尹洪旭，楊艷芹，姚月鳳，張銘銘，王家勤，江用文，袁海波*

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栗香綠茶香氣萃取方法優(yōu)化及其芳香成分分析

尹洪旭1,2，楊艷芹1，姚月鳳1,2，張銘銘1,2，王家勤1,2，江用文1，袁海波1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 浙江省茶葉加工工程重點實驗室，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

以14個具典型栗香特征和2個甜香特征的綠茶茶樣為研究對象，比較了固相微萃取頭種類、萃取溫度、萃取時間及電解質(zhì)濃度對栗香香氣物質(zhì)種類和總量的影響，探索萃取栗香綠茶香氣物質(zhì)的適宜條件，并開展栗香綠茶的特征峰分析。結(jié)果表明，采用DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，在50℃下吸附50?min，電解質(zhì)濃度控制為1~3?mg·mL-1時，能達到最佳的吸附效果；在該條件下，共檢測出171種揮發(fā)性化合物，篩選出30個峰為栗香綠茶的共有特征峰，其中醇類5種、烯烴類4種，烷烴類7種，且各色譜峰相對峰面積的RSD≤5.0%，顯示其具有較好的重復(fù)性。通過夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法進行相似度分析，證實栗香特征峰具有較好的解釋能力。

綠茶；板栗香型；揮發(fā)性成分；頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜

綠茶是我國六大茶類之一，是我國產(chǎn)銷量最大、加工技術(shù)最為先進的茶葉品類[1]。就香氣特征而言，我國綠茶香氣可分為花香、清香、甜香、栗香等不同類型。栗香是一種類似于板栗的堅果香特征的香型，為中高檔綠茶的典型香氣。栗香的形成與茶樹品種、原料品質(zhì)、加工工藝等息息相關(guān)。如薛徐燕[2]專門選用梅占和奇蘭品種制作栗香玉芽茶；葉飛等[3]研究表明，汽熱-滾筒聯(lián)合殺青有助于形成栗香品質(zhì)。呂連梅等[4]提出炒干方式加工的產(chǎn)品更易于呈現(xiàn)栗香。

目前對茶葉香氣檢測分析的研究有較多報道，但大多數(shù)為不同萃取方法的綜合比較，針對某一特定香型的研究報道甚少[5-6]。不同香型茶葉的主要特征性香氣物質(zhì)存在較大差距，如花香的特征成分以芳樟醇、香葉醇、茉莉酮等為主，果香以沉香醇、紫羅酮等為主[7-8]，由于分子量、分子結(jié)構(gòu)及沸點等差異，不同香氣組分的萃取要求亦不相同。至今，綠茶栗香特征化合物尚不明確，特定的萃取優(yōu)化方法亦未建立；筆者認為，可能正是由于萃取方法的欠缺，導(dǎo)致特征物質(zhì)在制備過程中有所缺失，從而無法實現(xiàn)栗香香型的重構(gòu)驗證。

基于此，本論文以典型栗香綠茶為研究對象，以總峰面積為判斷標準，對綠茶典型的栗香香型開展萃取方法的系統(tǒng)研究，擬獲得針對此香型綠茶香氣物質(zhì)萃取的優(yōu)化參數(shù)，并據(jù)此開展后續(xù)系統(tǒng)分析，探索栗香綠茶共有特征成分，以期為其品質(zhì)評價和香氣調(diào)控提供理論指導(dǎo)和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶樣

北京吳裕泰茶業(yè)股份有限公司購置綠茶樣品120個。

1.1.2 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 6890N-5973型），250?mL的自制頂空微萃取瓶，SPME手柄以及DVB/CAR/PDMS、DVB/PDMS、PDMS、PA萃取頭（美國Supe1co公司）、電加熱磁力攪拌恒溫夾套（無錫順潤公司）。

1.2 茶葉感官審評

建立5人感官審評小組，小組成員均為具有國家中級評茶員及以上資質(zhì)的專業(yè)人員，采用GB/T 23776—2009的方法進行沖泡，著重對綠茶的香氣特征進行審評，開湯后直接熱嗅，記錄香型特征，并對香氣品質(zhì)進行十分制打分（0~3分為差，＞3~5分為較差，＞5~7分為中等，＞7~9分較好，＞9~10分為好）。待茶樣冷卻至常溫后，再次評定并記錄香型特征及香氣品質(zhì)打分。

