熊建團(tuán) ，李旭生 ，楊安寧 ，楊松昊 ，鄧梅 ，王磊 ，高源 ，李南 ，楊曉玲 ，賈月霞，姜怡鄧

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 骨科，寧夏 銀川750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4, FABP4）屬于脂肪酸結(jié)合蛋白大家族的重要成員，主要在脂肪組織中高度表達(dá)，在巨噬細(xì)胞中也有大量表達(dá)[1]。近年來研究表明，F(xiàn)ABP4在肥胖和動脈粥樣硬化的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[2]。FABP4表達(dá)缺失可通過降低炎癥因子在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，保護(hù)高血脂老鼠避免動脈粥樣硬化的發(fā)生[3]。目前國內(nèi)關(guān)于FABP4基因啟動子的研究較少。同型半胱氨酸（Homocysteine, Hcy）是心腦血管疾病的獨立危險因子，通過多種機(jī)制影響基因表達(dá)，參與疾病發(fā)生、發(fā)展[4]。本研究以人源FABP4基因為研究對象，成功克隆FABP4基因啟動子，分析確定影響FABP4基因啟動子活性的核心區(qū)域，為進(jìn)一步開展功能研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備和試劑

L-Hcy和佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）（德國Sigma-Aldric公司），二氧化碳CO2培養(yǎng)箱HF90（上海力新儀器有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素、鏈霉素、PBS緩沖液、DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HycLone公司，相差顯微鏡（日本尼康公司），熒光素酶檢測儀器（美國普洛麥格公司），PrimeSTAR HS DNA polymera（大連寶生生物工程公司有限公司），限制性內(nèi)切酶Xhol、Hind Ⅲ、T4 DNA快速連接酶、DNA Marker及轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司，DNA提取試劑盒、凝膠回收純化試劑盒、DNA純化試劑盒及雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國普洛麥格公司，質(zhì)粒純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司），pGL3-Basic質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒由本實驗室保存，HEK-293A細(xì)胞（四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院），實驗中所用引物及測序由上海英俊生物有限公司完成。

1.2 啟動子序列分析

根據(jù)GenBank中人FABP4基因的序列（GenBank：CR456903.1），查找啟動子區(qū)2 000 bp區(qū)域，分別根據(jù)http：//fruitfly.org：9005/seq_tools/promoter.html、http：//www.urogene.org/methprimer/index1.html網(wǎng)站預(yù)測啟動子結(jié)合序列和甲基化島分布情況的結(jié)果。

1.3 FABP4基因啟動子報告基因載體的構(gòu)建

將人FABP4啟動子初步分為4個片段，分別為 -500/-1、-1000/-1、-2000/-1、-2000/-1501， 利用Primer 5設(shè)計合成4對特異引物獲得相應(yīng)片段，并在5’端和3’端分別添加Xhol和Hind Ⅲ酶切位點，引物序列見附表。將目的片段從亞克隆載體上切割并回收，回收目的片段并與pGL3-Basic載體連接，利用雙酶切方法篩選并測序鑒定。

附表 FABP4基因啟動子片段引物設(shè)計

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK-293A工具細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基，THP-1單核細(xì)胞使用RPMI 1640培養(yǎng)液，均含12%胎牛血清。于37℃、5% CO2環(huán)境中靜置培養(yǎng)。以500 nmol/L PMA培養(yǎng)液孵育THP-1單核細(xì)胞48 h，單核細(xì)胞即分化為巨噬細(xì)胞，然后給予不用濃度（0、50、100、200和500μmol/L）Hcy干預(yù)24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5 FABP4基因啟動子活性分析

將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%匯合時，采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染DNA總量為2μg/孔，pGL3-FABP4不同大小片段質(zhì)粒與海腎熒光素酶報告基因載體（pRL2TK）的比值為100∶1。將海腎熒光素酶報告基因載體作為內(nèi)源參照，以消除由于轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性等因素帶來的差異。轉(zhuǎn)染48 h后，按照Promega公司熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，進(jìn)行熒光素酶活性檢測。實驗重復(fù)6次，每次3個平行實驗，啟動子相對活性以目的基因熒光與海腎熒光的比值（Fluc/Rluc）表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Software 6.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，兩兩比較用SNK–q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FABP4基因核心啟動子預(yù)測分析

