孫浩本，顏鵬，陸鵬麒，毛忠貴，唐蕾,*

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南學(xué)大 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫,214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是微生物合成的短肽，由25～35個(gè)賴氨酸殘基經(jīng)α-COOH和ε-NH2縮合而成[1]。作為天然產(chǎn)物，ε-PL具有良好的生物相容性，無(wú)毒且具有廣譜抑菌作用，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，市場(chǎng)前景廣闊[2]。目前鏈霉菌發(fā)酵是ε-PL工業(yè)化生產(chǎn)的主要方式，由于產(chǎn)物濃度低、成本居高不下,對(duì)原始菌株進(jìn)行遺傳改造，獲得ε-PL高產(chǎn)菌株成為解決問題的首選方式。HAMANO等[3]研究發(fā)現(xiàn)，天門冬氨酸激酶是L-賴氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，HIRAKI等[2]通過(guò)解除/降低L-賴氨酸對(duì)天門冬氨酸激酶的反饋抑制，在早期的ε-PL生產(chǎn)菌改造中非常奏效，產(chǎn)量從原始菌株的0.2 g/L提升至2.1 g/L。但是這種通過(guò)對(duì)單一酶進(jìn)行改造的方法具有明顯的局限性。LI等[4]采用基因組重排技術(shù)(genome shuffling, GS)同時(shí)提高了StreptomycesgraminearusLS-B1對(duì)葡萄糖耐受性和ε-PL的產(chǎn)量；李雙等[5]從已有不同表型的ε-PL菌株出發(fā)，再進(jìn)行GS，使得ε-PL產(chǎn)量在原有基礎(chǔ)上有了進(jìn)一步提升；吳光耀等[6]采用核糖體工程菌株育種的手段，通過(guò)鏈霉素(Streptomycin, Str)和利福平素(Rifampin, Rif)2種抗生素抗性篩選，獲得了1株ε-PL高產(chǎn)突變株StreptomycesalbulusWG-608，其搖瓶產(chǎn)量達(dá)到3.7 g/L，較出發(fā)菌提高了42.3%。

建立在優(yōu)良菌株基礎(chǔ)上的發(fā)酵工藝優(yōu)化是提高ε-PL產(chǎn)量的另一種有效策略。KAHAR等[7]根據(jù)Streptomycesalbulus410在菌體生長(zhǎng)和ε-PL合成過(guò)程中的pH關(guān)系，建立了兩階段pH值調(diào)控策略，在5 L攪拌式發(fā)酵罐中補(bǔ)料-分批發(fā)酵，ε-PL產(chǎn)量從5.7 g/L提高到48.3 g/L。REN等[8]基于酸性pH值對(duì)菌體代謝活力的影響以及沖擊相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化，建立了一種酸性pH值沖擊策略，經(jīng)過(guò)192 h的補(bǔ)料-分批發(fā)酵，ε-PL的最高產(chǎn)量達(dá)到54.7 g/L，與未經(jīng)過(guò)pH值沖擊的發(fā)酵相比提高了52.5%。

添加不同的外源物質(zhì)也是一種有效的手段。CHEN等[9]從補(bǔ)料-分批發(fā)酵的72 h開始不斷脈沖流加1 g/L的L-賴氨酸直到發(fā)酵結(jié)束，最終的ε-PL產(chǎn)量達(dá)到37.6 g/L，比對(duì)照提高了6.2%。LIU等[10]在補(bǔ)料-分批發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)流加酵母粉的方式提高菌體活力、促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，最終的ε-PL產(chǎn)量為28.2 g/L，與對(duì)照相比提高了73%。

本研究的前期工作通過(guò)對(duì)GS菌株和親本菌株的比較，發(fā)現(xiàn)GS菌株具有較好的pH值和ε-PL耐受性及抗氧化脅迫能力，發(fā)酵后期細(xì)胞活性和ε-PL均保持較高水平。因此設(shè)想是否可以通過(guò)添加外源物質(zhì)，提高鏈霉菌ε-PL發(fā)酵過(guò)程中的抗氧化脅迫能力，從而達(dá)到產(chǎn)量提升的目的，為ε-PL的發(fā)酵控制提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

GS菌株Streptomycessp. AF3-44為作者實(shí)驗(yàn)室前期研究中經(jīng)過(guò)3輪GS篩選得到的ε-PL耐受型菌株[5]。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(BTN)、種子培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[5]。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 60.0，酵母粉 8.0，(NH4)2SO45.0，K2HPO4·3H2O 2.0，MgSO4·7H2O 1.0，ZnSO40.04，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03。1×105Pa滅菌20 min，用體積分?jǐn)?shù)為50%的氨水調(diào)pH值至6.9。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

