趙雪峰，范娟，楊玲麟，傅少志，陳瓊英

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 瀘州 646099；2.四川省自貢市第三人民醫(yī)院 放射科，四川 自貢 643020）

肺癌是發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，大部分患者確診時(shí)已為中、晚期，放化療聯(lián)合靶向藥物治療成為主要治療手段[1-3]。Periods基因是近日節(jié)律調(diào)節(jié)系統(tǒng)的核心基因，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1, SIRT1）是聯(lián)系晝夜節(jié)律和能量代謝的能量傳感器[4-5]。白蛋白結(jié)合型紫杉醇（albumin-bound paclitaxel, Abraxne）能加快紫杉醇進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，避免合成溶劑可能造成的毒副作用[6]。本研究探究Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠生物鐘基因Per2、SIRT1表達(dá)的影響，以期為臨床治療肺癌提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡清潔級(jí)C57BL/6雌性小鼠60只，體重18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑及材料 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞（lewis lung cancer cells, LLC）由本實(shí)驗(yàn)室保存。Abraxne注射用混懸液，規(guī)格：5 ml：100 mg/瓶，購(gòu)自美國(guó)Celgene公司，紫素（溶劑型紫杉醇注射液）規(guī)格：5 ml：30 mg。購(gòu)自北京協(xié)和藥廠。Trizol RAN提取試劑（美國(guó)Invitrogen公司），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，組織蛋白提取試劑（南京凱基生物科技發(fā)展公司），兔抗鼠Per2一抗、兔抗鼠SIRT1一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 動(dòng)物模型的復(fù)制

取本實(shí)驗(yàn)室凍存的LLC細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代，傳代期間采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，確認(rèn)細(xì)胞活力正常且傳代3次后即可使用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，倒掉培養(yǎng)基，用生理鹽水將細(xì)胞濃度稀釋至5×106個(gè)/L。在C57BL/6小鼠右腋部背側(cè)皮下接種0.2 ml LLC細(xì)胞懸液（約1×106個(gè)細(xì)胞），接種后觀察小鼠腋下變化，第2～5天皮下可觸摸到腫瘤結(jié)節(jié)。若腋下腫瘤長(zhǎng)勢(shì)良好，在接種5 d后體積可＞100 mm3，則提示Lewis肺癌小鼠模型復(fù)制成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將接種后的45只Lewis肺癌小鼠隨機(jī)分為模型組、紫素組和Abraxne組，用剪耳法標(biāo)記，各15只，其余15只小鼠不做任何處理作為正常對(duì)照組。接種后第5天開始給藥，連續(xù)治療10 d。將瓶裝Abraxne和紫素用生理鹽水稀釋為3 g/L，配好的溶液應(yīng)在8 h內(nèi)使用。Abraxne組從尾靜脈緩慢注入Abraxne 30 mg/（kg·d）；紫素組從尾靜脈緩慢注入紫素 30 mg/（kg·d）；模型組尾靜脈注入等量生理鹽水。

1.4 小鼠生存狀態(tài)觀察

接種后第5天起，各組小鼠每天同一時(shí)間稱重，觀察小鼠活動(dòng)、飲食狀態(tài)和死亡情況，并做好記錄。

1.5 腫瘤體積動(dòng)態(tài)變化

接種后第5天起，每天同一時(shí)間用游標(biāo)卡尺（精確到0.1 mm）測(cè)定腫瘤最長(zhǎng)徑（a）和最短徑（b），計(jì)算腫瘤體積（V）：V=ab2/2。統(tǒng)計(jì)各組小鼠腫瘤平均體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

接種后第15天將小鼠斷頭處死，完整剝離腫瘤結(jié)節(jié)組織于液氮中凍存。采用Trizol法提取各組小鼠腫瘤組織的總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)腫瘤組織中的Per2和SIRT1 mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，采用美國(guó)ABI公司的7500系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，72℃退火15 s，共40個(gè)循環(huán)。最終以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot檢測(cè)