通過BDGP生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在FABP4啟動子區(qū)2 000 bp的范圍內(nèi)含有2個可能的核心啟動子位點，并且得分均＞0.95（滿分1.00分）。見圖1。

圖1 FABP4基因核心啟動子預(yù)測分析

2.2 FABP4基因啟動子區(qū)CpG島生物學(xué)預(yù)測

通過Methprimer網(wǎng)站預(yù)測，筆者觀察到在FABP4啟動子區(qū)2 000 bp范圍內(nèi)沒有CpG島的存在，但是有一段CpG二核苷酸位點相對集中的區(qū)域，并且可以在這個相對集中的區(qū)域設(shè)計甲基化與非甲基化引物，觀察FABP4基因啟動子甲基化程度的改變。見圖2。

2.3 FABP4基因啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點的預(yù)測

用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析比對FABP4基因啟動子2 000 bp序列，發(fā)現(xiàn)在位于轉(zhuǎn)錄起始的-67堿基位置和轉(zhuǎn)錄起始的-1548堿基位置含有CAAT盒，而位于轉(zhuǎn)錄起始的-808堿基位置含有TATA盒。見圖3。

2.4 FABP4基因啟動子區(qū)不同截取片段PCR產(chǎn)物

通過普通PCR擴(kuò)增得到與預(yù)測截取片段大小相等且規(guī)整單一的PCR產(chǎn)物。其中，-2000/-1501片段組、-500/-1片段組、-1000/-1片段組、-2000/-1片段組長度分別為500、500、1 000和2 000 bp。見圖4。

2.5 FABP4基因啟動子不同截取片段pGL3載體雙酶切結(jié)果

將構(gòu)建好的FABP4基因啟動子不同截取片段pGL3載體經(jīng)Hind和Xhol雙酶切后用電泳法分離，均被切出大小約4 000 bp的大片段條帶和與之相對應(yīng)的與PCR產(chǎn)物相大小一致的小片段條帶。其中，-2000/-1501片段組、-500/-1片段組、-1000/-1片段組、-2000/-1片段組長度分別為500、500、1 000和2 000 bp。大片段的條帶與pGl3空載體Hind、Xhol雙酶切后的產(chǎn)物大小一致。見圖5。

圖2 FABP4基因啟動子區(qū)CpG位點分析

圖3 FABP4基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點預(yù)測

圖4 各FABP4基因啟動子片段擴(kuò)增

圖5 各FABP4基因啟動子片段酶切鑒定

2.6 FABP4基因啟動子不同截取片段的熒光素酶活性

以HEK-293A細(xì)胞為工具細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)入不同長度的FABP4啟動子截取片段，檢測相應(yīng)片段的螢光素酶活性，-2000/-1501片段組、-2000/-1片段組、-1000/-1片段組、-500/-1片段組細(xì)胞中相對熒光素酶活性分別為（0.2103±0.02741）、（0.3203±0.02978）、（0.1542±0.05314）和（0.2595±0.02686），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.900，P=0.000），提示不同長度FABP4啟動子截取片段可能具有不同的啟動活性。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK–q檢驗，-500/-1片段組、-2000/-1片段組、-2000/-1501片段組啟動活性高于pGL3對照組（P=0.002、0.001和0.011），其中-2000/-1片段組轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)。見圖6。

