單睿陽(yáng)，林鄭和，陳志輝，鐘秋生，游小妹，陳常頌

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茶樹(shù)細(xì)胞色素P450基因與的克隆及差異表達(dá)特征分析

單睿陽(yáng)，林鄭和，陳志輝，鐘秋生，游小妹，陳常頌*

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015

利用NCBI茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，以鐵觀音芽葉為材料，克隆了茶樹(shù)細(xì)胞色素P450基因6與的cDNA全長(zhǎng)。與的cDNA全長(zhǎng)分別為1?879?bp和1?764?bp，分別含有1?539?bp（編碼513個(gè)氨基酸）和1?533?bp（編碼511個(gè)氨基酸）的完整開(kāi)發(fā)閱讀框。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，CYP71A26與CYP71B34的同源性為42.47%，為2個(gè)亞家族基因。氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明，2個(gè)基因均具有植物P450的螺旋C（Helix C）、螺線I（Helix I）、螺線K（Helix K）、“Meander”區(qū)域序列和血紅素結(jié)合域（Heme binding domain）的典型結(jié)構(gòu)。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，與在分子進(jìn)化樹(shù)上分屬兩大分支，2個(gè)基因與其他物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近不同。三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬與功能域分析顯示，CYP71A26與CYP71B34主要由N端的折疊和C端的螺旋結(jié)構(gòu)組成，且2個(gè)基因均具有一個(gè)P450蛋白結(jié)構(gòu)域（Pfam domain）。熒光定量PCR結(jié)果表明，與基因在不同茶樹(shù)害蟲(chóng)為害的葉片中，分別表現(xiàn)出上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象。而在冷熱環(huán)境下，與基因分別表現(xiàn)出下調(diào)和上調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象。表明茶樹(shù)與基因均參與了生物（害蟲(chóng)）與非生物（溫度）的脅迫響應(yīng)，但兩個(gè)基因表達(dá)相反，參與環(huán)節(jié)可能相反。

茶樹(shù)；細(xì)胞色素P450；克?。粊喖易寤?；脅迫；表達(dá)相反

細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，Cyt P450）是一類以血紅素為輔基的超家族酶系，該酶系多存在于生物體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum）、高爾基體（Golgi complex）和質(zhì)體（Plastid）等細(xì)胞器膜中。最早發(fā)現(xiàn)P450是在50年代，Axelrod[1]在研究肝臟時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞微粒體中存在一些能夠參與氧化代謝的酶系，進(jìn)而Garfinkel[2]發(fā)現(xiàn)該酶系能與一氧化碳（CO）結(jié)合，并在450?nm附近有最大吸收峰，故將其命名為細(xì)胞色素P450。到了60年代，Omura等[3]證實(shí)了該酶系屬于b型血紅色素蛋白（Haemoglobin）。70年代，開(kāi)始對(duì)P450酶的純化及特異性抗體的制備進(jìn)行了研究。80年代，開(kāi)啟了對(duì)P450基因的克隆、分子鑒定以及功能的研究。近20年來(lái)，P450的研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

在植物P450超家族基因簇中，最大的是CYPA71簇（簡(jiǎn)稱植物A-type P450集團(tuán)，又稱71 clan），這個(gè)基因簇基本上包含了超過(guò)半數(shù)的P450基因[4]，目前在水稻、玉米、擬南芥、番茄、大豆、松樹(shù)等植物中發(fā)現(xiàn)該基因簇具有復(fù)雜的生物學(xué)功能[5]。根據(jù)前人研究結(jié)果，大致可將這些功能歸為兩類：一類是起到內(nèi)源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化合成功能，如在苯丙烷類（Phenylaprapanoid）、植物激素類（Phytohormone）、萜類（Terpene）、黃酮類（Flavonoid）、木質(zhì)素（Lignin）和生物堿（Alkaloid）等的物質(zhì)合成過(guò)程中起到重要的作用[6]。這些通過(guò)代謝途徑合成的內(nèi)源性物質(zhì)，有的可以作為毒素或者殺蟲(chóng)劑，使植物對(duì)昆蟲(chóng)、病原菌產(chǎn)生抗性。有的可以作為信號(hào)分子，激活植物對(duì)病菌的抗性。另一類是對(duì)外源性物質(zhì)的代謝解毒功能，它可催化外源物質(zhì)如殺蟲(chóng)劑、除草劑和環(huán)境污染物等的代謝降解。例如，小麥對(duì)苯基脲類（Phenylureas）除草劑綠麥?。–hlortoluron）的代謝主要是通過(guò)P450的環(huán)甲基羥基化（Cyclomethylhydroxylation）所介導(dǎo)[7]。水稻對(duì)芐嘧磺?。˙ensulfuron-methyl，BSM）的降解主要通過(guò)P450的脫甲基（Demethylation）作用所催化[8]。