固體培養(yǎng)、種子培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[5]。

搖瓶發(fā)酵：將濃度為2 mol/L的Vc母液，經(jīng)0.45 μm的濾膜除菌后，分別在相應(yīng)的發(fā)酵階段添加1 mL(對(duì)照組添加等體積無(wú)菌水)，為了避免添加后因pH值的下降對(duì)發(fā)酵帶來(lái)影響，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至發(fā)酵階段pH值。

分批發(fā)酵：在5 L發(fā)酵罐中，以裝液總體積為3.5 L進(jìn)行分批發(fā)酵，其中發(fā)酵培養(yǎng)基為3.26 L，種子液為0.24 L。發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30 ℃，初始轉(zhuǎn)速為200 r/min，通氣量維持在1 vvm，接種前校正溶氧為100%，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)菌體量增多，好氧需求變大，溶氧迅速降低，待溶氧降至20%時(shí)采用溶氧關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)速的方式來(lái)自動(dòng)控制溶氧水平，通過(guò)增加轉(zhuǎn)速來(lái)維持溶氧20%，每隔一定時(shí)間進(jìn)行取樣，分別對(duì)葡萄糖、菌體干重(dry cell weight，DCW)、ε-PL濃度進(jìn)行測(cè)定，直至葡萄糖耗盡后，發(fā)酵結(jié)束。添加Vc的分批發(fā)酵罐中預(yù)裝已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基3.06 L，種子液0.24 L，0.875 mol/L的Vc 0.2 L，總體積維持在3.5 L。在5 L罐上以不添加Vc作為對(duì)照組，pH值降到4.0時(shí)，通過(guò)流加體積分?jǐn)?shù)為50%的氨水維持pH值4.0至發(fā)酵結(jié)束。添加Vc的實(shí)驗(yàn)組在pH值自然下降到4.0時(shí)，通過(guò)流加體積分?jǐn)?shù)為50%的氨水維持pH值恒定的同時(shí)，將膜過(guò)濾的Vc溶液經(jīng)蠕動(dòng)泵緩慢流加，流加速率以溶氧維持20%進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。

1.2.2 發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的測(cè)定

ε-PL濃度的測(cè)定參考ITZHAKI等[11]的方法。DCW的測(cè)定參考CHEN等[12]的方法。

1.2.3 丙二醛(malonaldehyde，MDA)和ROS的測(cè)定

參考曾昕等[13]的方法。

1.2.4 細(xì)胞活力的測(cè)定

參考周永鵬等[14]的方法。

1.2.5 細(xì)胞提取液的制備

參考顏鵬等[15]的方法。

1.2.6 細(xì)胞膜脂肪酸含量的測(cè)定

參考任喜東[16]的方法。

1.2.7 抗氧化酶類活力測(cè)定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)參考史競(jìng)艷等[17-18]的方法。過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)參考燕國(guó)梁[19]的方法。

1.2.8 總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)的測(cè)定

采用總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒(奧青生物科技有限公司，南京)，按照說(shuō)明書的要求進(jìn)行操作。

1.2.9 顯著性分析

采用SPSS Statistics 19(IBM，USA)進(jìn)行方差分析(Fisher’s least significant difference，LSD)，當(dāng)p值<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Streptomyces sp. AF3-44菌株發(fā)酵過(guò)程中菌體活力和ROS水平的變化

前期研究表明AF3-44菌株胞外ROS的水平隨著發(fā)酵進(jìn)行呈上升趨勢(shì)，本研究采用DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)熒光染色的辦法，進(jìn)一步分析胞內(nèi)ROS的變化。DCFH-DA沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被酶水解為DCFH(dichlorofuorescin)。在ROS存在下，將DCFH氧化為不能透過(guò)細(xì)胞膜的強(qiáng)綠色熒光物質(zhì)DCF(dichlorofluorescein)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平與熒光強(qiáng)度成正比。

細(xì)胞活力常常以細(xì)胞有氧呼吸的能力來(lái)表征。作為一種細(xì)胞氧化還原代謝的指示劑，5-氰基-2, 3-二-(p-芐基-四唑氯化物)(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride, CTC)可進(jìn)入細(xì)胞，并被呼吸鏈中的還原酶還原，得到顯紅色熒光的產(chǎn)物[20]。