圖6 各FABP4基因啟動子片段熒光素酶活性檢測

2.7 Hcy和5-氮雜胞苷對FABP4基因啟動子的作用

將FABP4基因核心啟動子-2000/-1片段轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，并用不同濃度Hcy和5-氮雜胞苷（5-azacytidine, AZC） 干 預(yù) 后，0、50、100、200和500μmol/L Hcy組，以及100μmol/L Hcy＋AZC組細(xì)胞中相對熒光素酶活性分別為（1.260±0.5585）、（1.430±0.1383）、（4.386±0.1711）、（4.029±0.1673）、（1.582±0.1952）和（5.265±0.3834），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=98.000，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK–q檢驗，50和500μmol/L Hcy組與0μmol/L Hcy組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.636和 0.400）；100和 200μmol/L Hcy組高于0μmol/L Hcy組（均P=0.001）；100μmol/L Hcy組用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑AZC作用后，F(xiàn)ABP4基因啟動活性升高（P=0.002），提示Hcy可以增加巨噬細(xì)胞內(nèi)FABP4核心啟動子片段的活性，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑AZC可以進(jìn)一步促進(jìn)Hcy對FABP4啟動子活性的影響。見圖7。

圖7 不同濃度Hcy對FABP4基因核心啟動子活性的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)人FABP4基因2 000 bp長度的啟動子區(qū)含有3個轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點，即由2個啟動子區(qū)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，分別位于-2000/-1051、-500/-1和-1000/-500區(qū)域，分別為-2000/-1051區(qū)域CAAT盒（序列為CCAAT）、位于-500/-1區(qū)域CAAT盒（序列為CCAAT）和-1000/-500區(qū)域的TATA盒（序列為TATAAAA）。一般真核生物中蛋白質(zhì)編碼基因的核心啟動子元件分4類：①傳統(tǒng)的TATA盒；②上游核心啟動子元件；③下游啟動子元件；④起始子。起始子只起轉(zhuǎn)錄起始并無轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，而上游啟動子元件包括CAAT盒和GC盒等，能通過TFⅡ-D復(fù)合物的識別和結(jié)合來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率，從而提高轉(zhuǎn)錄效率，但并不是所有啟動子都含有這些轉(zhuǎn)錄基本元件[5]。

CAAT盒是轉(zhuǎn)錄因子CBF在DNA序列上的識別結(jié)合位點，其序列格式為CCAAT。CAAT盒位于所轉(zhuǎn)錄的真核生物基因的近端啟動子，與其他啟動子元件相互調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用，通過控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率從而控制啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，是真核生物基因常有的基本轉(zhuǎn)錄區(qū)[6]。而TATA盒是另一個重要基礎(chǔ)元件，是轉(zhuǎn)錄因子TBP識別的DNA序列，其序列格式通常為TATAWAW（W代表A或T）。通常認(rèn)為，含有TATA盒的啟動子可能參與組織特異性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而TATA盒本身并無轉(zhuǎn)錄活性，如果表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性需要其他結(jié)構(gòu)基因共同調(diào)控[7]。在FABP基因2 000 bp啟動子區(qū)內(nèi)，CAAT盒位于轉(zhuǎn)錄起始的-67堿基位置和轉(zhuǎn)錄起始的-1548堿基位置，對應(yīng)存在的片段為-500/-1片段和-1501/-2000即表現(xiàn)出來轉(zhuǎn)錄活性，可以推測FABP4基因是由CAAT盒組成的核心啟動子。而TATA盒則位于轉(zhuǎn)錄起始的-808堿基位置，存在于-1000/-1片段內(nèi)而無轉(zhuǎn)錄活性，則TATA盒在FABP4轉(zhuǎn)錄中可能未起到轉(zhuǎn)錄活性作用。