茶樹(shù)[(L.) O. Kuntze]屬多年生常綠木本植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。選育抗蟲(chóng)、抗病性強(qiáng)的茶樹(shù)新品種是茶樹(shù)育種的首要工作任務(wù)，而P450具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，因而許多P450基因已被克隆并鑒定，并應(yīng)用于作物的遺傳育種。如從擬南芥中克隆得到的已被廣泛應(yīng)用，該基因所產(chǎn)生的植保素在作物抵抗病菌侵染過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[9]。因而，篩選及研究茶樹(shù)P450基因的分子功能具有重要的意義。基于此，本研究利用NCBI已上傳的茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（Taxonomy ID：4442），從中篩選出了茶樹(shù)（GenBank登錄號(hào)：GARM01003853.1）與GenBank登錄號(hào)：KA281555.1）的2個(gè)基因片段，通過(guò)RT-PCR及RACE技術(shù)，克隆了該2個(gè)基因全長(zhǎng)。通過(guò)生物信息學(xué)軟件和在線網(wǎng)站分析了該2個(gè)基因的理化性質(zhì)、氨基酸結(jié)構(gòu)、進(jìn)化樹(shù)和功能域等信息。最后，檢測(cè)了該對(duì)基因在不同茶樹(shù)害蟲(chóng)為害的葉片中及冷熱環(huán)境下的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

本試驗(yàn)所使用的材料鐵觀音茶樹(shù)品種采集于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所2號(hào)山品種茶園（北緯27°8′~27°13′40″，東經(jīng)119°32′11″~119°38′之間）。植物總RNA提取試劑盒RNAprep pure plant kit (dp441)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing RT Kit（With gDNase）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和熒光定量試劑盒FastFire qPCR PreMix（SYBR Green）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；全長(zhǎng)cDNA克隆試劑盒SMARTer?RACE 5′/3′Kit購(gòu)自TaKaRa公司；dNTPs（各2.5?mmol·L-1）、Taq DNA聚合酶、DNase/RNase Free Water、DL2000 Marker、T4 DNA連接酶、pMD18-T、X-gal和IPTG等均購(gòu)自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆引物、定量引物的合成以及堿基序列的測(cè)序均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 總RNA提取及cDNA模板的合成

取適量生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)均勻的鐵觀音嫩葉（一芽一葉），將其液氮冷凍后研磨成粉，按照植物總RNA提取試劑盒（RNAprep pure plant kit，dp441）說(shuō)明書的操作步驟提取茶樹(shù)總RNA，再用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）檢測(cè)RNA的純度。最后，以提取的總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing RT Kit，With gDNase）的操作步驟，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，即用于普通RT-PCR擴(kuò)增的cDNA模板。