取每組小鼠腫瘤組織充分研磨，用組織蛋白提取試劑常規(guī)提取蛋白。每組取4μl蛋白樣品，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)好蛋白濃度。將蛋白樣品與等體積2×SDS緩沖液混合后加熱變性，通過SDSPAGE電泳分離上清液，把分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。將膜洗滌后在5%牛血清蛋白溶液中室溫封閉1 h，洗滌后將膜置于一抗稀釋液（兔抗鼠Per2或SIRT1一抗溶液1∶100）中，4℃孵育過夜。次日早晨將膜快速清洗后，轉(zhuǎn)移到二抗稀釋液（堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG溶液1∶1 000）中，室溫孵育2 h，清洗后用新配制的顯色液進(jìn)行顯色，待出現(xiàn)清晰的條帶后終止反應(yīng)，最后使用GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白雜交條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況

模型組接種后第10天1只小鼠死亡。紫素組給藥后第6天1只小鼠死亡，給藥后第9天2只小鼠死亡。Abraxne組小鼠給藥后無小鼠死亡。模型組、紫素組小鼠整體生長(zhǎng)情況較差，活動(dòng)、進(jìn)食狀態(tài)不佳，紫素組小鼠較模型組、Abraxne組明顯消瘦；Abraxne組小鼠生長(zhǎng)情況強(qiáng)于模型組、紫素組，狀態(tài)最佳。

2.2 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠體重的影響

正常對(duì)照組、模型組、紫素組、Abraxne組小鼠在接種LLC細(xì)胞前、接種后第5天、給藥后第5和10天的體重變化比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)體重有差別（F=17.703，P=0.000）；②4組大鼠體重有差別（F=7.976，P=0.000）；③4組大鼠體重變化趨勢(shì)有差別（F=21.641，P=0.000）。見表 2。

表2 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠體重的影響 （g，±s）

表2 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠體重的影響 （g，±s）

注：1）與正常對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05；3）與紫素組比較，P ＜0.05。

組別 接種前 接種后第5 d 給藥后第5 d 給藥后第10 d正常對(duì)照組（n =15） 18.62±1.25 18.94±1.38 19.10±1.45 19.13±1.27模型組（n =14） 18.53±1.34 18.25±1.42 18.02±1.281） 17.75±1.031）紫素組（n =12） 18.64±1.29 18.31±1.08 17.74±0.961） 17.08±0.681）2）Abraxne組（n =15） 18.57±1.17 18.28±1.02 18.23±0.98 18.19±0.951）3）F值 0.021 1.043 3.389 9.688 P值 0.996 0.382 0.025 0.000

2.3 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤體積的影響

模型組、紫素組、Abraxne組Lewis肺癌小鼠給予 Abraxne治療后第 0、2、4、6、8和 10天的腫瘤體積比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積有差別（F=35.128，P=0.000）；②3組小鼠腫瘤體積有差別（F=8.376，P=0.000）；③3組小鼠腫瘤體積變化趨勢(shì)有差別（F=43.624，P=0.000）。見表 3和圖 1。

表3 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤體積的影響 （mm3，±s）

表3 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤體積的影響 （mm3，±s）

注：1）與模型組比較，P ＜0.05；2）與紫素組比較，P ＜0.05。

組別 第0 d 第2 d 第4 d 第6 d 第8 d 第10 d模型組（n =14） 103.12±8.13 108.15±9.12 120.26±9.25 133.25±10.15 143.76±10.36 149.23±11.39紫素組（n =12） 102.33±8.22 106.26±8.02 114.33±9.271） 123.12±9.251） 127.29±9.171） 131.15±9.381）Abraxne 組（n =15） 103.25±7.12 105.43±8.16 107.56±8.291）2） 112.35±9.051）2） 115.65±8.921）2） 117.12±9.351）2）

