溶至刻度，即得對(duì)照品溶液。

1.3.3 樣品溶液制備 分別精密稱2 g的銀杏葉粉末置于錐形瓶中，然后加入一定質(zhì)量的酶和15 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在一定溫度下酶解一定時(shí)間后，加入35 mL無水乙醇于70 ℃水浴中提取1 h后，將提取液過濾，濾液定溶于50 mL容量瓶，即得樣品待測(cè)液。

1.3.4 總黃酮的含量測(cè)定 分別精密吸取0.2 mL樣品待測(cè)溶液置于5 mL容量瓶中，分別加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后加入0.2 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min后，再加入2 mL 4%NaOH溶液，搖勻，用純水定容，靜置15 min，以試劑為空白，于504 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值[12]?？傸S酮提取率按式(1)計(jì)算。

提取率(%)=提取液中總黃酮的含量(mg)/提取所用銀杏葉粉末的質(zhì)量(mg)×100%

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

分別精密吸取0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.3、0.5、0.7 mL對(duì)照品溶液置于5 mL容量瓶中，分別加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后加入0.2 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min后，再加入2 mL 4%NaOH溶液，搖勻，用甲醇定容，靜置15 min，以試劑為空白，于504 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以蘆丁的量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y=0.002 7X-0.020 8(r=0.999 4)，表明蘆丁濃度與吸光度具有良好相關(guān)性。

2.2 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)

為了確定組成得復(fù)合酶(纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶)的配比，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。分別精密稱2 g銀杏葉粉末9份，按表1分別加入相應(yīng)的酶和15 mL pH為4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，于50 ℃水浴中酶解1 h，然后按1.3.3項(xiàng)下“加入35 mL無水乙醇”進(jìn)行樣品制備。

結(jié)果如表1所示，由相關(guān)系數(shù)R值由大小可知影響銀杏葉總黃酮提取率的次序?yàn)椋豪w維素酶>果膠酶>半纖維素酶，最佳的試驗(yàn)方案為A2B3C2，即由纖維素酶：果膠酶：半纖維素酶=2∶3∶1的配比組成的復(fù)合酶。

表1 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果

由于最佳的配比組合不在實(shí)驗(yàn)方案中，因此進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做未加酶的空白對(duì)照。結(jié)果復(fù)合酶法提取銀杏葉總黃酮得率為3.12%，而空白對(duì)照提取率為2.62%。由此可見，復(fù)合酶能夠有效地提高銀杏葉總黃酮的提取率。

2.3 復(fù)合酶提取工藝優(yōu)化

影響銀杏總黃酮得率的因素主要是復(fù)合酶的用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解溶液的pH等，為了探索最佳的提取工藝，進(jìn)行以下單因素試驗(yàn)。

2.3.1復(fù)合酶用量考察 由圖1可知，在pH為4.5，溫度50 ℃和酶解2 h條件下，銀杏葉總黃酮得率隨著復(fù)合酶用量的增加而提高，當(dāng)復(fù)合酶用量大于0.5%以后，增漲緩慢，還有下降趨勢(shì)，因此復(fù)合酶用量以0.5%為宜。

圖1 復(fù)合酶用量對(duì)黃酮得率的影響

2.3.2 酶解時(shí)間的影響 由圖2可知，銀杏總黃酮得率隨著酶解時(shí)間的增加而增大，但120 min以后，總黃酮得率增加放緩。這是因?yàn)槊附鈺r(shí)間越長(zhǎng)，酶反應(yīng)進(jìn)行越完全，越有利于總黃酮成分的溶出，使黃酮得率提高。因此，酶解時(shí)間以120 min為宜。

2.3.3 酶解溫度的影響 由圖3可知，酶解溫度在30～40 ℃時(shí)，銀杏葉總黃酮得率隨著酶解溫度上升而增加，40 ℃達(dá)到頂點(diǎn)，隨后得率隨著溫度升高而減低，這由于溫度升高，有利于提高酶解反應(yīng)速度，但同時(shí)也會(huì)破壞酶的活力。因此，酶溫度為40 ℃為宜。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

圖3 酶解溫度對(duì)總黃酮得率的影響

2.3.4 pH的影響 由圖4可知，pH的變化對(duì)黃酮得率的影響比較明確，pH值在4.0～5.5之間，總黃酮得率隨著pH的上升而提高，但當(dāng)pH超過5.5以后，總黃酮得率開始下降，因此適宜的pH為5.5。

圖4 pH對(duì)總黃酮得率的影響

2.3.5 復(fù)合酶提取工藝優(yōu)化 在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取4因素3水平L9(34)表頭設(shè)計(jì)，對(duì)復(fù)合酶用量(0.3%、0.4%、0.5%)、酶解溫度(35、40、45 ℃)、酶解時(shí)間(90、120、150 min)以及pH(5.0、5.5、6.0)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以探索各因素的相互作用對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響，從而明確復(fù)合酶提取工藝的最佳條件。結(jié)果如表2所示。

表2 復(fù)合酶提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

由相關(guān)系數(shù)R值和優(yōu)水平可知，酶法提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝條件為：酶用量0.4%，酶解溫度40 ℃，酶時(shí)間120 min，pH 5.5。但該條件并不在實(shí)驗(yàn)組里，因此，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果銀杏葉總黃酮的提取率為3.58%。由此可見，優(yōu)化后的提取工藝能夠顯著提高了銀杏葉總黃酮的提取率(3.58%)，與不加酶(2.62%)相比，總黃酮提取率提高了36.6%。

3 討論

在上述的單因素研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗(yàn)分析，表明復(fù)合酶對(duì)銀杏葉總黃酮提取具有增效作用。纖維素酶/果膠酶/半纖維素的配比為2∶3∶1時(shí)對(duì)銀杏葉的細(xì)胞組織具有較強(qiáng)的破壁力。進(jìn)一步的優(yōu)化研究表明，優(yōu)化后的提取工藝能夠顯著提高銀杏葉總黃酮的提取率，與不加酶相比，總黃酮提取率提高了36.6%，而且應(yīng)用復(fù)合酶法，可以降低酶的使用量[13]，提取條件溫和。