1.3 茶樹(shù)CYP71A26與CYP71B34基因中間片段的克隆

登入NCBI物種分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Taxonomy database），根據(jù)已登入的茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（Taxonomy ID：4442）信息，下載獲得茶樹(shù)的所有mRNA序列。該數(shù)據(jù)庫(kù)包含34萬(wàn)多條不完整的核酸序列，且無(wú)詳細(xì)基因命名信息，因而無(wú)法迅速找到所要研究的目的基因序列，故需要通過(guò)Windows系統(tǒng)建立單機(jī)版的茶樹(shù)本地Blast數(shù)據(jù)庫(kù)，再以P450為關(guān)鍵詞，通過(guò)序列的分析比對(duì)獲得本研究所需的（GenBank登錄號(hào)：GARM01003853.1）與（GenBank登錄號(hào)：KA281555.1）基因序列。詳細(xì)建庫(kù)方法參照華大基因的“Windows系統(tǒng)下本地Blast的實(shí)現(xiàn)”（www.genomics.cn）說(shuō)明書。

進(jìn)而根據(jù)已獲得的茶樹(shù)與的基因序列，分別設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物71A-F1/R1與71B-F1/R1（表1），以反轉(zhuǎn)錄合成的茶樹(shù)cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3?min；94℃變性30?s，62℃退火45?s，72℃延伸1?min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃，保存。之后，將目的條帶進(jìn)行回收并與載體pMD18-T進(jìn)行連接，在大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)化后，挑取白斑培養(yǎng)成菌液并委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 茶樹(shù)CYP71A26與CYP71B34基因的5'及3'RACE擴(kuò)增

在獲得茶樹(shù)與中間片段的基礎(chǔ)上，分別在5'端設(shè)計(jì)1對(duì)內(nèi)外鑲嵌引物71A-R2-inner與71A-R3-outer及71B-R2-inner與71B-R3-outer用于前端的5'RACE擴(kuò)增，以及在3'端設(shè)計(jì)1對(duì)內(nèi)外鑲嵌引物71A-F2-inner與71A-F3-outer及71B-F2-inner與71B-F3-outer用于尾端的3'RACE擴(kuò)增（表1）。5'RACE反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3?min；94℃變性30?s，65℃退火30?s，72℃延伸90?s，共39個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃保存。3'RACE反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3?min；94℃變性30?s，55℃退火30?s，72℃延伸90?s，共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min；4℃保存。最后將所獲得的各段序列進(jìn)行拼接，獲得茶樹(shù)與的基因全長(zhǎng)。

表1 本研究所用到的引物

注：F指正向引物，R指反向引物，inner指鑲嵌內(nèi)引物，outer指鑲嵌外引物。

Note: F represents positive primers, R represents negative primers, inner represents inside inlay primers, outer represents outside inlay primers, respectively.

1.5 茶樹(shù)CYP71A26與CYP71B34基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAstar 8.0軟件對(duì)茶樹(shù)與的全長(zhǎng)進(jìn)行拼接；利用ProtParam在線工具（http://web.expasy.org/protparam）對(duì)編碼區(qū)蛋白的分子式及理化性質(zhì)等進(jìn)行分析。利用Multalin 5.4.1在線網(wǎng)站（http://multalin. toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）比對(duì)CYP71A26與CYP71B34蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)；三級(jí)結(jié)構(gòu)由Swiss Model網(wǎng)站（http://www. swissmodel.expasy.org）分析獲得；蛋白功能域及跨膜結(jié)構(gòu)由Smart在線網(wǎng)站（http://smart. embl-heidelberg.de）分析得到；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)由MEGA 5.0軟件的鄰位相連法（Neighbor- joining, NJ）構(gòu)建得到。

1.6 茶樹(shù)CYP71A26與CYP71B34基因的表達(dá)檢測(cè)

1.6.1 樣品處理及取樣

選取生長(zhǎng)健壯，大小均勻的半年生茶苗，參照曹紅利等[10]的水培方法，于人工氣候室內(nèi)，于(23±0.5)℃，RH 70%，16L∶8D條件下，于小塑料柱形盆（直徑40?cm，高30?cm）中水培茶苗。水培營(yíng)養(yǎng)液的全配方參照Ruan等[11]。待茶苗培養(yǎng)2~3周，茶樹(shù)生長(zhǎng)穩(wěn)定后，進(jìn)行處理取樣。