圖1 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤體積的影響 （±s）

2.4 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中Per2和SIRT1 mRNA表達(dá)的影響

模型組、紫素組、Abraxne組小鼠給藥后腫瘤組織中Per2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（0.20±0.02）、（0.31±0.04）和（0.42±0.16），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.475，P=0.000）。模型組、紫素組、Abraxne組SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（0.14±0.04）、（0.23±0.05）和（0.30±0.08），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.603，P=0.000）。見圖2。

圖2 Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中Per2和SIRT1 mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

2.5 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中Per2和SIRT1蛋白表達(dá)的影響

模型組、紫素組、Abraxne組小鼠給藥后腫瘤組織中Per2和SIRT1蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與模型組比較，紫素組、Abraxne組小鼠腫瘤組織中Per2和SIRT1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見表 4和圖 3。

表4 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中Per2和SIRT1蛋白表達(dá)的影響 （±s）

表4 Abraxne對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中Per2和SIRT1蛋白表達(dá)的影響 （±s）

注：1）與模型組比較，P ＜0.05；2）與紫素組比較，P ＜0.05。

組別 Per2蛋白 SIRT1蛋白模型組 0.126±0.012 0.134±0.015紫素組 0.182±0.0171） 0.193±0.0181）Abraxne 組 0.257±0.0241）2） 0.232±0.0211）2）F值 181.732 105.299 P值 0.000 0.000

圖3 Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中Per2和SIRT1蛋白的表達(dá)

3 討論

隨著人口老齡化步伐加快和環(huán)境污染不斷加劇，中國(guó)肺癌的發(fā)病率、死亡率高居不下。盡管肺癌的治療手段不斷進(jìn)步，但是中、晚期肺癌的術(shù)后5年生存率僅為20%。肺癌的發(fā)生是一個(gè)多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，致癌基因激活、抑癌基因失活或缺失與腫瘤的形成關(guān)系密切[7-9]。因此，深入挖掘腫瘤發(fā)生機(jī)制為肺癌患者的根治性治療帶來了希望。

紫杉醇是一種從紅豆杉樹皮中獲得的廣譜抗癌藥物，其作用機(jī)制為抑制微管解聚，但其難溶于水，其制藥溶媒為聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇混合物，然而該溶媒在體內(nèi)降解生成的組胺可引起嚴(yán)重過敏反應(yīng)，限制了溶劑型紫杉醇，如紫素，在臨床上的應(yīng)用[10-11]。Abraxne是把人血白蛋白和紫杉醇通過高壓振動(dòng)技術(shù)制成納米微粒粉劑，使用時(shí)加入生理鹽水溶解成120～150 nm大小的納米粒Abraxne混懸液，即可靜脈滴注。Abraxne不含助溶劑，可有效提高紫杉醇劑量，且臨床用藥時(shí)不必預(yù)防過敏反應(yīng)[12]。白蛋白是人體內(nèi)自然存在的疏水性載體，可與一些物質(zhì)，如脂肪酸、脂溶性維生素、性激素等，通過可逆性共價(jià)方式結(jié)合[13-14]。白蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞膜受體gp60結(jié)合后，可激活小窩蛋白-1。小窩蛋白-1為膜表面糖基蛋白，直接協(xié)助藥物跨膜運(yùn)輸。白蛋白藥物復(fù)合體依次經(jīng)過血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織、組織間隙，最終蓄積在腫瘤細(xì)胞內(nèi)。此外，腫瘤組織分泌的富含半胱氨酸酸性分泌蛋白，其作用類似于白蛋白受體，可特異吸附白蛋白，因此白蛋白藥物復(fù)合體可在腫瘤細(xì)胞周圍聚集，提高局部藥物濃度，增強(qiáng)抑瘤能力[15-17]。本研究通過Lewis肺癌模型小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫素干預(yù)后小鼠整體生長(zhǎng)情況較差，活動(dòng)、進(jìn)食狀態(tài)不佳，較模型組、Abraxne組明顯消瘦，腫瘤生長(zhǎng)速度較模型組減緩，但仍快于Abraxne組。同時(shí)通過對(duì)小鼠體重進(jìn)行分析顯示，各組小鼠在接種LLC細(xì)胞前、接種后第5天、給藥后第5和10天均隨著時(shí)間變化而變化。給予Abraxne治療后第0、2、4、6、8和10天各組小鼠腫瘤體積大小也隨著時(shí)間變化而變化。說明紫素能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，但易產(chǎn)生毒副作用。Abraxne組小鼠給藥后無死亡，生長(zhǎng)狀況明顯強(qiáng)于模型組和紫素組，Abraxne干預(yù)后腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯小于模型組和紫素組，說明Abraxne較紫素更能抑制腫瘤生長(zhǎng)，且不會(huì)產(chǎn)生毒副作用，臨床使用更加安全。