1.3 試驗方法

1.3.1 香氣萃取流程及條件優(yōu)化設(shè)計

基于文獻[9]中栗香綠茶的萃取方法進行參數(shù)優(yōu)化。稱取茶樣（80目粉末）10.0?g，放入250?mL的自制頂空微萃取瓶中，在瓶中加入100?mg·L-1癸酸乙酯（內(nèi)標）500?μL，100℃超純水100?mL，以及一定量的NaCl，隨后用打過孔的橡皮塞（經(jīng)丙酮浸泡12?h，去味）塞緊，在特定溫度的恒溫夾套內(nèi)采用磁力攪拌器攪拌加熱（攪拌速度為450?r·min-1），水浴平衡5?min后，將帶有萃取頭（試驗前老化5?min）的SPME手持器透過瓶蓋橡皮塞插入自制頂空微萃取瓶中，于茶湯液面上空吸附特定時間，萃取完成后迅速將萃取頭放入GC-MS進行熱脫附解析檢測。

選擇3個得分最高的栗香綠茶作為試驗原料，根據(jù)HS-SPME香氣萃取流程對過程中的關(guān)鍵因子進行優(yōu)化比較，具體設(shè)計見表1。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

GC條件：采用DB-5MS毛細管色譜柱（30?m×0.25?mm×0.25?μm），載氣為高純氦氣，純度>99.999%，進樣口溫度：230℃，柱流速：1?mL·min-1，不分流。接口溫度：250℃。離子源溫度：250℃。離子化方式：EI。電子能量：70?eV。程序升溫參數(shù)：50℃保持5?min，以2℃·min-1升至180℃，保持1?min，再以10℃·min-1升到230℃，保持2?min。

MS條件：離子源EI，離子源溫度230℃，電子能量70?eV，發(fā)射電流34.6?μA，四級桿溫度150℃，轉(zhuǎn)接口溫度280℃，電子倍增器電壓350?V，質(zhì)量掃描范圍：35~400?amu。

1.3.3 GC-MS分析

由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST 8.0 L標準譜庫進行檢索比對，查對有關(guān)質(zhì)譜資料，從基峰、質(zhì)核比和相對豐度等方面進行分析，根據(jù)出峰時間各個香氣組分及各組分的相對含量。定量分析通過化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法進行計算，即以各香氣組分的峰面積占內(nèi)標物質(zhì)峰面積之比值表示組分的相對含量。

質(zhì)量控制：加入癸酸乙酯對整個萃取和檢測過程進行監(jiān)控，保證每個樣品圖中癸酸乙酯峰的保留時間變化率不超過1%，且峰面積變化率不超過10%。

表1 香氣萃取條件優(yōu)化設(shè)計表

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 8軟件建立GC-MS指紋圖譜；采用EXCEL 2007數(shù)據(jù)處理軟件進行相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官審評結(jié)果

在收集到的120個綠茶樣品中，經(jīng)感官審評篩選出14個具有典型栗香特征茶樣（兩次結(jié)果均呈現(xiàn)栗香風(fēng)味，且評分在8分以上的茶樣才能作為試驗茶樣），2個甜香茶樣。

目前，栗香綠茶尚未完全明確香型特征物質(zhì)，本試驗采用在典型栗香綠茶中萃取盡可能多的香氣物質(zhì)，以總峰面積為標準，在栗香香氣集合中尋找共同栗香特征物質(zhì)。

2.2 HS-SPME香氣萃取條件優(yōu)化

HS-SPME是一種集采樣、萃取、濃縮、進樣為一體，不使用有機溶劑，對揮發(fā)性物質(zhì)有強富集作用的樣品前處理技術(shù)，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)殘、植物保護等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。影響其萃取效果的因素主要包括萃取頭類型、萃取時間和溫度、電解質(zhì)、pH值等[10]。

2.2.1 萃取頭材料

萃取頭的選擇是香氣萃取中極為關(guān)鍵的因素，除需具備熱穩(wěn)定性好、耐溶劑、耐酸堿[11]等特點外，還應(yīng)與目標香氣成分有較佳的“溶解性”。4種材料的固相微萃取頭對香氣物質(zhì)總峰面積的影響如圖1所示。由分析結(jié)果可知，DVB/CAR/PDMS萃取頭所萃取栗香綠茶香氣物質(zhì)的總積分面積最大，顯示其對該類型香氣的吸附效果最佳，DVB/PDMS次之，PDMS和PA兩種材料的吸附效果較弱。推測其原因可能在于，固相微萃取的基本原理是“相似相溶”，4種材料中PDMS為非極性萃取頭，PA是極性萃取頭，兩者均只能單一地吸附茶葉中極性或非極性的香氣物質(zhì)，而DVB/CAR/PDMS兼有極性和非極性涂層，吸附范圍較廣，同時也說明栗香綠茶中極性和非極性香氣物質(zhì)均有一定含量。

