孫杰，姜杰，馮彬斌，孔令民，汪釗，魏春

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州， 310014)

細(xì)菌素是由某些細(xì)菌在發(fā)酵過程中通過核糖體合成產(chǎn)生的一類有抑(殺)菌活性的蛋白或多肽類物質(zhì)[1]。細(xì)菌素的抑菌活性主要針對(duì)革蘭氏陽性菌和一些親緣關(guān)系相近的菌種，而對(duì)革蘭氏陰性菌、真菌等抗菌活性很弱或者無效。細(xì)菌素由于具有天然、無公害、無殘留、熱穩(wěn)定性好、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為微生物防腐劑研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，并且被認(rèn)為是“抗生素的理想替代品”。

乳酸菌是公認(rèn)的具有潛在開發(fā)價(jià)值的天然生物防腐劑[2]，大多數(shù)乳酸菌會(huì)在生長(zhǎng)過程中向外部環(huán)境中釋放具有抑菌活性的細(xì)菌素。因此乳酸菌廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品以及飼料的防腐。乳酸菌細(xì)菌素的理化性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。乳酸菌細(xì)菌素一般為陽離子小肽并且具有較強(qiáng)的疏水性和較高的等電點(diǎn)。目前認(rèn)為細(xì)菌素主要的作用機(jī)制為作用于細(xì)胞膜從而達(dá)到抑菌目的[3]。除了作用于細(xì)胞膜之外，細(xì)菌素還可以作用于細(xì)胞壁、抑制核苷酸合成、抑制蛋白質(zhì)折疊或作用于線粒體[4-9]。

乳酸鏈球菌素(Nisin)已經(jīng)作為一種公認(rèn)安全、無毒的天然食品防腐劑，被廣泛應(yīng)用于牛奶、罐頭、肉制品等。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選產(chǎn)細(xì)菌素穩(wěn)定性和抑菌效果較強(qiáng)的乳酸菌菌株。對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行分離純化，以及生物學(xué)性質(zhì)的探究，為其作為添加劑，以抑制食品或飼料中的腐敗菌或致病菌提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料

浙江地區(qū)米酒、內(nèi)蒙古地區(qū)酸粥。大腸桿菌(ATCC 25922)、枯草芽孢桿菌(CCTCC AB130001)、地衣芽孢桿菌(CCTCC AB205131)、發(fā)酵乳桿菌( CCTCC AB2013124)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、釀酒酵母(ATCC 9080)、白色假絲酵母(ATCC 10231)和米曲霉(CCTCC AF91012)均為實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.2 主要試劑盒與培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基，購于OXOID 公司。MRS固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂。

改進(jìn)的MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40、酵母粉30、乙酸鈉10、檸檬酸氫二銨5、磷酸氫二鉀2、硫酸錳0.25。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl 5L，pH 7.0～7.5，121℃ 20 min 高壓蒸汽滅菌，備用。固體培養(yǎng)基則加入2%的瓊脂粉。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，pH自然，115℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，備用。固體培養(yǎng)基則加入2%的瓊脂粉。

基因組提取試劑盒和Taq酶為寶生物公司產(chǎn)品。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 樣品中乳酸菌的分離與初篩

將酸粥和米酒上清液用0.9%的生理鹽水梯度稀釋，吸取100 μL涂布到MRS固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h。用無菌接種環(huán)挑取具有不同菌落形態(tài)的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h。菌液8 000 r/min離心10 min取上清液，0.22 μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)行抑菌活性分析。

1.3.2 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性。

大腸桿菌(ATCC 25922)作為指示菌株，接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。用0.9%的生理鹽水稀釋大腸桿菌菌液至OD600值為1，取稀釋后的菌液1 mL加入到冷卻至50～60 ℃的100 mL固體LB培養(yǎng)基中混勻，倒平板。平板冷卻后用直徑10 mm打孔器均勻打孔。吸取待測(cè)樣品100 μL加入到孔洞中，37 ℃培養(yǎng)15 h，測(cè)量抑菌圈直徑并記錄(抑菌圈直徑=測(cè)量直徑-打孔器直徑)。挑選抑菌活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 抑菌物質(zhì)的初步鑒定

1.3.3.1 有機(jī)酸排除試驗(yàn)

由于細(xì)菌素一般在酸性條件下抑菌活性強(qiáng)，在中性及堿性條件下抑菌活性較弱或失活，故本實(shí)驗(yàn)不調(diào)發(fā)酵液的pH值，而是配制與發(fā)酵液上清液具有相同pH值的乳酸和乙酸溶液，并檢測(cè)有機(jī)酸溶液的抑菌活性。

1.3.3.2 過氧化氫排除試驗(yàn)