試驗(yàn)處理分2組：（1）以鐵觀音為實(shí)驗(yàn)材料，采集茶園常見(jiàn)害蟲(chóng)茶尺蠖（）、小貫小綠葉蟬（）、茶橙癭螨（）和茶長(zhǎng)卷葉蛾（），每盆茶苗接入適量蟲(chóng)口量（每個(gè)蟲(chóng)害處理3盆，共15盆），再將茶苗放入人工氣候箱中，于(24±1)℃，RH 75%，12L∶12D條件下為害48?h后，于為害部位剪取約1?g的一芽一葉新鮮茶樣，以未受害蟲(chóng)為害的茶苗為對(duì)照，檢測(cè)與基因是否受蟲(chóng)害所影響。（2）參照以上步驟，將鐵觀音茶苗放入4℃和36℃人工氣候箱中，分別于12、24、36、48?h取樣，以0?h未經(jīng)溫度脅迫的茶苗為對(duì)照，檢測(cè)與基因冷熱脅迫后的表達(dá)情況。

1.6.2 qRT-PCR表達(dá)檢測(cè)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

熒光定量PCR每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)處理采用means±SE的計(jì)算方法，取平均值于GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software）軟件中進(jìn)行作圖。每組數(shù)據(jù)的差異顯著性分析結(jié)果（<0.05）由SPSS 13.0軟件中的鄧肯氏（Duncan’s multiple range test）單因素方差（One-way ANOVA）分析方法獲得。

注：M1—M6泳道：DL2000 DNA Marker，1—2泳道：與的中間片段克隆，3—4泳道：與的5'RACE產(chǎn)物，5—6泳道：與的3'RACE產(chǎn)物。

Note: Lane M1-M6: DL2000 DNA Marker. Lane 1-2: Intermediate fragment cloned ofandgene. Lane 3-4: 5'RACE product ofandgene. Lane 5-6: 3'RACE product ofandgene.

圖1 茶樹(shù)和基因的cDNA全長(zhǎng)克隆

Fig. 1 Cloning of the full length cDNA ofandgenesin

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)CYP71A26與CYP71B34基因的全長(zhǎng)克隆

利用茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的與序列信息，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆得到1?735?bp（圖1-泳道1）和1?154?bp（圖1-泳道2）的與中間序列。然后，通過(guò)5'RACE技術(shù)克隆得到309?bp（圖1-泳道3）和664?bp（圖1-泳道4）的與頭部序列。再通過(guò)3'RACE技術(shù)克隆得到452?bp（圖1-泳道5）和573?bp（圖1-泳道6）的6與尾部序列。最后，去除重復(fù)序列，拼接得到1?879?bp和1?764?bp的與全長(zhǎng)序列。采用DNAstar對(duì)基因全長(zhǎng)進(jìn)行分析，結(jié)果表明與分別含有1?539?bp （編碼513個(gè)氨基酸）和1?533?bp（編碼511個(gè)氨基酸）的ORF序列。通過(guò)ProtParam網(wǎng)站進(jìn)一步分析了編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，茶樹(shù)CYP71A26與CYP71B34的蛋白分子式分別為C1772H2803N481O526S12和C2687H4161N701O738S23，分子量分別為39.65?kDa和58.83?kDa，理論等電點(diǎn)分別為5.19和7.99，以及包含354和510個(gè)氨基酸殘基數(shù)。

2.2 茶樹(shù)CYP71A26與CYP71B34基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 氨基酸結(jié)構(gòu)分析

為明確茶樹(shù)與基因的ORF序列特征，將這2個(gè)基因的氨基酸序列制成faste文檔，并導(dǎo)入Multalin 5.4.1在線網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果表明，與的同源性為42.47%，且2個(gè)基因均具有植物P450的典型結(jié)構(gòu)，其中包括1個(gè)螺旋C（Helix C）序列“WxxxR”，1個(gè)螺線I（Helix I）序列“(A/G)Gx(D/E)T(T/S)”，1個(gè)螺線K（Helix K）序列“ExxR”，1個(gè)“Meander”區(qū)域序列“PxxFxPxxF”和1個(gè)血紅素結(jié)合域（Heme binding domain）序列“FxxGxRxCx(G/A)”（圖2）。