2.2.2 萃取溫度

香氣物質(zhì)在萃取纖維與基質(zhì)間的分配系數(shù)受溫度的影響。對HS-SPME而言，高溫條件下可使香氣物質(zhì)的濃度增加，利于萃取，且能加強擴散和對流過程，縮短平衡時間，但溫度升高會引起香氣物質(zhì)分配系數(shù)的下降，造成萃取頭吸附能力降低[12]。不同的萃取溫度對栗香綠茶香氣成分萃取影響的結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看到，萃取溫度從40℃升高至50℃時，總峰面積快速提升，隨后呈逐漸下降趨勢，50℃和60℃處理間的差異相對較小，顯示相對高溫不利于栗香型綠茶香氣的萃取，適宜的萃取溫度為50℃。

注：香氣萃取時加入電解質(zhì)NaCl的量為0.1?g，萃取溫度50℃，萃取時間為40?min。

注：香氣萃取時選用DVB/CAR/PDMS萃取頭，加入電解質(zhì)NaCl的量為0.1?g，萃取時間為40?min。

2.2.3 萃取時間

萃取時間是試驗結(jié)果具有良好重現(xiàn)性的重要保證，在萃取初始階段，揮發(fā)性香氣物質(zhì)較容易被吸附到萃取頭中，隨著時間的延長，富集速度逐漸放緩，接近平衡狀態(tài)時，即使延長萃取時間，對香氣的富集亦極為有限[13]。從本試驗結(jié)果分析（圖3），萃取時間20~50?min，香氣物質(zhì)的總積分面積隨著萃取時間延長不斷增大，以20~30?min期間增幅最大，隨后增加速率放緩。至60?min時，特征峰面積與50?min處理基本保持一致，顯示此時吸附速率和擴散速率達到平衡，最終選取50?min作為最適宜萃取時間。

2.2.4 不同電解質(zhì)濃度

茶湯中加入定量的電解質(zhì)，有利于茶水溶液的化學(xué)環(huán)境產(chǎn)生極化作用，提高茶湯內(nèi)的極性化合物的離子化水平，使得揮發(fā)性化合物的離逸能力增強[13]。本試驗以NaCl為電解質(zhì)，加入不同質(zhì)量的NaCl電解質(zhì)后，香氣物質(zhì)總特征峰面積的變化如圖4所示。結(jié)果顯示，與未加入電解質(zhì)相比，加入電解質(zhì)后處理樣香氣物質(zhì)的總特征峰面積均有明顯提升，表明其離子化水平有不同程度增強，但加入過多反而會導(dǎo)致總面積下降（4?mg·mL-1），可能與其對香氣物質(zhì)吸附造成一定干擾有關(guān)。相比較而言，電解質(zhì)濃度控制在1~3?mg·mL-1時較為適宜。

注：香氣萃取時選用DVB/CAR/PDMS萃取頭，加入電解質(zhì)NaCl的量為0.1?g，萃取溫度為50℃。

注：香氣萃取時選用DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取時間為40?min，萃取溫度為50℃。

Note: Extraction Fiber: DVB/CAR/PDMS. Extraction time: 40?min. Extraction temperature: 50℃.

圖4 不同電解質(zhì)濃度對茶揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Fig. 4 Effect of Electrolyte concentration on the extraction of total volatile constituents

2.2.5 條件優(yōu)化后的穩(wěn)定性檢測

為考察優(yōu)化后方法的穩(wěn)定性，選取香氣品質(zhì)評分最高的栗香茶樣開展6次重復(fù)的香氣萃取試驗，萃取條件為：在水浴加熱50℃的環(huán)境下，在100?mL茶湯（茶水比為1∶10）中加入0.1?g NaCl，使用50/30?μm DVB/CAR/PDMS的萃取頭頂空萃取50?min后，迅速將萃取頭放入GC-MS進行熱脫附解析及檢測。結(jié)果顯示各色譜峰相對保留時間（=tri/trs，其中tri為待測峰的保留時間，trs為參照峰癸酸乙酯的保留時間）的相對標準偏差RSD≤1.0%，各色譜峰相對峰面積Sr（Sr=待測峰的峰面積/參照峰的峰面積）的相對標準偏差RSD≤5.0 %，表明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 基于優(yōu)化方法的栗香綠茶共有特征峰分析