如圖1-A所示，ROS染色顯示綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，尤其是在54 h之后尤為明顯，說(shuō)明胞內(nèi)的ROS逐漸累積增多，ROS不斷積累會(huì)造成細(xì)胞的氧化損傷，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的氧化[21]，從而導(dǎo)致菌體活力降低；同時(shí)，CTC染色顯示紅色熒光強(qiáng)度減弱，表明菌體活力有所下降(圖1-B)。以上結(jié)果與搖瓶發(fā)酵過(guò)程參數(shù)變化相一致(圖2)，即在低pH值和ε-PL快速合成和積累的發(fā)酵后期，菌體受到的氧化脅迫增強(qiáng)，活力降低，因此通過(guò)外源添加抗氧化物質(zhì)有可能減少傷害的發(fā)生，提高菌體活力和ε-PL的發(fā)酵水平。

圖1 細(xì)胞內(nèi)ROS(A)和細(xì)胞活力(B)染色Fig.1 Cell intracellular ROS (A) staining and viability (B) staining注：圖A上半部分與圖B上半部分為熒光下拍攝的影像；圖A下半部分和圖B下半部分是明場(chǎng)下拍攝的影像。

圖2 搖瓶發(fā)酵過(guò)程參數(shù)Fig.2 Profile of process parameters in shake-flask fermentation

2.2 Vc對(duì)菌體生長(zhǎng)和ε-PL合成的影響

Vc可以清除微生物體內(nèi)多余的氧自由基，防止細(xì)胞受到氧化損傷[19]。XIAO等[22]在甲醇補(bǔ)料階段加入Vc可明顯緩解細(xì)胞內(nèi)ROS對(duì)細(xì)胞膜的損傷，發(fā)酵結(jié)束時(shí)細(xì)胞活力增強(qiáng)，水蛭素產(chǎn)量達(dá)到5.0 g/L比對(duì)照高出7%。在青霉菌的類胡蘿卜素生產(chǎn)中，Vc的添加替代了β-胡蘿卜素的抗氧化作用[23-24]。REN等[25]在利用裂殖壺菌產(chǎn)DHA的發(fā)酵過(guò)程中采用兩點(diǎn)法添加Vc策略，使得DHA的產(chǎn)量提高30%。另外Vc價(jià)格低，食用安全，不會(huì)對(duì)后續(xù)的ε-PL純化帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)。

因此，選取Vc作為抗氧化劑，考察Vc的添加時(shí)間和添加濃度對(duì)ε-PL搖瓶發(fā)酵的影響。結(jié)果如表1所示。Vc的添加時(shí)間和添加濃度對(duì)ε-PL發(fā)酵和菌體量均有影響，其中在24 h添加Vc(濃度為50 mmol/L)時(shí)產(chǎn)量達(dá)到2.45±0.04 g/L，比對(duì)照高出18.93%(p<0.05)，而菌體量為5.84±0.06 g/L與對(duì)照的5.93 g/L相差不大。表明隨著Vc的添加，ε-PL的生產(chǎn)得到較大的增強(qiáng)，尤其是單位菌體的合成能力。Vc添加的最佳條件下單位菌體的合成能力達(dá)到了0.42 g ε-PL/g菌體，高于對(duì)照的0.35 g ε-PL/g菌體。因此選擇發(fā)酵至24 h添加Vc溶液(50 mmol/L)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 Vc添加時(shí)間和濃度對(duì)細(xì)胞量和ε-PL濃度的影響Table 1 The addition time and concentration of Vc on biomass and ε-PL titer

2.3 Vc對(duì)菌體抗氧化脅迫能力的影響

細(xì)菌中的ROS水平與抗氧化系統(tǒng)有密切的關(guān)聯(lián)，通常細(xì)菌體內(nèi)ROS水平激增都伴隨著體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)活力的減弱。還原性酶活力降低和還原性物質(zhì)不足均會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌中ROS的大量產(chǎn)生并在體內(nèi)不斷積累[26]。

微生物細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損傷[27]。通過(guò)對(duì)抗氧化酶的測(cè)定，結(jié)果表明：對(duì)照組過(guò)氧化氫酶的活力基本維持在恒定水平且有升高的趨勢(shì)，而實(shí)驗(yàn)組在24 h時(shí)，CAT活力高于對(duì)照，發(fā)酵后期CAT活力均處于較高水平，可以更好的抵抗氧化脅迫。這也與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[28]。而對(duì)于SOD，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組總的趨勢(shì)是前期SOD酶活力高到后期降低，實(shí)驗(yàn)組SOD初期高于對(duì)照組，而后期低于對(duì)照，且變化不明顯，一般認(rèn)為SOD與CAT在微生物體內(nèi)協(xié)同作用：SOD以O(shè)2-·作為底物，通過(guò)歧化反應(yīng)SOD使O2-·歧化為H2O2和O2，從而起到清除O2-·的作用；產(chǎn)生的H2O2則在CAT作用下被清除，分解生成H2O和O2，而H2O2量的增加會(huì)抑制SOD酶的活性[29]，這與本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果也具有一致性(圖3-A，圖3-B)。