2.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

采用MEGA 4.0軟件中的鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ），將茶樹(shù)與基因的開(kāi)放閱讀框所推導(dǎo)的氨基酸序列與NCBI庫(kù)中其他物種和進(jìn)行比對(duì)并下載構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。從圖3可以看出，與基因在分子進(jìn)化樹(shù)上分屬兩大分支，分為兩大聚類（分別用“○”和“△”標(biāo)注，其中“○”標(biāo)注的為基因，“△”標(biāo)注的為基因。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，茶樹(shù)與大戟科的蓖麻（）（XP_002511297.1）和麻瘋樹(shù)（）（XP_012079955.1）親緣關(guān)系較近，而與葡萄科的葡萄（）（CAN67678.19）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。然而有趣的是，茶樹(shù)基因卻與葡萄科的葡萄（）（XP_002279272.2）親緣關(guān)系較近，而與大戟科的巴西橡膠樹(shù)（）（XP_021664607.1）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2.3 三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬與功能域分析

通過(guò)Swiss Model對(duì)茶樹(shù)與基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，結(jié)果表明，茶樹(shù)CYP71A26（圖4-A）與CYP71B34圖4-B）主要由N端的折疊（圖4中的紅色部分）和C端的螺旋結(jié)構(gòu)組成（圖4中的綠色部分）。另外，CYP71A26與CYP71B34蛋白三級(jí)模型的GMQE（Global Model Quality Estimation，全球性模型質(zhì)量估測(cè)）值分別為0.63和0.61（GMQE值在0~1之間，越接近1，建模質(zhì)量越好），表明建模可信度高。

注：紅色和黑色分別代表兩基因具有相同和不同的氨基酸序列，方框所圈氨基酸分別為：螺旋C、螺旋I、螺旋K、“Meander”區(qū)域和血紅素結(jié)合域序列。

注：圓圈和三角形分別代表不同植物的CYP71A26和CYP71B34基因，樹(shù)中所呈現(xiàn)的數(shù)字越大代表不同物種親緣關(guān)系越近。

通過(guò)SMART網(wǎng)站，進(jìn)一步分析了茶樹(shù)CYP71A26與CYP71B34蛋白的功能結(jié)構(gòu)域（Functional domain structure）。結(jié)果表明，CYP71A26與CYP71B34均具有1個(gè)P450蛋白結(jié)構(gòu)域（Pfam domain），分別位于各自編碼序列的第37~505（圖5-A中的黑色部分）和39~496（圖5-B中的黑色部分）位點(diǎn)上。另外，CYP71A26蛋白含有1個(gè)由“FSLLHPFFLSLLPLFFFTLLLL”組成的低復(fù)雜度區(qū)域（Low complexity）（圖5-A中的紫色部分），位于編碼序列的第2~23位點(diǎn)上。以及CYP71B34蛋白含有1個(gè)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)（Transmembrane structure）（圖5-B中的藍(lán)色部分），位于編碼序列的第7~29位點(diǎn)上。

注：紅色部分為N端的β折疊結(jié)構(gòu)，綠色部分為C端的α螺旋結(jié)構(gòu)。

注：數(shù)字代表氨基酸位置。Note: Numbers represent the amino acid position.

2.3 茶樹(shù)CYP71A26與CYP71B34基因的脅迫表達(dá)分析

2.3.1 不同蟲(chóng)害脅迫的表達(dá)檢測(cè)

以鐵觀音為實(shí)驗(yàn)材料，以未受蟲(chóng)害取食的葉片為對(duì)照，研究茶尺蠖（）、茶橙癭螨（）、小貫小綠葉蟬（）和茶長(zhǎng)卷葉蛾（）為害茶樹(shù)葉片48?h后，與基因的表達(dá)是否受蟲(chóng)害所影響。結(jié)果顯示（圖6），受上述茶園害蟲(chóng)為害后，茶樹(shù)基因分別上調(diào)了1.37、1.52、2.19和2.88倍，而茶樹(shù)基因分別下調(diào)了20.63%、8.26%、11.51%和69.23%。這表明，茶樹(shù)與基因分別受蟲(chóng)害所誘導(dǎo)和抑制，表達(dá)相反。