記錄抑菌效果較好并預(yù)處理好的發(fā)酵液上清液的pH值，然后將發(fā)酵液調(diào)pH值為7.0，加入過氧化氫酶使其終濃度為4.5 g/L，37 ℃溫浴1 h后將pH值調(diào)至與原發(fā)酵液相同，檢測(cè)其抑菌活性。

1.3.4 具有較強(qiáng)抗菌性能細(xì)菌素的穩(wěn)定性對(duì)比

為觀察溫度穩(wěn)定性，將發(fā)酵上清液，分別在60、80、100、121 ℃恒溫處理30 min，并以未經(jīng)熱處理的發(fā)酵液上清為對(duì)照進(jìn)行抑菌活性分析。為研究pH值穩(wěn)定性，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl將發(fā)酵上清液pH值調(diào)為2、4、6、8、10，在30 ℃靜置后90 min調(diào)回初始pH值，以未調(diào)pH值的上清液為對(duì)照進(jìn)行抑菌活性分析。為研究酶解穩(wěn)定性，將處理好的發(fā)酵液上清液pH值調(diào)至木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、糜蛋白酶的最適pH值，在各酶的最適溫度下處理90 min(各種蛋白酶的終濃度為1 mg/mL)。將處理好的酶解液調(diào)至發(fā)酵液的初始pH值，測(cè)定其抑菌活性。

1.3.5 菌株鑒定

1.3.5.1 生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)

參照凌代文和東秀珠的方法[10]，采用形態(tài)觀察和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)等常規(guī)生理生化檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行下一步鑒定。

1.3.5.2 菌株16S rDNA鑒定

用Takara細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組，PCR擴(kuò)增16S rDNA片段，擴(kuò)增引物為：

上游引物：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；下游引物：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’

PCR反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃變性2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，32個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)16S rDNA序列結(jié)果通過Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性對(duì)比，利用MEGA 6.0軟件中的Phylogeny中的Construct/Test Neighbor-joining Tree方法構(gòu)建進(jìn)化樹，并經(jīng)Bootstrap重復(fù)驗(yàn)證1 000次。

1.3.6 乳酸菌細(xì)菌素的純化

使用陽離子交換柱CM SefinoseTMFF純化乳酸菌細(xì)菌素。用含1 mol/L NaCl的5 mmol/L乙酸鈉緩沖液梯度洗脫，流速為1 mL/min，在280 nm和220 nm紫外檢測(cè)，收集蛋白峰，檢測(cè)蛋白含量和抗菌活性。之后使用制備液相色譜，進(jìn)一步純化細(xì)菌素。用5 mmol/L乙酸鈉緩沖液平衡。流速為3 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。收集蛋白峰。計(jì)算純化過程中的純化倍數(shù)和細(xì)菌素收率等。將純化后的細(xì)菌素凍干濃縮，加去離子水溶解進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳[11]。將得到的目的蛋白條帶切下，放于混有E.coli的LB平板上進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

1.3.7 WZS02發(fā)酵液的細(xì)菌素效價(jià)測(cè)定

目前細(xì)菌素效價(jià)測(cè)定方法多采用逐步稀釋法[13]或者與Nisin進(jìn)行對(duì)比，本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，將Nisin標(biāo)準(zhǔn)品用pH值4.5的乙酸鈉緩沖液稀釋成1 mg/mL，然后將發(fā)酵液梯度二倍稀釋與1 mg/mL的Nisin標(biāo)準(zhǔn)品一起采用打孔法測(cè)定抑菌活性，打孔器直徑為5 mm，加入的量為50 μL。抑菌活性的計(jì)算方式：如果稀釋2n倍具有最小抑菌圈，那么細(xì)菌素的效價(jià)為2n×1 000 μL/50 μL，將細(xì)菌素的效價(jià)轉(zhuǎn)換為Nisin的標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品中乳酸菌的分離與初篩

從米酒和酸粥中分離篩選了60株乳酸菌，選擇其中抑菌效果較好的3株菌作為研究對(duì)象，分別命名為菌株WZK01、WZK02和WZS02。乳酸菌發(fā)酵液中含有乳酸、乙酸和過氧化氫。為了證明這些菌株的抑菌活性并不是來源于有機(jī)酸和過氧化氫，進(jìn)行了有機(jī)酸和過氧化氫的排除實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)與發(fā)酵液具有相同pH值的乳酸和乙酸并不會(huì)產(chǎn)生抑菌圈。說明乳酸菌的抑菌活性并不依靠發(fā)酵液中的有機(jī)酸，其抑菌活性來源于發(fā)酵液中的其他物質(zhì)。過氧化氫酶處理發(fā)酵液后，發(fā)酵液的抑菌圈直徑僅有微弱的減少，說明乳酸菌在生長(zhǎng)代謝中產(chǎn)生的過氧化氫具有一定的抑菌活性，但并不起到?jīng)Q定性作用。因此初步認(rèn)為乳酸菌發(fā)酵液的抑菌活性主要來源于其中的細(xì)菌素。