生物鐘是機(jī)體自我產(chǎn)生、不受外界因素控制的時(shí)間節(jié)律性，與衰老、代謝紊亂、腫瘤形成等現(xiàn)象息息相關(guān)。生物節(jié)律是生物鐘的外在體現(xiàn)，包括亞日節(jié)律、近日節(jié)律、超日節(jié)律等。生物體通過近日節(jié)律調(diào)控腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，生物鐘基因異常表達(dá)可能會(huì)造成近日節(jié)律失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)上升。生物鐘基因主要包括Periods（Per1-3）、Crystals（Cry1-2）、Bmal1、Clock、Ck1和Timeless[18-19]。Per2基因是近日節(jié)律系統(tǒng)的重要成員，參與多個(gè)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及新陳代謝。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及肺癌組織中Per2蛋白普遍異?；蛉笔?，Per2基因在癌旁組織中的表達(dá)水平明顯強(qiáng)于腫瘤組織[20-22]。淋巴瘤和白血病組織中Per2蛋白表達(dá)水平明顯低于正常組織，誘導(dǎo)Per2高度表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞周期停滯、增殖能力降低、凋亡速度加快等情況，這些結(jié)果暗示Per2在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面扮演重要角色。哺乳動(dòng)物SIRT1基因是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白3脫乙酰酶，與酵母染色質(zhì)沉默因子2最為同源，具有調(diào)節(jié)生物體新陳代謝、控制壽命長(zhǎng)短等功能。SIRT1能通過去乙?；cPer2發(fā)生作用，SIRT1被激活后，可使Per2去乙?；?，去乙酰化的Per2可被磷酸化后降解，如此周而復(fù)始[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在腫瘤形成過程中兼具致癌和抑癌基因的功能，其作用關(guān)鍵在于維持致癌和抑癌基因的平衡關(guān)系[26-27]。本研究中qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，紫素組、Abraxne組Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中Per2、SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較模型組升高；Abraxne組Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中Per2、SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較紫素組更高，推測(cè)紫杉醇抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制可能與生物鐘基因Per2、SIRT1表達(dá)被激活有關(guān)，且Abraxne較紫素更能促進(jìn)腫瘤組織中Per2和SIRT1蛋白的表達(dá)，Abraxne在臨床上治療肺癌的效果可能會(huì)更好。本研究的不足之處在于未闡明Per2基因的具體抑癌機(jī)制，在后續(xù)的研究中將對(duì)此進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，本研究通過右腋部背側(cè)皮下接種LLC復(fù)制Lewis肺癌小鼠模型，Abraxne干預(yù)后小鼠生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于紫素組，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，腫瘤組織中Per2、SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較模型組、紫素組升高，說明Abraxne治療肺癌的效果更好、更安全，其作用機(jī)制可能與生物鐘基因Per2、SIRT1表達(dá)被強(qiáng)化有關(guān)。然而，肺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)因素很多，相關(guān)機(jī)制復(fù)雜，臨床治療肺癌的相關(guān)作用機(jī)制還需繼續(xù)深入探究。