2.3.1 栗香綠茶共有特征峰的篩選

在最優(yōu)條件下對14個栗香茶樣進行GC-MS測定，從中鑒定出171種揮發(fā)性化合物。根據(jù)總離子流圖中的峰數(shù)、保留時間、峰面積等參數(shù)以及成分鑒定結(jié)果，篩選出30個峰作為栗香綠茶的共有特征峰，如圖5所示。

30個共有特征峰按出峰時間依次為：甲氧基苯基-肟、苯甲醛、苯甲醇、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、芳樟醇、苯乙醇、3-甲基十一烷、萘、3-亞甲基十一烷、水楊酸甲酯、香葉醇、壬酸、2-甲基萘、吲哚、十三烷、1-甲基萘、-蓽澄茄油烯、3-甲基-十三烷、2,6,10-三甲基十二烷、()-己酸-3-己烯酯、十四烷、杜松烯、2-甲氧基乙酸十四烷基酯、-紫羅酮、-法尼烯、2,6-二叔丁基對甲酚、1,2,3,4,4a,7-六氫-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘、咖啡堿、棕櫚酸和植醇。其中烷烴類物質(zhì)有7種，醇類5種、烯烴類4種，芳香烴、酯類、其他類香氣物質(zhì)各有3種。

共有特征峰的相對保留時間和相對峰面積值如表2所示。從表中可以看到，就相對保留時間而言，共有特征峰介于0.273?3~1.584?8，主要集中于0.176?5~1.423?7，相對峰面積的平均值則介于0.006?4~0.242?4，其中相對高含量的香氣物質(zhì)（相對峰面積大于等于0.1）包括2,2,4,6,6-五甲基庚烷、芳樟醇、香葉醇、()-己酸-3-己烯酯、十四烷、杜松烯、2,6-二叔丁基對甲酚等。就香氣特征而言，共有特征峰中有19個組分具有特殊的香氣特征[14]，有木香、花香、果香、烘烤香等，其對栗香綠茶香型形成的貢獻還有待進一步深入研究。

2.4 栗香綠茶共有特征峰與甜香綠茶峰值相似度比較

對甜香綠茶進行GC-MS檢測，采用夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法[15]將其與栗香綠茶共有特征峰的相似度進行分析，以驗證特征峰對栗香綠茶香氣組成的代表性，結(jié)果見表3。

從表中可以看出，栗香綠茶30個特征峰的夾角余弦相似度在0.880?7~0.982?3，除2個茶樣外，其他茶樣相似度均大于90%，平均相似度達到0.939?8，處于較高水平；相關(guān)系數(shù)則在0.854?3~0.981?8，平均值為0.945?6，基本符合植物特征峰譜圖的相似度要求。甜香綠茶中30個特征峰夾角余弦的相似度在0.757?8~ 0.779?1，平均相似度為0.768?5，與栗香綠茶的平均相似度相差達到0.171?3；其相似度相關(guān)系數(shù)的平均值（0.706）亦與栗香綠茶的結(jié)果同樣相差較大，顯示栗香綠茶特征峰譜圖能夠較好對兩者進行判別，在一定程度上說明該特征峰具有較好的解釋能力。

3 討論

SPME因其具有方便快捷，靈敏度高，選擇性與重現(xiàn)性好，且能較真實地反映樣品尤其是自身特性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品香氣的分析研究[16-17]，在茶葉香氣萃取和檢測方面，目前主要以SPME與GC-MS聯(lián)用為主[18-19]。例如Wu等[20]在研究伍家臺富硒綠茶特征香氣物質(zhì)時，運用SPME-GC-MS定性得到94種揮發(fā)性成分，在普洱茶[21]、紅茶[22]等茶類中也有廣泛運用。隨著香氣檢測技術(shù)的快速發(fā)展，SPME與全二維氣相色譜飛行時間質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）的組合是目前萃取檢測香氣組分較為先進的手段，朱蔭等[23]利用此方法確定了西湖龍井茶中522個共有香氣組分，顯示其定性能力較一維色譜提高了5倍以上。此外，SPME/GC-O技術(shù)可以用來確定食品關(guān)鍵成分，對確定香味化合物的強度和作用大小具有重要的參考價值，如苗愛清等[24]利用該技術(shù)確定了白葉單樅茶、金萱、鐵觀音、黃金桂4種品種烏龍茶的關(guān)鍵成分。