2.3.2 冷熱脅迫的表達(dá)檢測(cè)

以鐵觀音為實(shí)驗(yàn)材料，以常溫正常生長(zhǎng)的茶樹(shù)為對(duì)照，研究茶樹(shù)與基因的表達(dá)是否受冷（4℃）、熱（36℃）脅迫所影響。結(jié)果顯示，茶樹(shù)基因在冷熱條件脅迫下表達(dá)量均呈下降的趨勢(shì)，且隨著時(shí)間的推移表達(dá)量下降越明顯，在48?h時(shí)分別下降了91.39%（冷）和87.06%（熱）（圖7-A）；相反的，茶樹(shù)基因在冷熱條件脅迫下表達(dá)量卻呈上升的趨勢(shì)，且隨著時(shí)間的推移表達(dá)量上升越顯著，在48?h時(shí)分別上升了20.22倍（冷）和7.63倍（熱）（圖7-B）。

圖6 不同害蟲(chóng)取食茶樹(shù)后CYP71A26與CYP71B34基因的相對(duì)表達(dá)量

注：試驗(yàn)以茶樹(shù)GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，數(shù)據(jù)處理方法采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，柱上不同字母代表不同組數(shù)據(jù)間的顯著性差異（P<0.05）。

3 討論

P450廣泛存在于動(dòng)植物體中，由于P450具有超家族特性，因而在命名時(shí)根據(jù)編碼氨基酸序列的相似性將其分類命名。若氨基酸同源性大于40%則為同一家族，大于40%小于55%則為同一亞家族基因，大于55%則為同一亞家族的不同異構(gòu)體[12]。雖然不同家族P450的氨基酸序列差異較大，但其三級(jí)結(jié)構(gòu)卻是類似的，均由N端的折疊和C端的螺旋構(gòu)成。不同P450的主要功能域位點(diǎn)相當(dāng)保守，特別是與半胱氨酸（Cys）相連，起到接受電子的血紅色結(jié)合位點(diǎn)（Heme binding domain）、與氧原子或底物分子形成活性中心的螺線I（Helix I）、與血紅素形成電子拉鏈的螺旋C（Helix C）、具有穩(wěn)定血紅素核心結(jié)構(gòu)作用的螺線K（Helix K）和“Meander”區(qū)域序列[13]。本研究通過(guò)比對(duì)分析了茶樹(shù)與基因的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩基因的同源性為42.47%，且均具有上述保守序列結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析了該對(duì)基因的功能域，發(fā)現(xiàn)兩基因均具有1個(gè)P450蛋白結(jié)構(gòu)域，從而驗(yàn)證了與為兩個(gè)經(jīng)典的亞家族P450基因。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)與大戟科親緣關(guān)系較近，與葡萄科親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而基因卻與之相反。該現(xiàn)象可能與植物P450的堿基易變性有關(guān)。如前人研究結(jié)果表明，水稻基因具有調(diào)控花粉壁形成的功能，但該基因在第4個(gè)外顯子處經(jīng)常發(fā)生多堿基替換或缺少，導(dǎo)致天冬氨酸（Asp）轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼幔∕et）并造成纈氨酸（Val）的缺失[14]。而調(diào)控水稻枝梗延伸和小穗發(fā)育的1基因，經(jīng)常在第一個(gè)外顯子處發(fā)生堿基突變或缺失，導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼子[15]。因此，不同物種之間的與可能在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生堿基突變，而導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變，從而導(dǎo)致該對(duì)基因的分子進(jìn)化樹(shù)發(fā)生偏離。