2.2 三株乳酸菌發(fā)酵液抗菌活性穩(wěn)定性的對(duì)比

如圖1-a所示，菌株WZS02細(xì)菌素?zé)岱€(wěn)定性最好，其可以耐受121 ℃的高溫，并且后續(xù)經(jīng)過抑菌率試驗(yàn)測(cè)得121 ℃處理30 min后活性僅降低了8%左右。pH值穩(wěn)定性結(jié)果表明這3種乳酸菌細(xì)菌素的pH值適應(yīng)范圍都較窄并且在強(qiáng)酸性處理?xiàng)l件下活性降低，隨著pH值增高至堿性，抑菌活性降低甚至失活。這3種乳酸菌細(xì)菌素中的WZK01細(xì)菌素和WZK02細(xì)菌素的最適pH值均為6，而WZS02細(xì)菌素的最適pH則為4(圖1-b)。

a-溫度穩(wěn)定性;b-pH穩(wěn)定性對(duì)比; c-酶解穩(wěn)定性對(duì)比圖1 三株乳酸菌發(fā)酵液抗菌活性穩(wěn)定性的對(duì)比Fig.1 Comparison of the stability of the antibacterial activity of three strains of lactic acid bacteria

圖1-c表明本實(shí)驗(yàn)所采用的各種蛋白酶對(duì)于這3株乳酸菌發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)均具有一定的水解作用，同時(shí)根據(jù)蛋白酶酶解后抑菌活性下降劇烈這一現(xiàn)象可以判斷這3株乳酸菌發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。從圖中可以看出糜蛋白酶對(duì)于這3株乳酸菌分泌的細(xì)菌素酶解能力較強(qiáng)，胃蛋白酶以及胰蛋白酶處理后活性損失較小。這3株乳酸菌細(xì)菌素經(jīng)過蛋白酶處理90 min后活性大部分喪失。因此其如果作為飼料添加劑，不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生過多的污染。綜合以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WZS02細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定性好、抗菌性能強(qiáng)、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因此選用WZS02為后續(xù)研究菌株。

2.3 菌株鑒定

將抑菌活性強(qiáng)的WZS02、WZK01、WZK02菌株進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。根據(jù)GenBank中16S rDNA序列同源性比較發(fā)現(xiàn)WZS02菌株與植物乳桿菌的同源性為99%；WZK01菌株與發(fā)酵乳桿菌的同源性為99%；WZK02與明串球菌的同源性為99%。在GenBank中選擇合適菌株的16S rDNA序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2)。

圖2 三株乳酸菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationships of three lactic acid bacteria

結(jié)果表明WZS02菌株與L.plantarumBCH-2的同源性為100%，因此將其命名為L(zhǎng).plantarumWZS02；WZK01菌株與L.fermentumF4S8的同源性為100%，因此將其命名為L(zhǎng).fermentumWZK01；WZK02菌株與L.citreumKM20的同源性為97%，因此將其命名為L(zhǎng).citreumWZK02。

由于WZS02細(xì)菌素的溫度穩(wěn)定性明顯優(yōu)于其他2種，因此本文以其為研究對(duì)象進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。參照《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》，進(jìn)一步對(duì)WZS02菌株進(jìn)行了生理生化實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。該菌株過氧化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)呈陰性，不產(chǎn)硫化氫，pH 4.5能生長(zhǎng)，能夠發(fā)酵果糖、葡萄糖、蔗糖等碳水化合物，不能發(fā)酵阿拉伯糖和木糖。顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)表明，WZS02菌體成桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈狀排列，革蘭氏染色陽性，無芽孢。根據(jù)生理生化鑒定與菌體形態(tài)進(jìn)一步確定菌株WZS02為植物乳桿菌(L.plantarum)，與之前的16S rDNA鑒定結(jié)果一致。

2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及其與抑菌活性的關(guān)系

將活化好的菌株以2%的接種量接種到改進(jìn)的MRS培養(yǎng)基中，放置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如圖3所示，菌株從18 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，OD在2.25左右維持穩(wěn)定，并在28 h左右進(jìn)入衰亡期，菌體開始自溶導(dǎo)致OD值下降。細(xì)菌素WZS02在發(fā)酵6 h后產(chǎn)生，說明細(xì)菌素為次級(jí)代謝產(chǎn)物，發(fā)酵時(shí)間8 h后，從抑菌曲線來看隨著菌體量增長(zhǎng)，細(xì)菌素的產(chǎn)量也在不斷增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到20～26 h時(shí)，即菌株穩(wěn)定期的后期、衰亡期的前期，發(fā)酵液中細(xì)菌素的含量也達(dá)到最大，抑菌率為52%左右，隨后抑菌活性有所下降，或許與菌體自溶導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白酶流出降解細(xì)菌素有關(guān)。