圖5 栗香型綠茶GC-MS指紋圖譜

表2 栗香綠茶共有特征峰分析

表3 栗香與甜香綠茶峰值相似度分析

針對栗香綠茶的已有報道中，葉國柱等[9]發(fā)現(xiàn)-紫羅酮、植醇、芳樟醇等在區(qū)分栗香型和非栗香茶樣時達到顯著性水平，試驗時我們亦發(fā)現(xiàn)總峰面積最高的處理，此三者的峰面積和亦為最大，顯示其對栗香香型的顯現(xiàn)作用較大。本文提出的栗香揮發(fā)性特征成分中，醇類和萜烯類、醛類、酯類等具有較好的香氣品質(zhì)，這些成分也是栗香綠茶中重要的嗅感物質(zhì)，可能對栗香綠茶的“熟栗香”、“嫩玉米”品質(zhì)特征的形成起著直接促進作用。栗香在香氣審評中往往跟高香綠茶接近，已有研究[25]顯示，芳樟醇、水楊酸甲酯、()-己酸-3-己烯酯、香葉醇、-法尼烯是高香綠茶區(qū)別于普通烘青綠茶特征香氣的關(guān)鍵物質(zhì)，上述成分在本研究中也有檢出，進而體現(xiàn)栗香綠茶“香高”的風(fēng)味特征。

茶葉香型是由眾多特征香氣組分按照一定比例相互作用形成的整體感官感受，其表現(xiàn)受香氣組分種類、含量、閾值以及相互間互作效應(yīng)等多種因素的影響。因此我們認為，在篩選出的30種栗香特征成分中，其中的一些成分可能在感官上與栗香并不相似，但同樣存在參與栗香形成的可能。例如芳樟醇、香葉醇具有鈴蘭系清淡爽快、薔薇系溫和的花香，且兩種物質(zhì)互為異構(gòu)體[26]；經(jīng)互作作用會產(chǎn)生不一樣的風(fēng)味；而且同一香氣物質(zhì)，在不同香氣濃度下亦會顯現(xiàn)出不同香味特色，因此有必要在此基礎(chǔ)上針對香味閾值、香氣活度值等更深層次的顯味效應(yīng)展開研究，并借助重構(gòu)模擬實現(xiàn)栗香特征的精準調(diào)控。

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Optimization of AromaExtraction and Aroma Component Analysis on Chestnut-like Green Tea

YIN Hongxu1,2, YANG Yanqin1, YAO Yuefeng1,2, ZHANG Mingming1,2, WANG Jiaqin1,2, JIANG Yongwen1, YUAN Haibo1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tea Processing Engineer of Zhejiang Province, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China

Fourteen green tea samples with typical chestnut-like aroma and 2 samples with sweet aroma were used as materials and the optimal conditions including the type of extraction fiber, the extraction time, the extraction temperature and electrolyte concentration were selected by comparing the extraction effect of different conditions. The optimal conditions for preparing aroma of chestnut-like green tea were explored and the characteristic peak analysis of chestnut-like green tea was carried out. Results indicated that the optimal extraction conditions of chestnut-like green tea were as follows: extraction fiber DVB/CAR/PDMS, extraction temperature at 50℃, extraction for 50?min, electrolyte concentration of 1-3?mg·L-1. under this condition, 171 volatile compounds were detected and 30 peaks were identified as common characteristic peaks of chestnut-like green tea, including 5 alcohols, 4 alkenes, 7 alkanes. theRSDs of the relative peak areas were ≤5.0%, which showed a high repeatability. The similarity analysis of angle cosine method and correlation coefficient method proved that the characteristic peakscould well explain their contribution to chestnut-like fragrant.

green tea, chestnut-like aroma, volatile constituents, HS-SPME/GC-MS

TS272.5+1；O657.63

A

1000-369X(2018)05-518-09

2018-02-02

2018-03-06

國家自然科學(xué)基金（31471651）、浙江省自然科學(xué)基金（LQ18C160006）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）

尹洪旭，男，碩士研究生，研究方向為茶葉加工工程。

192168092@tricaas.com