P450酶系是自然界中最具催化活性的生物催化劑之一，但大多數(shù)植物P450基因在各組織中的表達(dá)量較低，特別是一些參與內(nèi)源信號(hào)分子代謝途徑的P450，很多需經(jīng)外界生物脅迫（如病蟲(chóng)害）后才響應(yīng)表達(dá)。如Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)煙草受蚜蟲(chóng)（）為害后，煙草腺毛中能誘導(dǎo)表達(dá)1個(gè)特異的P450基因，該基因可催化腺毛分泌的西柏三烯一醇轉(zhuǎn)化為西柏三烯二醇，從而提高對(duì)蚜蟲(chóng)的抗性。而受棉鈴蟲(chóng)（）為害的棉花，能誘導(dǎo)P450催化苯丙烷類的物質(zhì)代謝，而產(chǎn)生香檸檬烯（Bergapten）和花椒毒素（Xanthotoxin），從而延緩該蟲(chóng)的生長(zhǎng)[17]。本研究選取了不同茶樹(shù)害蟲(chóng)為害后的葉片做了表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因均受不同蟲(chóng)害所影響，但呈誘導(dǎo)表達(dá)，而基因則受抑制，表明2個(gè)基因均參與對(duì)害蟲(chóng)的防御作用，但2個(gè)基因的調(diào)控路徑可能相反。

另外，許多P450酶系受外界非生物脅迫（如溫度）的響應(yīng)。如對(duì)冷熱脅迫后的多年生黑麥草（）進(jìn)行RNA-seq測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)大量黑麥草P450基因響應(yīng)外界溫度脅迫，特別是最為敏感。進(jìn)一步通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序法分析了的甲基化狀態(tài)，證明了該現(xiàn)象與基因外顯子的CG堿基甲基化有關(guān)[18]。本研究對(duì)冷熱脅迫后的茶樹(shù)做了表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)基因不管在冷或熱脅迫下表達(dá)量均下降，而均上升，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，基因的下降或上升越顯著，從而說(shuō)明該對(duì)基因能夠響應(yīng)外界溫度的脅迫，但是否與CG堿基的甲基化有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究克隆了茶樹(shù)與基因的全長(zhǎng)。這2個(gè)基因均具有典型的P450序列及功能域，且為2個(gè)不同的亞家族基因。分析了該對(duì)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)兩基因的分子進(jìn)化樹(shù)發(fā)生偏離。分析了該對(duì)基因在不同蟲(chóng)害為害的葉片及冷熱脅迫后的表達(dá)差異，表明2個(gè)基因均參與了生物（害蟲(chóng)）與非生物（溫度）的脅迫響應(yīng)，但2個(gè)基因表達(dá)方向相反，參與環(huán)節(jié)可能相反。

[1] Axelrod J. The enzymatic demethylation of ephedrine [J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1955, 114(4): 430-438.

[2] Garfinkel D. Studies on pig liver microsomes I Enzymic and pigment composition of different microsomal fractions [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1958, 77(2): 493-509.

[3] Omura T, Sato R. A new cytochrome in liver microsomes [J]. Journal of Biological Chemistry, 1962, 237(4): 1375-1376.

[4] Schuler M A. Plant cytochrome P450 monooxygenases [J]. Critical Reviews in Plant Sciences, 1996, 15(3): 235-284.

[5] Zhao Y J, Cheng Q Q, Su P, et al. Research progress relating to the role of cytochrome P450 in the biosynthesis of terpenoids in medicinal plants [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2014, 98(6): 2371-2383.

[6] 解敏敏. 煙草重要基因篇: 8. 煙草P450基因[J]. 中國(guó)煙草科學(xué), 2015, 36(2): 118-120.

[7] Moore M T, Kr?ger R. Effect of three insecticides and two herbicides on rice () seedling germination and growth [J]. Archives of Environmental Contamination & Toxicology, 2010, 59(4): 574-581.

[8] Deng F, Hatzios K K. Characterization of cytochrome P450-mediated bensulfuron-methyl O-demethylation in rice [J]. Pesticide Biochemistry & Physiology, 2002, 74(2): 102-115.