圖3 Vc對(duì)關(guān)鍵酶活力和總抗氧化能力的影響Fig.3 The effect of Vc on the key enzymes activities and total antioxidant capacity

生物體的抗氧化防御體系主要分為2大類。一類叫預(yù)防性抗氧化劑，主要包括SOD、CAT等。另一類叫自由基捕捉劑，包括VC、VE等[30]。因此除了考察細(xì)胞抗氧化酶的活力，還進(jìn)一步測(cè)定細(xì)胞的總抗氧化能力，如圖3-C所示，Vc的添加改善了整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中總抗氧化能力，總抗氧化能力較對(duì)照組均提高1.5倍以上，尤其在30 h總抗氧化能力達(dá)到最大，為8.91 U/(mg protein)。外源添加Vc顯著提高了菌體的抗氧化能力。近年來(lái)，已經(jīng)有許多嘗試通過(guò)外部補(bǔ)充抗氧化劑，來(lái)改善細(xì)胞生長(zhǎng)或目的產(chǎn)物的生產(chǎn)。LIU等[31]通過(guò)外加芝麻酚，提高總抗氧化能力，增加了Crypthecodiniumcohnii的細(xì)胞增殖和脂肪酸生產(chǎn)能力。這與本文的研究思路一致，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。

2.4 Vc對(duì)細(xì)胞膜氧化損傷的影響

大多數(shù)有氧代謝的微生物在細(xì)胞呼吸過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生ROS，其中高氧化活力的HO·將對(duì)生物大分子進(jìn)行攻擊，從而破壞它們的結(jié)構(gòu)，特別是細(xì)胞膜及其相關(guān)組分，為此本文考察了Vc的添加對(duì)細(xì)胞膜成分以及膜氧化損傷標(biāo)志物MDA的影響。

Vc是食品工業(yè)中眾所周知的抗氧化劑，可以增強(qiáng)T-AOC并減少細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生。高T-AOC對(duì)于許多必需的生物學(xué)功能是必不可少的，特別是必需的多不飽和脂肪酸過(guò)氧化，以及DNA損傷的保護(hù)[32]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Streptomycessp. AF3-44的細(xì)胞膜組成主要由飽和脂肪酸肉豆蔻酸(C14∶0)十五烷酸(C15∶0)、棕櫚酸(C16∶0)以及不飽和脂肪酸肉豆蔻油酸(C14∶1)和油酸(C18∶1)組成。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，環(huán)境pH值的下降，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸在細(xì)胞膜中的組成比例呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)：飽和脂肪酸在細(xì)胞膜中的含量下降；而不飽和脂肪酸的含量增加(圖4)。這在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中具有一致性。值得注意的是同一時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組不飽和脂肪酸所占的比例高于對(duì)照組。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組總不飽和脂肪酸所占比例達(dá)到23.8%，高于對(duì)照19.4%。其中增加最明顯的為不飽和脂肪酸肉豆蔻油酸(C14∶1)，實(shí)驗(yàn)組所占比例從8.5%提高到11.7%。細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度的升高增強(qiáng)了膜的流動(dòng)性，從而更加有利于細(xì)胞膜中物質(zhì)的運(yùn)輸以及能量代謝的發(fā)揮，以保證細(xì)胞在氧化脅迫條件下的生存與功能行使。這也與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[16]。

圖4 細(xì)胞膜脂肪酸組成隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.4 Changes of cell membrane fatty acid composition with the fermentation time

MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，MDA水平的高低間接反映了膜系統(tǒng)受損程度。

如圖5所示，對(duì)照組MDA水平前期較低，后期較高。實(shí)驗(yàn)組加入Vc后MDA水平顯著低于對(duì)照組，雖然在48 h之前實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相差并不大，這是由于在這一時(shí)間段菌體仍處于快速生長(zhǎng)時(shí)期，抵抗氧化脅迫的能力較強(qiáng)；但是48 h之后菌體生長(zhǎng)能力下降，氧化脅迫作用逐步增強(qiáng)，此時(shí)Vc對(duì)脂質(zhì)的保護(hù)效果更為突出，在60 h實(shí)驗(yàn)組MDA含量為3.81±0.13 nmol/mg protein，相比于對(duì)照4.67±0.11 nmol/mg proteinMDA水平下降了18.41%。72 h時(shí)與實(shí)驗(yàn)組MDA含量相比對(duì)照組下降幅度進(jìn)一步增大，達(dá)到了29.30%。說(shuō)明添加Vc后發(fā)酵后期，細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平較低，氧化損傷較輕。這也與總抗氧化能力和CAT的變化趨勢(shì)相一致，因此Vc的添加緩解了細(xì)胞的氧化損傷。