基因啟動子和豐富的CpG序列（GC位點通常未甲基化）中的甲基化修飾被認(rèn)為與基因表達(dá)調(diào)控高度相關(guān)，是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式[8]。一般來說，CpG島通常是基因中GC含量為60%、CpG出現(xiàn)率達(dá)到0.65、長度為500 bp的序列，就算這些區(qū)域沒有CpG島也有豐富的CpG位點，可被甲基化修飾調(diào)控[9]。在FABP4基因啟動子區(qū)里，GC含量相對較少，約為38%，在-2000/-1501片段中GC相對集中，含量也僅有47%，因此，F(xiàn)ABP4基因啟動子不含CpG島，其調(diào)控可能受到散在分布的GC靈活調(diào)控。FABP4基因啟動子可能是組織特異性表達(dá)的基因啟動子，CpG位點參與基因表達(dá)調(diào)控的因素之一。-2000/-1501片段的轉(zhuǎn)錄活性高于對照組。由此證明，F(xiàn)ABP4基因本身CpG位點相對集中區(qū)域也具有啟動基因表達(dá)的能力。-2000/-1片段轉(zhuǎn)錄活性高于-500/-1片段，可以推測CpG對FABP4基因啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控起一定促進(jìn)作用，參與FABP4基因表達(dá)調(diào)控。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4基因啟動子-1000/-500片段含有2個AML-1a結(jié)合區(qū)域（序列分別ACACAC和ACATAA）。AML-1a是一種具有與DNA結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)域，其缺乏相應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，導(dǎo)致靶基因不能正常轉(zhuǎn)錄的機(jī)制可能是：一方面，AML-1a與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域能夠和AMLlb/lc競爭結(jié)合靶基因DNA結(jié)合位點，從而抑制轉(zhuǎn)錄；另一方面，AML-1a通過改變基因CpG位點中胞嘧啶（C）甲基化修飾生成5-甲基胞嘧啶（5mC）調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，該過程在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中最早發(fā)生，隨后通過激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，這一調(diào)控主要集中在GC位點密集區(qū)[10]。實驗中FABP4基因啟動子-1000/-1片段的轉(zhuǎn)錄活性低于-500/-1片段，但熒光素酶活性與對照組比較無變化。由此推測FABP4基因-1000/-1片段啟動轉(zhuǎn)錄過程中可能有負(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子參與，或者有相關(guān)沉默子起關(guān)鍵作用。AML-1a是否是負(fù)責(zé)FABP4基因負(fù)調(diào)控主要的因子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄沉默子的有待進(jìn)一步研究。同時，包含豐富CpG-2000/-1501片段的-2000/-1片段活性與-1000/-1片段相比又進(jìn)一步增強(qiáng)，推測-2000/-1501片段對FABP4基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性有非常重要的作用。此外，對照載體pRL-TK所攜帶的啟動子是HSV1-tk基因自身啟動子，屬中等強(qiáng)度啟動子[11]。實驗中筆者發(fā)現(xiàn)FABP4基因啟動子的啟動活性均＜40%TK啟動活性，由此推測FABP4基因啟動子啟動基因表達(dá)能力較弱。使用不同濃度Hcy干預(yù)細(xì)胞后，100μmol/L Hcy組啟動活性最強(qiáng)。Hcy在體內(nèi)主要通過2種方式進(jìn)行代謝：當(dāng)?shù)鞍彼徇^量時，同型半胱氨酸通過轉(zhuǎn)硫化通路代謝，生成胱硫醚（維生素B6為輔助因子），繼而轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?；?dāng)?shù)鞍彼岷枯^低時，Hcy主要通過蛋氨酸循環(huán)途徑進(jìn)行代謝[12]。SAM協(xié)助調(diào)解的Hcy被再甲基化形成蛋氨酸需要甲基四氫葉酸和維生素B12作為輔助因子，而自然界真核細(xì)胞內(nèi)甲基化修飾反應(yīng)唯一甲基來源只有SAM[13]。由此推斷，當(dāng)Hcy濃度過高時，迅速消耗培養(yǎng)基中的葉酸和維生素B12，SAM產(chǎn)生減少，F(xiàn)ABP4啟動子CpG轉(zhuǎn)甲基減少，DNA發(fā)生去甲基化，使轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。給予葉酸和維生素B12干預(yù)后，啟動子活性約降低10%，說明補(bǔ)充一定量的葉酸和維生素B12后，SAM產(chǎn)生進(jìn)一步增多，轉(zhuǎn)甲基能力增強(qiáng)，DNA發(fā)生甲基化位點增多，使轉(zhuǎn)錄減低。

綜上所述，本實驗證實FABP4基因啟動子屬于弱啟動子，F(xiàn)ABP4基因核心啟動子由CAAT盒組成，部分CpG位點參與FABP4基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，AML-1a可能是調(diào)控FABP4基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子，而CpG位點與轉(zhuǎn)錄因子、沉默子的相互作用有待進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步研究FABP4基因的功能提供實驗基礎(chǔ)。