圖3 植物乳桿菌WZS02的生長(zhǎng)量與抑菌活性的關(guān)系Fig.3 The relationship between the growth of LZ lactic acid bacteria WZS02 and the antibacterial activity

2.5 植物乳桿菌WZS02細(xì)菌素的純化

采用CM SefinoseTMFF陽離子交換柱對(duì)發(fā)酵液中的細(xì)菌素進(jìn)行純化，將有抑菌活性的洗脫液泵入制備液相色譜，在280 nm下測(cè)得蛋白吸收峰。每一步純化倍數(shù)與回收率見表1。

表1 細(xì)菌素WZS02純化表Table 1 Purification table of bacteriocin WZS02

注：以發(fā)酵液抑菌活性為1，離子交換以及液相制備的抑菌活性與發(fā)酵液對(duì)比后計(jì)算相對(duì)總活力與相對(duì)比活力。

將經(jīng)陽離子交換層析以及液相制備色譜純化得到的蛋白樣品進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE(圖4-a)，在1.7～4.6 kDa之間可見明顯的小肽條帶。將該小肽條帶切下，并取空白蛋白膠為對(duì)照測(cè)其抑菌活性。從圖4-b中可以看出Tricine-SDS-PAGE得到的細(xì)菌素蛋白條帶仍保持有一定的抑菌活性，這一現(xiàn)象表明即使經(jīng)過SDS變性劑處理以及熱處理后，細(xì)菌素WZS02仍能保持一定的生物活性。

a-Tricine SDS-PAGE電泳圖；b-蛋白條帶抑菌活性檢測(cè)圖4 Tricine SDS-PAGE電泳圖與蛋白條帶抑菌活性檢測(cè)Fig.4 Tricine SDS-PAGE and detection of antibacterial activity of protein bands

2.6 WZS02細(xì)菌素的效價(jià)及抑菌譜測(cè)定

測(cè)定改進(jìn)的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)WZS02菌株24 h的發(fā)酵液中的細(xì)菌素效價(jià)。以大腸桿菌為指示菌，有明顯抑菌圈的最大稀釋倍數(shù)為8倍，計(jì)算得效價(jià)為160 AU/mL，根據(jù)原發(fā)酵液與1 mg/mL的Nisin標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 IU/mg)的抑菌率的比值，算得以大腸桿菌為指示菌其相對(duì)Nisin的效價(jià)為9 097 IU/mL。以金黃色葡萄球菌最為指示菌，有明顯抑菌圈的細(xì)菌素最大稀釋倍數(shù)為16倍，計(jì)算得效價(jià)為320 AU/mL，根據(jù)原發(fā)酵液與1 mg/mL的Nisin標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 IU/mg)的抑菌率的比值，算得其對(duì)金黃色葡萄球菌的抗性為2 796 IU/mL。因此，WZS02的細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陰性及陽性均具有較強(qiáng)的抗性，同時(shí)也證明了其抑菌譜較廣，抑菌活性強(qiáng)于Nisin。同時(shí)也證明了細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽性的抗性一般強(qiáng)于革蘭氏陰性。

表2 細(xì)菌素WSZ02的抑菌譜Table 2 Bacteriostatic spectrum of WZS02 bacteriocin

注:“+++”直徑 ≥ 20 mm高度敏感；“++”直徑 ≥ 10 mm中度敏感；“+”直徑 ≥ 0 mm低度敏感；“—”無抑菌作用。

測(cè)定了細(xì)菌素WZS02對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的一些菌株的抑制效果。從表2中可以看出細(xì)菌素WZS02具有較廣的抑菌譜，其對(duì)革蘭氏陽性菌及陰性菌均具有較強(qiáng)的抑制效果，并且對(duì)革蘭氏陽性菌或陰性菌中的腐敗菌(枯草芽孢桿菌)及致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)抑菌活性較強(qiáng)。此外，對(duì)部分真菌(如假絲酵母)也具有一定的抑菌活性。

3 結(jié)論

本研究通過發(fā)酵液的抑菌活性、酶解穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性及pH值穩(wěn)定性等測(cè)定，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，篩選出一株對(duì)革蘭氏陽性和陰性均具有較好的抑制效果的菌株，經(jīng)分子和生理生化鑒定后，命名為L(zhǎng).plantarumWZS02。將發(fā)酵液上清液通過陽離子交換樹脂層析和液相制備純化，得到細(xì)菌素純度較高的蛋白溶液。然后對(duì)抑菌譜進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大部分革蘭氏陽性菌以及陰性菌均有較好的抑制效果，為其作為食品或飼料中的添加劑，以抑制食品或飼料中的腐敗菌或致病菌提供了有力支持。