[9] Zhou N, Tootle T L, Glazebrook J. Arabidopsis PAD3, a gene required for camalex in biosynthesis, encodes a putative cytochrome P450 monooxygenase [J]. The Plant Cell, 1999, 11(12): 2419-2428.

[10] 曹紅利, 王璐, 錢文俊, 等. 茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控?cái)M南芥對(duì)鹽脅迫響應(yīng)[J]. 作物學(xué)報(bào), 2017, 43(7): 1012-1020.

[11] Ruan J, Gerendás J, H?rdter R, et al. Effect of nitrogen form and root-zone pH on growth and nitrogen uptake of tea () plants [J]. Annals of Botany, 2007, 99(2): 301-310.

[12] 曹運(yùn)鵬, 程曦, 程俊, 等. 碭山酥梨細(xì)胞色素P450的基因組學(xué)分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2016, 30(2): 259-266.

[13] Gilardi G, Di Nardo G. Heme iron centers in cytochrome P450: structure and catalytic activity [J]. Rendiconti Lincei, 2017, 28(1): 159-167.

[14] 軒丹丹, 孫廉平, 張沛沛, 等. 水稻無(wú)花粉型核雄性不育突變體的鑒定與基因定位[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2017, 31(3): 247-256.

[15] 曾秀紅. 水稻簇生穗基因的精細(xì)定位[D]. 揚(yáng)州: 揚(yáng)州大學(xué), 2009: 1-2.

[16] Wang E, Wang R, DeParasis J, et al. Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichome glands enhances natural-product-based aphid resistance [J]. Nature Biotechnology, 2001, 19(4): 371-374.

[17] 戴素明, 周程愛(ài), 謝丙炎, 等. 細(xì)胞色素P450表達(dá)在植物防御反應(yīng)中的作用[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 22(7): 184-187.

[18] 代婭. 溫度脅迫下多年生黑麥草P450家族基因表達(dá)及LpCYP72A161甲基化差異分析[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 2016: 1-2.

Molecular Cloning and Expression Analysis of Cytochrome P450andGenes in Tea Plants ()

SHAN Ruiyang, LIN Zhenghe, CHEN Zhihui, ZHONG Qiusheng, YOU Xiaomei, CHEN Changsong*

Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fu′an, 355015, China

The full cDNA sequences of cytochrome P450 genes,andwere cloned fromTieguanyin leaves based on NCBI transcriptome database. The complete cDNA lengths ofandwere 1?879?bp and 1?764?bp, containing the open reading frames (ORF) of 1?539?bp and 1?533?bp, which encoded 513 and 511 amino acids, respectively. The alignment of amino acid sequences showed 42.47% of conservation between CYP71A26 and CYP71B34, which indicated that the two genes belonged to different subfamilies. The structure analysis showed that bothandcontained the classic P450 structure domains, such as helix C, helix I, helix K, Meander and heme binding domain. Phylogenetic tree analysis illustrated that there were two branches of molecular evolution for the two genes with different genetic relationship. Via predicting of their tertiary structures and functional domains, the results indicated that both genes were constituted by-pleated structure in N-terminal,-helix structure in C-terminal, and had a P450 protein structure domain (Pfam domain). qRT-PCR results showed that the expression of two genes in leaves showed opposite trends under pest damage treatments. Moreover, the decrease ofand increase ofin expression levels were detected under cold or thermal stresses. In total,andgenes were respond to biotic (like pest) and abiotic (like temperature) stresses, but the changing trends of the two genes were opposite, which might be correlated with opposite regulation systems.

, cytochrome P450, clone, subfamily gene, stress, expression opposite

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2018)05-450-11

2017-12-08

2018-01-30

國(guó)家茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、中國(guó)烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心專項(xiàng)（閩教科〔2015〕75號(hào)）、省財(cái)政廳項(xiàng)目（20151297）、福建省公益科研院所專項(xiàng)（2015R1012-10、2016R1011-3）

單睿陽(yáng)，男，研究實(shí)習(xí)員，主要從事茶樹(shù)遺傳育種研究。

ccs6536597@163.com