圖5 細(xì)胞膜MDA含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.5 Changes of cell membrane MDA content with the fermentation time

2.5 添加Vc對(duì)5 L罐分批發(fā)酵的影響

A-對(duì)照組；B-添加Vc實(shí)驗(yàn)組圖6 5 L罐分批發(fā)酵過(guò)程參數(shù)Fig.6 Profile of fermentative parameters in 5 L fermenter

為了進(jìn)一步比較添加Vc對(duì)ε-PL發(fā)酵性能的影響，在5 L罐上以不添加Vc作為對(duì)照組，pH值大約在14 h降到4.0時(shí)(此時(shí)ε-PL大量合成)，通過(guò)流加體積分?jǐn)?shù)為50%的氨水維持pH值4.0至發(fā)酵結(jié)束。對(duì)照組發(fā)酵43.6 h結(jié)束，ε-PL產(chǎn)量為5.14 g/L，菌體量為18.54 g/L。實(shí)驗(yàn)組在pH值自然下降到4.0時(shí)，通過(guò)流加體積分?jǐn)?shù)為50%氨水維持pH值恒定的同時(shí)，將膜過(guò)濾的Vc溶液經(jīng)蠕動(dòng)泵緩慢流加，流加速率以溶氧維持20%進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，流加Vc整個(gè)過(guò)程大約2.5 h結(jié)束，最終44 h發(fā)酵結(jié)束，ε-PL濃度為7.73 g/L，菌體量為18.5 g/L。因此Vc的添加促進(jìn)了ε-PL產(chǎn)量的提高。

3 結(jié)論與討論

ε-PL作為天然防腐劑應(yīng)用潛力巨大，但是野生菌ε-PL的合成能力較低，近年來(lái)新型的育種方法如GS、核糖體育種等，較傳統(tǒng)的方法很大程度上提升了ε-PL的濃度[26-27]。補(bǔ)充外源添加物是發(fā)酵優(yōu)化的一種常用手段，在ε-PL發(fā)酵中，多以添加氨基酸類[9,33]、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)[10]、吸附載體[34]為主。本文通過(guò)外源添加價(jià)廉與安全的抗氧化劑Vc，從生理角度進(jìn)行初步的分析：發(fā)酵過(guò)程中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體活力逐漸下降，ROS水平逐漸積累升高；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明搖瓶發(fā)酵中Vc最優(yōu)的條件為：24 h添加濃度為50 mmol/L，此時(shí)ε-PL產(chǎn)量2.45±0.04 g/L，比對(duì)照高出18.93%；Vc的添加改善了整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中總抗氧化能力、提高了細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度、緩解了細(xì)胞的氧化損傷。而細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度的升高增強(qiáng)了膜的流動(dòng)性，從而有利于細(xì)胞膜中物質(zhì)的運(yùn)輸以及能量代謝的發(fā)揮，保證細(xì)胞在氧化脅迫條件下的生存與功能行使；細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低，氧化損傷較輕。5 L罐分批發(fā)酵對(duì)照43.6 h發(fā)酵結(jié)束，ε-PL 5.14 g/L，菌體量18.54 g/L。實(shí)驗(yàn)組44 h發(fā)酵結(jié)束，ε-PL 7.73 g/L，菌體量18.5 g/L，Vc的添加促進(jìn)了ε-PL產(chǎn)量的提高。與此類似，GAFFNEY等[35]通過(guò)補(bǔ)充亞麻籽油提高了Schizochytriumsp.的T-AOC，改善不飽和脂肪酸的生產(chǎn)。而BURG等[36]發(fā)現(xiàn)添加鹽對(duì)培養(yǎng)基可以增強(qiáng)紫菜的T-AOC。這些結(jié)果表明通過(guò)調(diào)整氧化損傷和T-AOC狀態(tài)來(lái)改變細(xì)胞活力和產(chǎn)物合成是行之有效的手段。另外，外源添加Vc如何與現(xiàn)有的優(yōu)良的發(fā)酵工藝相結(jié)合，進(jìn)一步提高ε-PL產(chǎn)量還有待進(jìn)一步的研究。